化學酶法合成鹽酸度洛西汀的研究進展

李龍，邱貴森，蔣泰龍，曾聰明，姚其正

（1中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 210009；2上海艾美晶生物科技有限公司，上海 201203）

鹽酸度洛西汀[Duloxetine hydrochloride，（S）-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)-3-丙胺鹽酸鹽]（結構式見圖 1）是由美國禮來公司和德國勃林殷格翰公司共同研發的新型抗抑郁藥，它是一種5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取雙重抑制劑（serotonin &norepinephrine reuptake inhibitors，SNRIs），在高劑量時會產生對多巴胺（DA）攝取抑制作用，2002年9月獲FDA批準在美國上市，用于治療重型抑郁癥和焦慮癥，商品名為“Cymbalta（欣百達）”；2004年9月FDA批準用于緩解中樞性疼痛，如糖尿病外周神經病性疼痛和婦女纖維肌痛等。2007年4月進入我國。2012年全球20個最暢銷的處方藥榜單中度洛西汀以49.94億美元的年銷售額排名第9，相對2011年的年銷售額增漲了16%。目前國內僅有3家企業獲批生產鹽酸度洛西汀的原料和制劑，分別是上海萬代制藥、上海中西制藥和江蘇恩華藥業股份有限公司。

圖1 鹽酸度洛西汀結構式

由于鹽酸度洛西汀中的丙胺端位C原子上連有2-噻吩基和1-萘氧基兩個不同基團，形成不對稱中心，產生(R)-和(S)-兩種對映異構體。研究發現(S)-型的鹽酸度洛西汀藥效是(R)-型兩倍，并且，相對于(R)-鹽酸度洛西汀來說，(S)-型對映體是更強的5-羥色胺再攝取抑制劑[1]，因而，上市的鹽酸度洛西汀為(S)-型對映體。可見，對映選擇性合成（enantioselective synthesis）鹽酸度洛西汀顯得十分重要，目前合成鹽酸度洛西汀方法主要分為兩類：純化學法和化學酶法，這兩種方法要解決的核心問題是制得單一對映異構體：(S)-1-(噻吩-2-基)-1-仲醇衍生物。在已報道的多種純化學法中，主要用化學拆分法和催化不對稱合成法，前一種方法是用拆分劑來拆分合成中所產生的(R)/(S)外消旋仲醇混合中間體；后一種方法常用金屬配合物作催化劑，進行不對稱合成，獲得(S)-對映中間體；兩法在分別獲得各自的(S)-仲醇中間體后，再分別制得(S)-構型的鹽酸度洛西汀。純化學法合成這一藥物有各自的優缺點，并已有較多中外文的綜述發表，本文將對化學酶法合成鹽酸度洛西汀的研究進展作一次總結，以供參考。

1 生物催化概述

生物催化是依托于大規模基因組測序、定向進化、蛋白表達、代謝工程、高通量篩選和結構生物學等技術而快速發展起來的[2]。它是以微生物和酶作為催化劑，立體選擇性的合成單一手性化合物的技術。由于其優良的催化特性和環保等特點[3]，生物催化已經在食品添加劑、洗滌劑、藥物和農藥的中間體和其他大宗化學品上得到了應用。相對于傳統的化學合成法，生物催化可以較好地滿足對降低成本、減少污染物、減少能源消耗和提高合成目標產物效率（如收率和立體選擇性等）等要求，使之成為一個有效實現綠色化學的方案。生物催化法合成手性化合物主要應用酶法拆分與生物催化不對稱合成這兩種方法（或技術）。

1.1 酶法拆分（enzymatic resolution）

該技術最初由Louis Pasteur在1848年首次使用酵母菌成功分離酒石酸銨鹽的外消旋體而建立，它是利用酶立體選擇性地與外消旋體中某一對映體發生反應而生成不同化合物的特性，從而將兩個對映體分開的技術[4]。按拆分方法可分為動力學拆分、動態動力學拆分、去消旋化、非水溶劑下酶法拆分等。手性拆分使用的酶有脂肪酶、酯酶、蛋白酶等水解酶，常使用脂肪酶制備度洛西汀的關鍵中間體。具有特定立體選擇性的脂肪酶的微生物主要有念珠菌屬（Candida）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、曲霉菌屬（Aspergillus）以及根霉菌屬（Rhizopus）等。

1.2 生物催化不對稱合成（asymmetry synthesis with biocatalysis）

生物催化不對稱合成是不對稱合成的一個分支，是利用純酶或有機體催化無手性、潛手性化合物轉變為手性產物的過程[5]。根據酶催化反應的類型可將酶分為水解酶、氧化還原酶、轉移酶、裂解酶、連接酶、異構酶等。

在生物催化不對稱合成鹽酸度洛西汀中主要應用以下兩種酶：酮還原酶[6]（keto-reductases，簡寫為KRED）和羥腈裂解酶[7]（hydroxynitrile lyases，簡寫為 HNLs），以解決制得(S)-1-(噻吩-2-基)-1-仲醇衍生物的問題，為合成度洛西汀提供關鍵手性中間體。

