PTEN、p-Akt在肝癌組織中的表達及其與上皮間質轉化的關系

張 勇，湯小玉，李榮清，馮旭東，張燕華，王 麗

·論著·

PTEN、p-Akt在肝癌組織中的表達及其與上皮間質轉化的關系

張 勇，湯小玉，李榮清，馮旭東，張燕華，王 麗

目的 探討抑癌基因PTEN及其下游調控因子磷酸化Akt(p-Akt)在肝癌組織中的表達，并以上皮表型E-cadherin和間質表型Snail為標志，研究PTEN與上皮間質轉化(EMT)在肝癌惡性進展過程中的作用。方法 采用免疫組化EnVision法，檢測80例肝細胞肝癌組織中PTEN、p-Akt、E-cadherin及Snail的表達情況，分析PTEN與p-Akt、Snail及E-cadherin表達的相關性。結果 在肝癌組織中，PTEN、p-Akt、E-cadherin及Snail的表達率分別為46.25%、42.50%、67.50%及33.75%。PTEN、E-cadherin的表達率隨著病變的進展而降低；而p-Akt和Snail的表達模式與PTEN、E-cadherin相反，表達率隨著肝癌組織病變的進展而升高。Spearman相關分析顯示，PTEN 的表達與p-Akt、Snail的表達呈負相關(r值分別為-0.696、-0.291，P<0.05)，與E-cadherin的表達呈正相關(r=0.537，P<0.05)；Snail的表達與E-cadherin的表達呈負相關(r=-0.464，P<0.05)。結論 肝癌的惡性進展可能與PTEN表達缺失導致的PI3K/AKT通路持續活化，進而促進EMT的發生有關；以PTEN為靶點提高其在肝癌組織中的表達，有望成為拮抗EMT、抑制肝癌惡性進展的新途徑。

肝癌；PTEN；上皮間質轉化；表達

原發性肝細胞肝癌(hepatocelluar carcinoma，HCC)居我國癌癥發病率的第2位,腫瘤細胞發生上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transitions，EMT)是其復發和治療失敗的重要原因。EMT是指在某些特殊條件下，上皮細胞失去極性，轉變為具有活動能力的間質細胞的過程。EMT的過程涉及多個信號轉導通路[1]，在肝癌的發展過程中，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)可與癌基因C-met結合，激活PI3K-AKT信號途徑，促進EMT的發生[2]。抑癌基因PTEN是PI3K-AKT途徑中重要的負性調控子，在肝癌中存在廣泛的缺失或表達低下。盡管有研究表明，PTEN缺失可誘導部分腫瘤細胞發生EMT[3]，但在肝癌的研究中還未見相關報道。因此，本研究通過檢測PTEN及其在PI3K/AKT途徑中的下游調控因子磷酸化的Akt(p-Akt)在肝癌組織中的表達，并以上皮表型E-cadherin和EMT調控因子Snail為標志，分析肝癌發展過程中PTEN與EMT的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集筆者醫院病理科手術及穿刺活檢標本蠟塊共80例，所有標本均經臨床病理確診為肝細胞肝癌。其中，男性患者62例，女性18例，年齡27～78歲，平均51.37歲。肝癌的病理組織分級按照WHO分級標準分為：高分化(Ⅰ級)8 例，中分化(Ⅱ級)39例，低分化(Ⅲ級)28例，未分化(Ⅳ級)5例。肝癌惡性進展的臨床客觀指標根據CLIP評分標準[4]：0分6例，1分19例，2分27例，≥3分28例。將有血管侵犯、肝內衛星癌灶、淋巴結轉移以及遠處轉移HCC患者列為高侵襲組，反之列為低侵襲組[5]：80例中高侵襲組39例，低侵襲組41例。全部病例術前均未接受任何化療、放療或其他抗腫瘤治療。所有標本均用40 g/L甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm連續切片，分別做HE和免疫組化染色。兔抗人多克隆抗體PTEN、Snail、E-cadherin為Abcam公司產品，工作濃度分別為1∶100、1∶100、1∶30；兔抗人單克隆抗體p-Akt為Cell Signaling Technology公司產品，工作濃度為1∶50；EnVision染色試劑盒ChemMateTM為Dako公司產品。

1.2 方法 采用免疫組化EnVision法。染色步驟：將切片脫蠟水化，高壓抗原修復2 min，加一抗4 ℃過夜，PBS漂洗3×5 min；二抗37 ℃孵育60 min，PBS 漂洗3×5 min；常規DAB顯色液，顯微鏡下觀察信號并終止顯色，蘇木素復染，乙醇脫水、透明、中性樹膠封片。以已知陽性結果的陽性片為陽性對照，以已知陰性結果的陰性片為陰性對照，以PBS替代一抗的免疫組化染色結果為空白對照。

