三羥異黃酮對HER2/neu高表達人乳腺癌細胞輻射敏感性的影響

李 明，周 永，譚宗才，徐 敏，鄭鈞豐，常 蕾，張 林，屈 琳，糜漫天

三羥異黃酮對HER2/neu高表達人乳腺癌細胞輻射敏感性的影響

李 明，周 永，譚宗才，徐 敏，鄭鈞豐，常 蕾，張 林，屈 琳，糜漫天

目的 探討三羥異黃酮對人乳腺癌細胞株MDA-MB-453(ER-,HER2-high)、MCF-7/HER2(ER+,HER2-high)和MCF-7(ER+,HER2-low)輻射敏感性的影響，并觀察三羥異黃酮對HER2/neu高表達人乳腺癌細胞輻射敏感性的作用。方法 通過基因轉染技術建立HER2/neu高表達的人乳腺癌MCF-7細胞，免疫熒光細胞化學法鑒定；經100 mol/L三羥異黃酮聯合或單獨10 Gy γ射線處理MDA-MB-453、MCF-7/HER2和MCF-7三種乳腺癌細胞24 h后，采用流式細胞儀檢測三羥異黃酮對乳腺癌細胞輻射敏感性的影響。結果 與對照組相比，MDA-MB-453、MCF-7/HER2細胞的射線組凋亡率無顯著差異(P>0.05)，三羥異黃酮聯合射線組的凋亡率，與射線組和對照組相比，分別增加25.51%(P<0.05)、56.16%(P<0.05)；MCF-7細胞射線組凋亡率比對照組增加4.62%(P<0.05)，而三羥異黃酮聯合射線組與射線組比較沒有顯著差異(P>0.05)。結論 HER2/neu高表達的乳腺癌細胞對射線誘導的凋亡有抵抗作用，但三羥異黃酮可增強γ射線誘導HER2/neu高表達乳腺癌細胞MDA-MB-453細胞、MCF-7/HER2細胞的凋亡作用。

三羥異黃酮；人乳腺癌細胞；輻射敏感性；MCF-7/HER2;MDA-MB-453

乳腺癌是女性的常見惡性腫瘤。近20年來，我國乳腺癌的發病率明顯上升，成為危害女性健康的主要疾病之一。放射治療是乳腺癌治療中的一項重要手段，提高放療效果在臨床上非常必要[1]。在乳腺癌患者中，25%～30%的患者HER2/neu受體高表達。HER2/neu由原癌基因erbB-2/neu表達，為表皮生長因子受體家族成員，具有絡氨酸激酶(PTK)活性。研究發現HER2/neu高表達乳腺癌惡性程度高，腫瘤生長速度快，易轉移，對射線和化療藥物不敏感，治療預后差且易復發[2]。臨床研究發現[3]，HER2/neu過度表達的乳腺癌對放療的敏感性低于HER2/neu低表達的乳腺癌，血清中HER2/neu胞外區蛋白水平升高與乳腺癌對放療的療效降低密切相關，提示HER2/neu表達水平與乳腺癌細胞輻射抵抗有密切關系。三羥異黃酮是一種重要的天然植物雌激素，對人體無明顯毒副作用，其結構與雌二醇非常相似，具有模擬和拮抗雌激素、抑制PTK活性等重要藥理作用[4-7]。本實驗選擇兩種人乳腺癌細胞株MDA-MB-453(ER-,HER2-high)和MCF-7(ER+,HER2-low)，并通過基因轉染技術建立HER2/neu高表達的乳腺癌MCF-7細胞(MCF-7/HER2,ER+,HER2-high)，檢測三羥異黃酮對不同乳腺癌細胞株體外輻射敏感性的影響，觀察三羥異黃酮對HER2/neu高表達人乳腺癌細胞輻射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM/F12為HyClone公司產品；RPMI1640、胰蛋白酶為Gibco產品；新生胎牛血清購自天津TBD公司；Genistein、MTT、曲拉通(Triton-X 100)為Sigma產品；質粒抽提試劑盒購自Promega公司；各種限制性內切酶、T4DNA 連接酶、購自TaKaRa公司；Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；鼠抗人HER2/neu單克隆抗體購自Zytmed公司；山羊抗小鼠IgG購自北京中杉公司。

