肺部給藥用高分子多孔微球的制備及改性研究進展

朱利會 ，陳愛政 ，2，王士斌 ，2

（1華僑大學化工學院，福建 廈門 361021；2華僑大學生物材料與組織工程研究所，福建 廈門 361021）

肺部給藥是一種將藥物通過吸入傳遞到肺部，來治療肺部疾病或者實現全身治療的給藥途徑。與經注射、口服給藥等相比，肺部給藥具有以下優點[1-2]：①吸收表面積大（100 m2）；②毛細血管豐富、血流量大；③上皮細胞層薄（0.1～0.2μm）、物質交換距離短、藥物吸收屏障小，速度快；④生物代謝酶活性低，無肝臟首過效應；⑤患者適應性好。因此，肺部給藥是一種極具發展潛力的給藥途徑，特別是對于一些生物利用度低的大分子藥物的傳遞。肺部給藥制劑包括：噴霧劑、定量吸入氣霧劑（MDI）和干粉霧劑（DPI）。噴霧劑的噴射霧化過程是連續的，而人的吸氣呼氣是交替進行的，易造成藥物浪費；MDI則由于拋射劑的選擇限制了其應用；DPI依靠患者主動吸入，安全無刺激，但藥物的微細化關系到藥物能否實現有效的肺部沉積。

隨著制劑技術的發展，又出現了脂質體、納米顆粒、實心微球、多孔微球等肺部給藥新劑型。脂質體與肺表面活性物質親和性好，但脂質體不穩定，會誘導氧自由基產生肺部毒性。納米顆粒吸入后往往被呼出體外或被肺泡吞噬細胞吞噬，通常以下列方式進行可吸入給藥[3-5]：①分散在不規則載體上；②形成“Trojan”顆粒；③鑲嵌在實心微球中，但仍然只有少部分到達肺。實心微球空氣動力學性能差，吸入后易滯留在肺的淺層組織。多孔微球作為新型的藥物載體，具有適合肺部給藥的優勢[6-7]：①比表面積大，密度低；②多孔結構利于藥物的吸附，提高載藥量和包封率，通過調整多孔結構可調控包載藥物的釋放速度；③粉末性能好，尤其是幾何粒徑（Dg）介于10～30μm之間，空氣動力學粒徑（Da）介于 1～5μm 之間，ρ<0.4g/cm3的多孔微球既能實現肺部深層靶向，又能避免被吞噬細胞吞噬。另外，微球高分子材料的選擇也是藥物制劑的關鍵，常見的有殼聚糖、聚乙內酯（PCL）、聚L-乳酸（PLLA）、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）等[8-11]，其生物相容性好，易加工改性。為保證肺部給藥的有效性，微球的制備尤為重要，因此，本文將以肺部給藥用高分子多孔微球為核心，重點從多孔微球的制備和改性兩大方面展開綜述。

1 肺部給藥載體多孔微球的制備方法

1.1 乳化法

制備多孔微球最傳統的方法是雙重乳化（W/O/W）-溶劑揮發法，孔洞的形成與有機溶劑的揮發及內水相的去除有密切關系，溶劑的種類、揮發速度、內水相去除的速度等均會影響微球的形貌和孔隙率。改良的 W/O/W 法避免了上述諸多因素的影響，在傳統方法的基礎上加入致孔劑來形成微球內部及表面的多孔結構。按成孔機制，致孔劑包括滲透性致孔劑、泡騰致孔劑、可抽提的致孔劑（如圖1）。

1.1.1 滲透性致孔劑

滲透性致孔劑在乳滴內水相形成高滲透壓，吸引水從外水相進入內水相，成球后內水相的水分經冷凍干燥移除，微球即呈多孔。常見的滲透性致孔劑有β-丙羥基環糊精（HP-β-CD）、牛血清蛋白（BSA）、聚乙烯亞胺（PEI）等。其中HP-β-CD不僅可以有效地致孔，而且對藥物的吸附有一定的促進作用，提高藥物穩定性，調節藥物從微球的釋放，實現藥物的緩控釋。利用HP-β-CD作為致孔劑制備的多孔微球，空氣動力學性能（MMAD≈3μm）良好，滿足肺部給藥要求，特別適合包載蛋白質、多肽類藥物[12-13]。

Lee等[14]用W/O/W法，以BSA為致孔劑制備了PLGA多孔微球，分別調節BSA和PLGA的濃度，可以獨立操控多孔微球的粒徑和孔徑，二者不存在依賴性；BSA的使用降低了藥物分子胰島素和血管內皮生長因子的突釋，尤其后者的緩釋時間長達兩周，體現了肺部藥物傳遞系統的優勢。Gupta等[15]以PEI為致孔劑制備的PLGA多孔微球，孔隙率隨PEI質量分數的增長而增長。