1.3 結果判斷 PTEN的陽性部位為細胞質，p-Akt的陽性部位為胞核和胞漿，E-cadherin的陽性部位為細胞膜和少許細胞質，Snail陽性信號位于胞核和胞漿。判斷陽性反應根據以下兩個方面[6]：(1)按切片中顯色癌細胞數比例計分：0分無癌細胞顯色；1分顯色癌細胞占癌細胞總數<25%；2分顯色細胞超過切片中癌細胞總數的25%，但<50%；3分顯色細胞超過切片中癌細胞總數的50%。(2)按切片中癌細胞顯色強度計分：0分細胞無顯色；1 分呈淺黃色(弱染色)；2 分呈棕黃色(中等染色)；3分呈棕褐色(強染色)。兩項相加>3分記為陽性，≤3分記為陰性。

1.4 統計學方法 數據采用SPSS 11.5軟件進行統計學處理，計數資料進行χ2檢驗，相關性分析采用Spearman法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTEN、p-Akt、Snail及E-cadherin在肝癌組織中的表達 PTEN的陽性部位位于細胞的胞質，陽性細胞呈巢狀或散在分布(圖1)，HCC中PTEN陽性表達率為46.25%(37/80)；p-Akt的陽性部位為胞核和胞漿(圖2)，在HCC中p-Akt的陽性表達率為42.50%(34/80)；Snail蛋白在HCC中以胞核和胞漿陽性為主(圖3)，陽性表達率為33.75%(27/80)；E-cadherin的陽性部位為細胞膜和少許細胞質(圖4)，陽性表達率為67.50%(54/80)。

圖1 PTEN在HCC中的表達(EnVision ×400)

圖2 p-Akt在HCC中的表達(EnVision ×400)

圖3 Snail在HCC中的表達(EnVision ×400)

圖4 E-cadherin在HCC中的表達(EnVision ×400)

2.2 PTEN、p-Akt、Snail及E-cadherin的表達與臨床病理特征的關系 PTEN、p-Akt、Snail及E-cadherin蛋白表達與臨床病理特征的關系見表1，可見PTEN蛋白的表達與病理分級、腫瘤直徑、CLIP評分、侵襲性及包膜情況相關(P<0.05或P<0.01)。p-Akt、E-cadherin的表達亦與病理分級、腫瘤直徑、CLIP評分、侵襲性及包膜情況相關(P<0.05或P<0.01)，其中p-Akt的表達率隨著病理組織級別、腫瘤直徑、CLIP評分及侵襲性的升高而表達率增高，而E-cadherin表達模式相反，隨著病理組織級別、腫瘤直徑、CLIP評分及侵襲性的升高而表達率降低，同時p-Akt在包膜不完整的腫瘤中的表達率高，而E-cadherin在包膜完整的腫瘤中的表達率高。Snail的表達與腫瘤直徑、CLIP評分、侵襲性及包膜情況相關(P<0.05或P<0.01)，但與腫瘤病理分級無關(P>0.05)。

2.3 PTEN與p-Akt、Snail及E-cadherin表達的相關性 經Spearman相關分析顯示，HCC組織中PTEN 的表達與p-Akt的表達呈負相關(r=-0.696，P<0.05)，與Snail的表達呈負相關(r=-0.291，P<0.05)，與E-cadherin的表達呈正相關(r=0.537，P<0.05)。而Snail的表達與E-cadherin的表達呈負相關(r=-0.464，P<0.05)。

表1 HCC組織中PTEN、p-Akt、Snail及E-cadherin的表達與臨床病理特征的關系

3 討論

抑癌基因PTEN是被發現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，在肝癌的研究中，已證實PTEN基因的表達缺失與HCC的發生發展密切相關[7]。本研究通過免疫組化檢測PTEN在原發性肝癌組織中的表達，結果發現PTEN在HCC中的陽性表達率為46.25%，其表達與病理分級、腫瘤直徑、CLIP評分、侵襲性及包膜情況均相關，表明PTEN的表達缺失與肝癌惡性進展、高侵襲性相關。PTEN是PI3K/AKT途徑最強的負性調控子，能拮抗PI3K/AKT信號系統，導致磷酸化Akt減少，阻斷AKT活化及其下游激酶的活性。本研究對PI3K/AKT途徑中的下游調控因子——磷酸化Akt(p-Akt)的檢測也證實了這一過程： HCC組織中PTEN 的表達與p-Akt的表達呈負相關，表明在HCC組織中PTEN的表達缺失使AKT的活化失去抑制作用，活化的AKT表達增加，使PI3K/AKT通路處于持續活化狀態，造成細胞增殖加快，促進腫瘤的惡性進展。

HCC的高侵襲、高轉移特性是患者生存期短、死亡率高的重要原因；在肝癌組織中，EMT也是其高侵襲、高轉移的重要機制之一。本研究通過檢測肝癌患者肝組織中上皮表型E-cadherin的表達和E-cadherin的抑制劑、轉錄因子Snail的表達，發現E-cadherin和Snail的異常表達與肝癌惡性進展、高侵襲性相關，表明肝癌的進展與其上皮細胞極性的喪失、間質特性的獲得相關。