1.2 質粒 含人HER2/neu基因的質粒pCMV/ERBB2由美國Anderson癌癥研究中心的Ming Tan教授惠贈；含新霉素抗性基因的質粒pCIneo由第三軍醫大學熊政碩士惠贈。

1.3 細胞株及感受態細菌 MCF-7細胞、MDA-MB-453均購自中科院上海細胞庫。pCMV/ERBB2質粒擴增、酶切鑒定并測試濃度后與pCIneo質粒共轉染MCF-7乳腺癌細胞，400 μg/ml G418篩選MCF-7細胞，建立穩定高表達HER2/neu的乳腺癌細胞(MCF-7/HER2)。DH5α感受態細菌由第三軍醫大學醫學檢驗系臨床生化教研室張竹君碩士惠贈。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養 MCF-7和MCF-7/HER2細胞株均用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度條件下常規傳代培養，MCF-7/HER2培養基中加入100 μg/ml G418篩選細胞；MDA-MB-453細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，在37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度條件下常規傳代培養。

1.4.2 質粒轉化與擴增 按文獻[8]的方法，將pCIneo質粒和含人HER2/neu基因的pCMV/ERBB2質粒分別轉化感受態細菌DH5α。按照Promega質粒抽提試劑盒說明書，分別對上述二質粒進行提取、純化，并測定濃度，-20 ℃保存備用。

1.4.3 質粒轉染 含人HER2/neu 基因的質粒pCMV/ERBB2 經擴增、酶切鑒定和濃度測定后，與pCIneo質粒共轉染MCF-7 乳腺癌細胞，按照脂質體轉染試劑盒說明書進行，然后在倒置熒光顯微鏡下初步觀察轉染是否成功。而后以400 μg/ml G418 初篩MCF-7細胞，對照組細胞完全死亡后，以100 μg/ml G418 維持篩選，傳代并凍存備用，免疫熒光細胞化學法檢測轉染是否成功。

2 結果

2.1 pCMV/ERBB2質粒酶切鑒定 pCMV/ERBB2質粒以ColE1為母本質粒，在其中插入CMV強啟動子和人erbB-2/neu cDNA基因構建而成。根據pCMV/ERBB2質粒圖譜(圖1)，該質粒全長9130 bp，含有多個限制性內切酶位點，其中包括2個Hind Ⅲ和1個XhoⅠ內切酶的酶切位點，用限制性內切酶XhoⅠ和Hind Ⅲ酶切pCMV/ERBB2質粒后，電泳所得3個DNA片段為4479 bp(含erbB-2/neu片段)、3593 bp(含CMV啟動子)和1026 bp，符合理論計算值(圖1)。

圖2 免疫熒光細胞化學法鑒定HER2轉染前后的MCF-7細胞(×600)

A：對照；B：pCIneo質粒轉染MCF-7細胞(白色箭頭所示為pCIneo蛋白)；C：pCIneo和PCMV/ERBB2質粒共轉染MCF-7細胞(白色箭頭所示為pCIneo蛋白，灰色箭頭所示為HER2蛋白)