1.2.1 酮還原酶（KRED）

酮還原酶屬于氧化還原酶系，能夠對映選擇性地將酮羰基轉化為相應的手性仲醇。這些酶需要輔酶的參與，在以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯（NADPH）作為氫源的條件下，利用輔酶甲酸脫氫酶（FDH）將甲酸氧化成二氧化碳或葡萄糖脫氫酶（GDH）[8]將葡萄糖氧化成葡萄糖酸，同時所釋放的氫在輔酶作用下，可分別使NAD或NADP再生為NADH或NADPH，具體過程見圖2。酮還原酶活性可以通過測量NADPH吸光度或熒光的減少來標定。

1.2.2 羥腈裂解酶（HNLs）

圖2 酮還原酶參與的不對稱合成原理

羥腈裂解酶屬于裂解酶系，它可以使氫氰酸加成到酮類或醛類化合物上，立體選擇性的生成手性氰（基）醇化合物。早在1908年Roseenthaler便用杏仁中的HNLs進行過不對稱合成實驗，但是當時此研究結果并沒有得到足夠的重視，直到最近 30年，人們才又認識到它在手性化合物合成中的重要性。(R)-HNLs多存在于擬南芥（Arabidopsis thaliana），薔薇科（如杏仁、黑櫻桃、桂櫻、杏、桃、李、蘋果、梨等）亞麻屬植物中[9]；(S)-HNLs多存在于大戟科（如橡膠樹屬、木薯屬、高粱屬）等植物中。目前人們已經透徹認識了羥腈裂解酶的氨基酸序列及其作用機理，并能熟練的運用相關技術對其進行優化及重組表達，實驗室或工業上所用的HNLs多為優化后的重組酶或突變酶。生成氰醇的反應原理見圖3。

圖3 羥腈裂解酶參與的不對稱合成原理

在化學酶催化法制備鹽酸度洛西汀的工藝路線中，根據所用酶的種類可主要分為三大類合成路線。

2 脂肪酶催化合成路線

2.1 路線一

該路線以2-氯-1-(噻吩-2-基)乙酮（簡稱1，下同）為原料，經NaBH4還原生成消旋體2-氯-1-(噻吩-2-基)乙醇（2），2與 NaCN反應得化合物 3，3與乙酸乙烯酯反應，經脂肪酶拆分后得到(S)-a和(R)-b，后者消旋后經脂肪酶拆分得到(R)-a（該對映體可被消旋得3，再重復3以后的過程）和(S)-b[10]。將(S)-a和(S)-b先用硼烷/二甲硫醚還原，后與氯甲酸乙酯反應得到關鍵手性中間體：(S)-[3-羥基-3-(噻吩-2-基)丙基]氨基甲酸乙酯（5），5用 LiAlH4還原得(S)-3-甲氨基-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-醇（6），6 在NaH作用下與1-氟萘縮合得到最終產物（見圖4）。此法采用動態動力學拆分的方法獲得對映體化合物5，減少了拆分帶來的異構體損失，但是該法合成路線較長、操作復雜、總收率只有 16.8%，且用到劇毒物質NaCN，因此，工業化生產受到限制。

2.2 路線二

圖4 以2-氯-1-（噻吩-2-基）乙酮為原料制備度洛西?。肪€一）

圖5 以3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-酮為原料制備度洛西?。肪€二）

該路線以 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-酮（7）為原料，先用NaBH4還原生成化合物8，8經脂肪酶拆分得到(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-醇（9），9 與NaI反應生成化合物10，10與CH3NH2反應生成化合物6，6在NaH作用下與1-氟萘縮合得到最終產物（見圖 5）[11]。此法反應條件溫和，脂肪酶易回收，經濟環保，但是原料7不易制得，化合物分離存在一定的難度，因此工業化價值不高。

3 酮還原酶催化合成路線

3.1 路線三

該路線由CODEXIS開發，所用酮還原酶（源自于乳酸短桿菌），經過重組構建出了一系列的ADH-LK。首先 2-乙酰噻吩（11）與(HCHO)n和CH3NH2·HCl發生Mannich反應生成化合物12，12在酶催化下合成(S)-對映異構體化合物6，6在NaH作用下與 1-氟萘發生反應得到最終產物（見圖6）[12]。此法原料較廉價，合成路線簡單，經濟環保，酶催化效率（100g/L底物最高轉化率可達到95%）和產物ee值較高（≥99%），有較好的工業應用前景。

3.2 路線四

該路線由BASF SE開發，所用酮還原酶源自于固氮弧菌屬物種 EbN1[13]及其突變菌株[14-15]。以 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-酮（7）為原料，在酶的催化下不對稱合成化合物9，9與NaI發生取代反應生成化合物10，10與CH3NH2反應生成化合物6，6在 NaH作用下與 1-氟萘反應生成最終產物（見圖7）。此法雖反應條件溫和，路線簡潔，綠色環保，但是與路線二相似，因原料7制備困難，商品化供應較少，工業化應用受到影響。