研究表明，EMT 與多種信號通路的激活有關，其中PI3K-AKT是重要的發生途徑之一。在該通路中，活化的AKT可以通過激活E-cadherin的轉錄抑制因子Snail，進而抑制E-cadherin的轉錄，造成上皮表型的丟失和細胞間質化的發生[2]。本研究結果發現，PI3K-AKT通路中負性調控子PTEN的表達與肝癌組織中上皮表型E-cadherin的表達呈正相關，均隨著腫瘤惡性程度的增加而表達下降，而與間質標志物Snail的表達呈負相關，進一步證實PI3K-AKT途徑參與了肝癌EMT的發生過程，PTEN的表達缺失導致通路持續激活是重要的因素之一。

總之，本研究結果表明肝癌的惡性進展可能與抑癌基因PTEN的表達缺失有關，進而使PI3K/AKT途徑中AKT的活化失去抑制作用，造成該通路持續活化，促進了HCC惡性進展，同時由于PI3K/AKT途徑在EMT發生中的重要作用，PTEN的表達缺失導致的PI3K/AKT通路活化也是腫瘤發生EMT、促進腫瘤轉移、增強侵襲性的重要原因之一。因此，今后圍繞PTEN基因開展肝癌的基因治療，提高腫瘤組織中PTEN的表達，有望成為抑制肝癌惡性進展、提高患者生存率的新手段。

[1] 李余發,梁莉,丁彥青.上皮-間質轉化相關的信號傳導通路[J].國際腫瘤學雜志，2009，36(2)：83-85.

[2] Larue L,Bellacosa A.Epithelial-mesenchymal transition in develop-ment and cancer:role of phosphatidylinositol 3'kinase/AKT pathways[J].Oncogene,2005,24(50):7443-7454.

[3] Wang H,Quah SY,Dong JM.PRL-3 down-regulates PTEN expression and signals through PI3K to promote epithelial-mesenchymal transition[J].Cancer Res,2007,67(7):2922-2926.

[4] 趙文和,馬志敏,周杏仁,等.CLIP評分系統對評價手術切除肝癌預后的意義[J].中華外科雜志，2002，40(5):321-325.

[5] el-Assal ON,Yamanoi A,Soda Y,et al.Proposal of invasiveness score to predict recurrence and survival after curative hepatic resection for hepatocellular carcinoma[J].Surgery,1997,122(3):571-577.

[6] 滕菁,唐南洪,徐振興,等.HBx、Twist、E-cadherin及N-cadherin在肝細胞肝癌中的表達及意義[J].臨床肝膽病雜志,2009,25(6):431-434.

[7] Wang L,Wang WL,Zhang Y,et al.Epigenetic and genetic alterations of PTEN in hepatocellular carcinoma[J].Hepatol Res,2007,37(5):389-396.

Expression of PTEN and p-Akt in Hepatocelluar Carcinoma and Their Relationship with Epithelial-mesenchymal Transitions

Zhang Yong1,Tang Xiaoyu1,Li Rongqing1,Feng Xudong1,Zhang Yanhua1,Wang Li2

1.Department of Radiation Oncology,the First Affiliated Hospital to Kunming Medical University,Kunming,Yunnan,650032,China,2.Department of Pathology,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To investigate the expression of PTEN and p-Akt in hepatocelluar carcinoma(HCC)and the correlation between PTEN and epithelial-mesenchymal transition(EMT)in HCC malignant progression.Methods Immunohistochemical Envision method was applied in detecting the expressions of PTEN,pAkt,E-cadherin and Snail in 80 cases with HCC and the correlation among them was analyzed.Results The positive expression rate of PTEN,pAkt,E-cadherin and Snail in HCC was 46.25%(37/80),42.50%(34/80),67.50%(54/80)and 33.75%(27/80),respectively.The expression rates of PTEN and E-cadherin decreased in HCC malignant progression while the expression rates of pAkt and Snail increased;related analysis by Spearman pointed out that there existed a negative correlation between the expression of PTEN and those of pAkt and Snail(r=-0.696 and -0.291，P<0.05),while a positive correlation between the expression of PTEN and that of E-cadherin(r=0.537，P<0.05);there existed a negative correlation between the expression of Snail and that of E-cadherin(r=-0.464，P<0.05).Conclusions The defective expression of PTEN leads to a continuous activation of PI3K/AKT pathway that further promotes the occurrence of EMT,which may be of relationship with HCC malignant progression;to increase the expression of PTEN may be a hopeful new approach in antagonizing EMT and inhibiting the malignant procession of HCC.

hepatocelluar carcinoma(HCC);PTEN;epithelial-mesenchymal transition(EMT);expression

國家自然科學基金項目(81201759)；云南省應用基礎研究項目(2012FB210)

650032 昆明，昆明醫科大學第一附屬醫院腫瘤放療科(張 勇，湯小玉，李榮清，馮旭東，張燕華)；成都軍區昆明總醫院病理科(王 麗)

王 麗，電話:0811-774212；E-mail:2001wl@163.com

R 735.7

A

1004-0188(2014)04-0349-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.04.001

2014-03-02)