圖1 pCMV/ERBB2和pCIneo質粒鑒定

M：Marker；1和3：pCMV/ERBB2質粒酶切片段；2和4：pCMV/ERBB2質粒；5：pCIneo質粒

2.2 免疫熒光細胞化學法鑒定pCIneo和PCMV/ERBB2共轉染的MCF-7細胞 PCMV/ERBB2質粒擴增、酶切鑒定并測試濃度后，與含新霉素抗性基因的空載體pCIneo質粒(帶有綠色熒光信號)共轉染MCF-7乳腺癌細胞，免疫熒光細胞化學法鑒定。如圖2所示，PCMV/ERBB2質粒和含新霉素抗性基因質粒共轉染的MCF-7細胞，在細胞膜和細胞質分別可見紅色和綠色熒光，而只轉染含新霉素抗性基因質粒的MCF-7細胞于細胞膜和細胞質可見綠色熒光，而未轉染任何質粒的MCF-7細胞則無任何熒光信號。結果表明，在PCMV/ERBB2轉染后的MCF-7細胞，HER2/neu高表達，主要分布于細胞膜和細胞質；而在單獨轉染含新霉素抗性基因質粒的MCF-7細胞和未轉染任何質粒的MCF-7細胞，HER2/neu不表達，提示成功地將PCMV/ERBB2質粒和pCIneo質粒共轉入了MCF-7細胞。

2.3 三羥異黃酮聯合γ射線對MCF-7、MCF-7/HER2、MDA-MB-453乳腺癌細胞凋亡的影響 經100 mol/L三羥異黃酮聯合或單獨10 Gy γ射線處理MDA-MB-453、MCF-7/HER2、MCF-7三種乳腺癌細胞24 h后，流式細胞儀分析發現MDA-MB-453、MCF-7/HER2細胞的射線組凋亡率，與對照組相比無明顯差異(P>0.05)，而三羥異黃酮聯合射線組的凋亡率分別增加25.51%(P<0.05)、56.16%(P<0.05)；MCF-7細胞射線組凋亡率，與對照組相比增加4.62%(P<0.05)，而三羥異黃酮聯合射線組與射線組比較無明顯差異(P>0.05)，提示HER2高表達的乳腺癌細胞對射線誘導的凋亡有抵抗作用，但三羥異黃酮可增強γ射線誘導HER2高表達乳腺癌細胞的凋亡作用。見表1。

表1 不同條件處理24 h后細胞凋亡率的變化(n=3,%)

注：與對照組比較，①P<0.05；與γ射線組比較，②P<0.01

3 討論

乳腺癌的綜合治療中，放射治療與手術治療一樣屬于局部治療，占有十分重要的地位。但多種因素會影響放療的效果，如腫瘤組織的低氧狀態、腫瘤本身的放射敏感性以及腫瘤細胞對放射線的抵抗等。放射線入射生物體后，直接損傷大分子DNA，或通過其產生的自由基的間接作用，導致DNA損傷或細胞死亡等生物效應。這種應用放射治療腫瘤的方法，就是放射治療(放療)。放療誘導腫瘤細胞凋亡是其發揮抗癌作用的重要機制之一，但由于個體之間或腫瘤細胞本身對射線的反應存在很大差異，即存在細胞內在放射敏感性(intrinsic radiosensitivity)差異，往往導致療效不佳。因此如何提高腫瘤細胞的放射敏感性一直是腫瘤放射領域中備受關注的問題。已有為數不多的放射增敏劑應用于臨床或正在進行臨床試驗。放射增敏劑是化學修飾的一種。所謂化學修飾是指在癌癥的治療中，主要通過其對腫瘤及正常組織的放射及/或藥物的修飾效應，而不是其細胞毒作用起效的一類藥物[9]。三羥異黃酮又名染料木素或金雀異黃酮，為大豆異黃酮主要成分之一，是一種重要的天然植物雌激素，具有雌二醇母核機構，對人體無明顯毒副作用。體內體外實驗研究發現[10-12]，三羥異黃酮可通過調節與細胞周期和凋亡相關基因來抑制多種癌細胞的生長，三羥異黃酮通過抑制NF-κB和Akt活性，導致癌細胞生長和凋亡的抑制。在乳腺癌患者中，25%～30%的患者HER2/neu受體高表達。HER2/neu受體為表皮生長因子受體家族成員，具有PTK活性。HER2/neu高表達乳腺癌惡性程度高，腫瘤生長速度快，易轉移，對射線和化療藥物的不敏感，治療預后差且易復發。有研究發現[10]，三羥異黃酮作為一種TPK抑制劑，能夠通過抑制射線誘導激活的AKT細胞生長信號通路來促進食管癌細胞的輻射敏感性。本實驗以MDA-MB-453、 MCF-7、MCF-7/HER2乳腺癌細胞為研究對象，經100 mol/L三羥異黃酮聯合或單獨10 Gy γ射線處理MDA-MB-453、MCF-7/HER2、MCF-7三種乳腺癌細胞24 h后，流式細胞儀分析發現HER2/neu高表達乳腺癌細胞MDA-MB-453、MCF-7/HER2的射線組凋亡率，與對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)，而三羥異黃酮聯合射線組的凋亡率分別增加25.51%(P<0.05)、56.16%(P<0.05)；HER2/neu低表達或不表達的乳腺癌細胞MCF-7射線組凋亡率，與對照組相比增加4.62%(P<0.05)，而三羥異黃酮聯合射線組與射線組比較沒有顯著差異(P>0.05)；該結果提示HER2高表達的乳腺癌細胞對射線誘導的凋亡產生抵抗作用，而三羥異黃酮能有效地增強HER2高表達乳腺癌細胞的輻射敏感性。我們推測三羥異黃酮增強HER2/neu高表達乳腺癌細胞的輻射敏感性與其抑制HER2/neu的TPK活性有關。