圖1 3種微球成孔機制

此方法操作簡便易行，微球成形性好，粒徑分布比較均勻，但是大多數情況下，由于其致孔過程依賴內水相的去除，容易造成藥物分子尤其是水溶性藥物的流失，最終導致多孔微球載藥量降低，無法達到理想的藥效，所以此方法在提高載藥量方面的改進還有待進一步的研究與優化。

1.1.2 泡騰致孔劑

泡騰致孔劑致孔原理是在內水相中加入碳酸氫銨（ammonium bicarbonate，AB）、過氧化氫（H2O2）等物質，它們在一定條件下可以分解產生NH3、CO2或O2等氣體，氣體從乳滴（成球前）或微球（成球后）內逃逸，從而在微球內部及表面形成多孔結構。

Bae等[16]以 H2O2為致孔劑，采用 W1/O/W2法制備了PLGA多孔微球，其中H2O2含量越高，孔徑越大，孔隙率越高；但該致孔過程依賴 H2O2的酶解反應，酶活性的保持限制了其應用。Yang等[1]以AB為致孔劑制備的PLGA多孔微球的Dg是10～20μm，Da是 4.0μm，FPF（粒徑≤4.7μm 的微球百分數）是32.0%；該致孔過程是由AB分解發泡引起的，不存在溶質的擴散作用，因此不會引起藥物的流失，而且發泡過程導致聚合物相的氣壓降低，加速了微球的固化，反而有利于提高包藥物的封率；載藥后微球的各項性能仍然非常符合肺部給藥要求（Dg介于 10～30μm 之間，Da介于 1～5μm 之間）。

目前，此方法是采用最廣泛的微球致孔方法，其中以AB致孔效果最佳，隨著內水相中AB的量的逐漸增加，微球的孔隙率，孔徑也在逐漸增加[17-19]。泡騰致孔劑在一定條件下分解產生氣體，可加速微球的固化速率，從而提高了藥物的包封率，但是如何形成開放式及更均一的多孔結構，實現微球粒徑和孔徑的分別可控，以達到最佳的肺部靶向效果還有待進一步的研究。

1.1.3 可抽提的致孔劑

根據相似相溶原理，實心微球包埋的油、脂類物質被其可溶的溶劑抽提出來，即可得到多孔微球。Ahmed等[20]用W/O/W法，將甘油單油酸酯包埋在聚合物相，然后由己烷進行抽提致孔，得到的微球表面不規整，球形度相對較差，這是因為有機溶劑揮發較快，乳化時外部水相的水擴散到初始液滴，液滴內部膨脹，球形度變差。Arnold等[21]分別以菜籽油、硅油為致孔劑，最后用庚烷來進行抽提致孔，得到的多孔微球都有良好的空氣動力學性質，呈現了良好的肺部靶向效果。

另外，除了油脂類物質被有機溶劑抽提，還有油酸鈉等強親水性物質被外部水相抽提致孔，其水溶性強，在乳化成球過程中迅速外流到外水相而形成孔道。Sun等[22]選用油酸鈉為致孔劑，因其具有較高的親水/親油平衡值（HLB=18），很容易快速從聚合物相流到外部水相，形成三維網絡孔道，并且孔徑的變化依賴粒徑的變化。

該方法涉及有機溶劑的萃取加速相分離過程，存在一定的有機殘留問題，或者由于抽提的時間掌握不好均會影響多孔微球的形貌和空氣動力學性能，所以具體的優化研究還有待進一步探索。以上3種改良的 W/O/W 法制備多孔微球操作均相對簡單，結果各有特點，如果能夠把各種方法的優勢相互結合，有望制備出粒徑更加均一的多孔微球。

1.2 相分離法

一個多組分均相體系，在一定的理化條件下從穩態轉化為非穩態，體系由均相分離成多相，這就是相分離。該方法最初是用于多孔膜的制備，隨后，也在乳化的基礎上用于制備多孔微球。Dai等[23]采用非溶劑/溶劑誘導的相分離法制備了表面具有酒窩狀結構的“高爾夫球”狀微球，其空氣動力學性能較差，不適合肺部給藥。Kim等[24]在乳化的基礎上，將Pluronic F127溶液加入到聚合物溶液中，溶劑的揮發使Pluronic F127相與聚合物相發生分離，然后洗去Pluronic F127，即得到多孔微球，該方法制備微球簡單易操作，條件溫和，但是一部分結晶性高分子材料在一定條件下沒有適當的溶劑，所以該方法也有一定的局限性。

1.3 靜電噴射技術

靜電噴射法制備微球是指在高壓條件下，噴射裝置與接收裝置之間形成電場，帶電的噴射液克服自身表面張力的變化劈裂為小的液滴，滴落到接收裝置固化成球。該方法制備微球簡單高效，制得的微球表面光滑，粒徑分布范圍窄，因帶相同電荷的微球之間相互排斥，微球分散性較好，微球的形貌及粒徑可通過調整工藝參數實現可控[25-28]。

