T細胞斑點實驗與結核桿菌DNA檢測對腸結核的診斷價值

趙純成,周 鋼,李遠洪,張 林

T細胞斑點實驗與結核桿菌DNA檢測對腸結核的診斷價值

趙純成,周 鋼,李遠洪,張 林

目的 探討結核桿菌T細胞斑點實驗(T-spot-TB)與結核桿菌DNA檢測在腸結核診斷中的應用價值。方法 對2009年6月～2013年4月我科行T-spot-TB與結核桿菌DNA檢測的可疑腸結核患者128例進行回顧性分析,其中確診腸結核72例,非腸結核56例。對比分析兩種方法診斷腸結核的靈敏度及特異度。結果 T-spot-TB診斷腸結核靈敏度為90.3%,特異性為91.1%；結核桿菌DNA檢測靈敏度為73.6%,特異性為100.0%。T-spot-TB診斷腸結核靈敏度高于DNA檢測,但其特異性低于DNA檢測；兩種方法檢測陽性率在不同病理表現的腸結核患者中無顯著差異。兩種方法同時檢測的陽性預測值及陰性預測值均為100%。結論 T-spot-TB與結核桿菌DNA聯合檢測有助于提高腸結核診斷的靈敏度和特異度。

腸結核；結核桿菌；T細胞；斑點實驗；DNA檢測；診斷

隨著結核感染在全球范圍內的死灰復燃,目前結核的發病率呈升高趨勢。腸結核是結核分枝桿菌侵犯腸黏膜引起的腸道特異性感染,部分腸結核與克羅恩病、潰瘍型結腸炎及其他非特異性腸道炎癥有相似的臨床特征,缺乏特異性表現,鑒別診斷非常困難[1-2]。結核T細胞斑點試驗(T-spot-TB)通過檢測結核感染后T細胞分泌的特異性γ-干擾素來診斷是否存在結核感染,對結核診斷的特異性和敏感性較高[3-4],有助于腸結核的診斷和鑒別診斷[5]。結核桿菌DNA檢測提高了結核診斷的特異性[6],有助于腸結核與克羅恩病的鑒別[7-8]。有關兩種方法應用于腸結核的診斷和鑒別診斷的對比分析,目前國內外報道少見。本研究對比分析了T-spot-TB與結核桿菌DNA檢測在診斷腸結核中的價值,為腸結核的診斷及鑒別診斷方法的選擇提供參考。

1 資料與方法

1.1 病例資料 對2009年6月～2013年4月我科行T-spot-TB與結核桿菌DNA檢測的可疑腸結核患者128例進行回顧性分析。其中男性86例,女性42例,年齡16～72(36.3±24.2)歲；最終確診腸結核72例,非腸結核56例(包括克羅恩病32例,腸淋巴瘤10例,結腸癌6例,潰瘍性結腸炎4例,腸息肉或腺瘤4例)。腸結核的最終診斷依據臨床表現、腸鏡下表現、病理學檢查發現干酪樣肉芽腫、抗酸染色陽性、抗結核實驗性治療有效等；克羅恩病及潰瘍性結腸炎診斷符合2008年中華醫學會制定的炎癥性腸病診斷標準[9]；腸淋巴瘤、腸息肉或腺瘤均由病理學檢查確診。

1.2 T-spot-TB檢測 采用英國Oxford Immunoter公司提供的試劑盒進行檢測,標本為抗凝外周靜脈血4 ml。首先采用密度梯度離心法分離、收集外周血單個核細胞,制備細胞懸液。T-spot檢測按照試劑盒操作說明書進行。設置陽性對照孔、陰性對照孔、A和B檢測孔,各孔均包被IFN-γ抗體,分別加入陽性對照物、陰性對照物、結核桿菌特異性抗原A和B。按照試劑盒說明書,每孔加入(2.0～3.0)×105個單個核細胞,37 ℃、5%CO2培養箱中孵育16～20 h。然后經洗脫后加入堿性磷酸酶標記的抗IFN-γ抗體,4 ℃孵育2 h,PBS洗脫,顯色,顯微鏡下計數斑點數。陽性判斷標準：若陰性對照組斑點數<6個,測試孔斑點數多于陰性孔6個以上為陽性；若陰性對照孔斑點數≥6個,測試孔斑點數為陰性對照孔2倍或2倍以上為陽性。

1.3 結核桿菌DNA檢測 采用聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測患者腸黏膜組織中結核桿菌DNA的表達。PCR試劑盒購自科華公司,儀器采用 Roche公司生產的LightCycler熒光定量分析儀。腸鏡下活檢鉗取可疑病變組織1塊,立即置于Eppendorf管中,加入DNA提取液50 μl,混勻后,100 ℃沸水浴10 min,10 000 r/min離心5 min,提取上清液進行DNA擴增。按照試劑盒操作說明書進行,設置陰性對照、陽性對照,按照文獻[8]引物序列、反應條件及循環參數進行PCR反應。擴增片段長度123 bp,擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析,如出現目標條帶則為陽性。

表1 128例患者T-spot-TB及結核桿菌DNA檢測情況[n(%)]

注：與對照組相比,①P<0.05

1.4 統計學方法 采用SPSS 12.0統計軟件分析,2×2列表計算檢測方法的靈敏度、特異度,統計檢測指標陽性率,進行χ2檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法檢測靈敏度和特異度 T-spot-TB檢測發現72例腸結核患者中,陽性65例,陰性7例,檢測腸結核靈敏度為90.3%,假陰性率為9.7%；56例非腸結核患者中,陽性5例,陰性51例,診斷腸結核特異性為91.1%,假陽性率為8.9%。結核桿菌DNA檢測發現72例腸結核患者中,陽性53例,陰性19例,靈敏度為73.6%,假陰性率為26.4%；非腸結核患者中,陽性0例,陰性56例,特異性為100.0%,假陽性率為0.0%。T-spot-TB診斷腸結核靈敏度高于DNA檢測,但其特異性低于DNA檢測。見表1。