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Effect of Genistein on Radiosensitivity of Breast Cancer Cells with High Expression of HER2/neu

Li Ming1,Zhou Yong2,Tan Zongcai3,Xu Min1,Zheng Junfen1,Chang Lei1,Zhang Lin1,Qu Lin1,Mi Mantian2

1.Center for Disease Control and Prevention of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610021,China;2.Staff Room of Nutrition and Food Hygiene,College of Military Preventive Medicine,the Third Military Medical University,Chongqing,400037,China;3.The Second Regiment,Comprehensive Training Base of Guangzhou Military Command,Zhuzhou,Guangzhou,412005,China

Objective To investigate the effects of genistein on the radiosensitivity of human breast cancer cell strains with expression of MDA-MB-453(ER-,HER2-high),MCF-7(ER+,HER2-high),and MCF-7/HER2(ER+,HER2-low),and to observe the effects of genistein on the radiosensitivity of HER2/neu highly expressed human breast cancer cells.Methods Highly expressed HER2/neu human breast cancer cell MCF-7 was constructed through cell transfection technology and was identified by immunofluorescence cytochemical technology.After the three kinds of breast cancer cells i.e.MDA-MB-453,MCF-7/HER2,and MCF-7 were treated by 100 μmol/L genistein combined with or simply use of 10 Gy γ ray,flow cytometry was used to analyze the effects of genistein on the radiosensitivity of the breast cancer cells.Results There was no significant difference between the apoptotic rates of MCF-7/HER2 and MDA-MB-453 cells treated by γ ray compared with those of the control group(P>0.05).The apoptotic rates of those cells treated by genistein combined with γ ray increased by 25.51%(P<0.05)and 56.16%(P<0.05),respectively,compared with those of the cells treated only by γ ray and the control group.The apoptotic rate of MCF-7 cells treated by γ ray increased by 4.62%(P<0.05)compared with that of the control group(P<0.05),but there was no significant difference between the apoptotic rates of the cells in the γ ray and the control group(P>0.05).Conclusions HER2/neu highly expressed breast cancer cells have resistant effect on the apoptosis induced by γ ray,but genistein can increase the apoptotic effect of HER2/neu highly expressed human breast cancer cells induced by γ ray.

genistein;tumor;γ ray; MDA-MB-453; radiosensitivity;MCF-7 HER2

重慶市自然科學基金(CSTC 2006 BB 5103)

610021 成都，成都軍區疾病預防控制中心(李 明，徐 敏，鄭鈞豐，常 蕾，張 林，屈 琳)；第三軍醫大學軍事預防醫學院營養與食品衛生學教研室(周 永，糜漫天)；廣州軍區綜合訓練基地二大隊(譚宗才)

糜漫天，電話：023-687752292

R 737.9

A

1004-0188(2014)04-0358-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.04.004

2014-01-28)