圖2 高壓靜電抗溶劑法制得的PLLA多孔微球掃描電鏡照片[31]

Zhang等[29]采用靜電噴射法制備的多孔微球粒徑分布為3～20μm，但微球內部孔洞貫通性較差，表面多孔開放性較差，不適合肺部給藥。本文作者課題組[30-31]采用高壓靜電抗溶劑法制備了甲氨蝶呤（MTX）-PLLA微球，微球球形度、分散性均較好；隨后，在此基礎上加入致孔劑成功制備了多孔微球，結果表明，多孔微球的Dg為25μm，Da為3.1μm（如圖2），符合肺部給藥用載體的空氣動力學性質要求（Dg介于 10～30μm之間，Da介于 1～5μm之間）；載藥后多孔微球的空氣動力學性能沒有明顯變化，仍適合肺部給藥。目前，采用該技術制備多孔微球的研究相對較少，工藝的優化及如何形成更加均一的多孔結構是制備的關鍵。

1.4 超臨界流體技術

超臨界流體指的是處于臨界點以上溫度和壓力下的流體，其密度接近液體，黏度接近氣體，是很好的溶劑。Koushik等[32]]利用該技術使超臨界-二氧化碳（SC-CO2）包埋于聚合物中，然后降壓使CO2逸出制備了多孔微球，但此方法依賴CO2的溶脹作用致孔，得到的微球孔隙率太低，空氣動力學性能較差，可能不適合肺部給藥。作者課題組[33-36]根據近幾年國內外利用該技術制備多孔微球的進展，總結了該技術制備多孔微球的幾種不同的機理，總結了應用CO2抗溶劑原理造粒技術的研究進展，并采用CO2抗溶劑法首次成功制備了高孔隙率的可吸入PLLA多孔微球（如圖3），致孔劑的加入增加了微球的孔隙率，得到的多孔微球Dg為 10～25μm，ρ<0.4g/cm3；載溶菌酶（LSZ）多孔微球的Da<4.7μm，Dg>10μm，均滿足肺部給藥要求，并且LSZ在超臨界過程中沒有發生結構改變，依然保持活性。結果表明，超臨界二氧化碳流體技術在肺部給藥用高分子多孔微球的制備方面具有較明顯的優勢，有望得到進一步的發展。

2 肺部給藥載體多孔微球的改性方法

2.1 共混改性

共混改性包括物理共混和化學共混，其中物理共混是指在聚合物基質中混入黏性添加劑，與聚合物基質均勻混合共同固化成球，從而改性多孔微球的振實密度以及空氣動力學性質，還可防止載藥過程中藥物的泄露，提高多孔微球的載藥量和包封率，調節藥物的釋放速率。

Yoo等[37]采用W/O/W法在制備多孔微球的過程中混入淀粉，結果表明，改性后多孔微球仍適合肺部給藥，而藥物的釋放由無淀粉的 2h延長到 5天，肺部沉積時間達20天。Kwon等[12]則在微球中共混二乙酰蔗糖六異丁酸酯，藥物可達長效釋放。化學共混是指在物理共混的基礎上，應用靜電絡合原理，使藥物和微球基質靜電絡合在一起，提高微球的載藥量和包封率，最終調節藥物的釋放速率。Lee等分別用帶負電荷的透明質酸[13]和軟骨素硫酸鹽[38]為黏性添加劑改性多孔微球，吸附帶正電的LSZ，結果表明多孔微球仍可到達肺深層上皮細胞；而且藥物緩釋效果顯著，表現為零級釋藥動力學特征。

2.2 共聚改性

圖3 CO2抗溶劑法制得的PLLA多孔微球的掃描電鏡照片及放大后的表面形貌[35]

單聚物的生物降解行為或物理化學性質往往不理想，故將其單體與其他的聚合物單體共價聚合，從而提高聚合物的特定性能，使其生物降解性和生物相容性更好。如PLGA即PLLA與PGA共聚而成，其性能變化和組成不是簡單的線性關系，若組成各為50%的共聚物分子，各種性能出現轉折，相比均聚物而言，降解速度最快，可溶于一般的有機溶劑，所以調節二者比例可以制備出不同的藥物載體[38]。

Patel等[40]在多孔微球包載的藥物模型是小分子量肝素，因其高度溶于水，故用親水片段聚乙烯醇（PEG）來聚合改性疏水的 PLGA，結果表明，由于在溶劑揮發過程中二者在油水界面的分布不同，共聚物制備的微球表面呈海綿狀多孔，PEG-PLGA微球孔洞效果較好，藥物包封率和載藥量較高，緩釋效果明顯，無突釋現象。Baimark等[41]制備了甲基 PEG-PCL-PLA（PLA是聚乳酸）多孔微球，微球呈開放式多孔，內部孔道相互貫通，空氣動力學性質較好，符合肺部給藥要求。