2.2 兩種檢測方法對腸結核不同病理表現的檢測結果 72例腸結核患者中,肉芽腫(-)者28例,其中T-spot-TB陽性率為85.7%,DNA陽性率為71.4%。肉芽腫患者44例,其中發現干酪樣壞死11例,其余33例未見干酪樣壞死。11例干酪樣壞死患者中,T-spot-TB陽性率為100.0%,DNA陽性率為81.8%；33例干酪樣壞死陰性患者中,T-spot-TB陽性率為90.9%,DNA陽性率為72.7%。兩種方法檢測陽性率在不同病理表現的腸結核患者中無顯著差異。見表2。

表2 不同病理表現腸結核患者T-spot-TB及結核桿菌DNA檢測結果[n(%)]

2.3 兩種方法聯合檢測結果 兩種方法均陽性患者50例,最終均證實均為腸結核,陽性預測值為100%；兩種方法均陰性患者42例,均證實為非腸結核,陰性預測值為100%。兩種方法聯合檢測腸結核的敏感度為69.4%,特異性為100%。見表3。

表3 兩種方法聯合檢測結果(腸結核陽性例數)

3 討論

傳統的結核診斷方法包括結核菌素實驗、抗酸染色、結核桿菌培養等,存在靈敏度差、耗時長、特異性差等不足,尚不足以滿足臨床診斷的需要。近年來,T-spot-TB及結核桿菌DNA檢測技術的應用增加了腸結核診斷的靈敏度和特異度,史笑梅等[10]報道,T-spot-TB診斷腸結核的靈敏度為92.0%,特異度為92.3%。邱志兵等[11]報道,T-spot-TB檢測腸結核靈敏度為92.3%,特異度為77.5%。而結核菌素實驗診斷活動性腸結核靈敏度為53.85%,特異度為85%。雷少妮等[5]報道,T-spot-TB檢測腸結核的靈敏度和特異度分別為85.7%與93.3%。本組資料顯示,T-spot-TB檢測腸結核的靈敏度為90.3%,特異度為91.1%,與上述報道基本相符。

隨著PCR技術的不斷進展,結核桿菌DNA的檢測目前已廣泛應用于臨床結核的診斷。通過特異性體外擴增結核桿菌DNA片段達到診斷的目的,提高了診斷的靈敏度,較結核桿菌培養耗時明顯縮短。陳瑜君等[12]檢測結腸石蠟包埋標本中結核桿菌DNA診斷腸結核靈明度為32.0%,特異度為100.0%。顧清等[7]通過檢測石蠟包埋及新鮮腸黏膜標本中結核桿菌DNA的表達,結果發現其靈敏度為63.89%,特異度為83.33%。本組資料均為新鮮腸黏膜標本,結核桿菌DNA檢測靈敏度為73.6%,特異度為100%。本組靈敏度高于上述報道,可能是所取標本為新鮮腸黏膜組織,減少了DNA的降解,保證了檢測的靈敏度。

本研究還發現,兩種方法檢測在是否存在肉芽腫或是否檢出干酪樣壞死的患者中,陽性率并無顯著差異,可見這兩種檢測方法不受腸結核病理類型的影響。兩者相比,T-spot-TB的靈敏度高于DNA檢測,但其特異度低于DNA檢測。而兩者同時陽性的特異性為100%,陰性預測率為100%。

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Value of T-cell spot test and DNA detection of tuberculosis in diagnosing intestinal tuberculosis

Zhao Chuncheng,Zhou Gang,Li Yuanhong,Zhang Lin

Department of Gastroenterology,Central Hospital of Jiangjin District,Chongqing,402260,China

Objective To explore the value of T cell spot test(T-spot-TB)and detection of tuberculosis DNA in the diagnosis of intestinal tuberculosis.Methods A retrospective analysis was made to the clinical data of 128 suspected cases with intestinal tuberculosis undergoing T-cell spot test and DNA detection of tuberculosis in the period from June,2009 to April,2013,including 72 cases with intestinal tuberculosis of confirmed diagnosis and 56 cases with no intestinal tuberculosis;a contrast analysis was made to the sensitivity and specificity of the 2 methods in diagnosing intestinal tuberculosis.Results The sensitivity of T-cell spot test in diagnosing tuberculosis was 90.3% and the specificity was 91.1%,while the sensitivity of DNA detection of tuberculosis was 73.6% and the specificity was 100%;the sensitivity of T-cell spot test in diagnosing intestinal tuberculosis was higher than that of DNA detection,but its specificity was lower than that of DNA detection;the positive rates of the 2 methods were of no obvious difference in cases with intestinal tuberculosis of different pathological manifestation;the positive and negative predictive values of the 2 methods when performed simultaneously were 100%.Conclusions To perform T-cell spot test and DNA detection of tuberculosis at the same time can promote the sensitivity and specificity in diagnosing intestinal tuberculosis.

intestinal tuberculosis;mycobacteriumtuberculosis;T-cell;spot test;DNA detection;diagnosis

402260 重慶,重慶市江津區中心醫院消化內科

R 526

A

1004-0188(2014)09-0955-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.09.011

2014-06-19)