2.3 分子修飾改性

作為“多孔微球藥物載體的改性”的衍生技術，此方法是對藥物分子進行適當的物理處理或化學修飾，使改性后的藥物分子和聚合物基質親和性更強，以提高微球的載藥量和包封率。Lee等[42]采用S/W/O/W法，先將藥物蛋白進行冷凍干燥，然后乳化制備載藥微球，結果表明蛋白質的生物活性穩定而且可以從微球中長效釋放。

化學修飾是綜合化學合成與載體制備的一種前沿性技術，如圖4所示，Kim等[24]將唾液素-4（Ex4）共價結合棕櫚酰基基團（C16），通過吸附法載入多孔PLGA微球，載藥量有所提高，這是因為C16較強的疏水作用易使 Ex4-C16吸附在微球的內部及表面；Ex4-C16比未修飾的Ex-4表現出更持久的的降血糖效果，分析原因有：①疏水作用加強了緩釋；②血液白蛋白可與 C16非共價結合，保證了較高的血藥濃度。隨后，該課題組在此基礎上又進行了改進，首先制備了載有白蛋白的多孔微球，然后再載入 Ex4-C16，藥物緩釋時間由之前的 5天延長到 7天[43]。因此，發揮肺部給藥的優勢將會為糖尿病等的治療提供有利條件。

圖4 多孔微球的分子修飾改性

2.4 藥物共載

藥物共載同樣作為“多孔微球藥物載體的改性”的衍生技術之一，逐漸成為研究熱點。藥物共載包括：藥物與關鍵蛋白質共載、藥物與基因共載。藥物與關鍵蛋白質共同載入多孔微球，關鍵蛋白啟動細胞信號轉導，與藥物起協同增效的作用。如腫瘤壞死因子相關細胞凋亡誘導配體（TRAIL）可激活細胞凋亡，該途徑只在癌細胞表達，其靶向治療非小細胞肺癌正在早期的臨床研究階段[44-45]。TRAIL與化療藥物阿霉素（DOX）等的聯合治療降低了化療藥物的使用量，減少了毒副作用[46-47]。Kim等[48]將其用于肺部給藥（圖5），采用W/O/W法制備了DOX-PLGA多孔微球，因PLGA中共混帶負電荷的聚甲基丙烯酸乙酯（PEMA），故用吸附法吸附帶正電的TRAIL。結果表明，DOX/TRAIL的載藥量分別為86.5%、91.8%，從微球的釋放分別為7 天和3天；TRAIL的加入降低了DOX的IC50，抑瘤效果顯著。

圖5 多孔微球的關鍵蛋白和藥物共載

Lam等[49]綜述了近幾年利用 siRNA治療肺部疾病的概況，指出該項研究最大的問題就是如何防止siRNA被酶解或清除，如何保持有效的肺部傳遞和沉積。然而目前有關可吸入siRNA治療肺部疾病的研究很少，基因與化療藥物共載研究多集中于以陽離子脂質體為載體[50]的研究，所以將其用在可吸入多孔微球將是一個非常值得挖掘的領域，還有待進一步探索。

3 結 語

目前，肺部給藥用高分子載體從簡單的單聚合物到共混、共聚改性的聚合體，從單載藥物到共載兩種藥物，已取得了很大的進展，但是還有一些問題需要更深一步的研究。首先，對肺部給藥劑型的開發還需要進一步優化，首先如何對多孔微球的粒徑和孔徑進行單獨操控，使其既能有效包埋藥物，又具有良好的空氣動力學性能；其次，若包載的藥物為蛋白質，則其在肺部乃至全身傳遞過程中必須保持活力，由于蛋白質的構象問題以及特殊的酶解反應，其常常比小分子藥物更難發揮藥效，還有霧化吸入過程中藥物的滲漏、肺部環境中囊泡的穩定性、藥物在體內藥動學的改變等。此外，近年來肺部給藥已廣泛地開展動物實驗，但臨床試驗的研究還相對較少，藥物載體釋藥后的降解性和安全性還需要得到進一步的保證。在多孔微球的制備方面，各種制備方法需互相結合，發揮各自的優勢，如乳化法與超臨界技術、靜電噴射技術結合，相分離法與靜電噴射技術結合，可能會制備出分散性更好，孔洞更均勻，粒徑分布更窄，更符合肺部給藥的多孔微球；在多孔微球的改性方面，可以嘗試物理改性和化學改性的結合，尤其是基因與化療藥物的共載已經是腫瘤靶向研究的熱點，而現在有關多孔微球共載兩種藥物的研究卻相對較少，故應綜合藥用高分子材料、藥劑學等方面制備性能更加可控的多孔微球。

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