圖6 以2-乙酰噻吩為原料制備鹽酸度洛西?。肪€三）

圖7 以3-氯-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-酮為原料制備度洛西?。肪€四）

3.3 路線五

該路線[16]由印度國家醫藥教育和研究學會開發，所用酮還原酶最初源自于熱帶假絲酵母屬菌株PBR-2。CODEXIS公司[17]對 PBR-2進行了改進，并通過突變和重組篩選出了高效的菌株。首先，2-乙酰噻吩與(HCHO)n和CH3NHCH3發生Mannich反應，生成化合物13，13在酶的催化下還原制得(S)-3-二甲氨基-1-(噻吩-2-基)丙烷-1-醇（14），14 在 NaH作用下與 1-氟萘反應生成化合物 15，15在鋅粉和ClCO2CH2CCl3作用下去一甲基得到最終產物（見圖8）[18]。此路線與目前工業上大規模化學法生產度洛西汀的路線大致相同，但使用生物酶制備(S)-型手性仲醇可達到84%～88%的轉化率，且ee%≥99%，相對于化學法制備(S)-型手性仲醇有較大的優勢。

3.4 路線六

Masaru等[19]對來源于短小桿菌屬菌株 F42的酮還原酶進行分析，并構建了一株新的菌株不對稱合成化合物17。此法以2-乙酰噻吩為原料，先與碳酸二乙酯反應生成化合物16，化合物16在酶催化下得到化合物17，化合物17在MeOH和MeNH2作用下得到化合物6，然后化合物6在NaH作用下與1-氟萘反應生成終產物（見圖9）[20]。其中的酶催化制備的(S)-型手性醇化合物17的穩定性差，容易發生水解。中國科學院成都生物研究所湯傳根等[21]合成出了化合物18，以此為底物篩選出一株黏紅酵母 CY12，在該菌株催化下得到了能夠在水溶液中穩定存在手性化合物19，當底物濃度為30g/L時轉化率也能達到95%，且ee為96%，但是受原料和底物耐受性的限制，工業化意義不大。

圖8 以2-乙酰噻吩為原料制備鹽酸度洛西汀（路線五）

圖9 以2-乙酰噻吩為原料制備鹽酸度洛西?。肪€六）

4 羥腈裂解酶催化合成路線

Annika等[22]以2-噻吩甲醛（20）為原料，采用化學酶拆分法合成出鹽酸度洛西汀；Rohan等[23]同樣以20為原料，利用羥腈裂解酶作為催化劑也得到了鹽酸度洛西汀。該路線以2-噻吩甲醛（20）為起始物，使用一種新發現的來自白杏的?-型羥腈裂解酶催化制得(S)-2-羥基-2-(噻吩-2-基)乙腈（21），21與 DIBAL-H在?78℃下還原水解生成醛基化合物22，22在LiHMDS和Ph3PCH2作用下生成(S)-1-羥基-1-(噻吩-2-基)丙-2-烯（23），23 在 H2O2與Me2SBH3作用下發生氧化還原反應生成化合物24，24與CH3NH2發生反應生成化合物6，6在NaH作用下與1-氟萘反應得到最終產物（見圖10）。此法原料易得，但是最終收率只能達到21%，合成路線中部分反應條件苛刻，反應步驟較繁瑣，工業化意義不大。

圖10 以2-噻吩甲醛為原料制備鹽酸度洛西汀

5 結 語

在化學酶催化法制備鹽酸度洛西汀過程中，主要通過酶法拆分和生物催化不對稱合成關鍵單一手性中間體：(S)-1-(噻吩-2-基)-1-仲醇及其衍生物，由此所形成的多種合成路線具有反應條件較溫和、綠色環保等優點，其中路線三和路線五展現出了較好的工業應用前景。

由于醇以及手性仲、叔醇是有機合成中最基礎、最重要的原料，用化學酶法合成醇等基礎有機化合物受到普遍重視。盡管目前微生物及酶的催化效率、重復使用率、底物的耐受性和產物分離等一系列問題阻礙了生物催化大規模工業化的進程，但是這些難題隨著高通量篩選、DNA重組技術、易錯PCR、基因組學和定向進化技術的發展，并且伴隨著催化劑工程、介質工程、過程工程等技術的緊密結合而終將得以解決，這些發展也將有力地推動著手性仲醇或叔醇的合成，為人們提供結構更豐富、產量更大和應用價值更高的手性純化合物。生物催化已進入快速發展的新時期，正在影響著食品、醫藥和精細化學品行業的工業生產模式，使這些產品的生產過程對環境也更加的友好。

[1]Cashman J R，Ghirmai S.Inhibition of serotonin and norepinephrine reuptake and inhibition of phosphodiesterase by multi-target inhibitors as potential agents for depression[J].Bioorganic &Medicinal Chemistry，2009，17：6890–6897.

[2]Savile C K，Janey J M，Colbeck J C，et al.Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture[J].Science，2010，329：305–309.

[3]Schoemaker H E，Mink D，Wubbolts M G.Dispelling the myths–biocatalysis in industrial synthesis[J].Science，2003，299：1694–1697.

[4]張國艷，曹淑桂.酶法手性拆分技術研究和應用的最新進展[J].吉林大學學報：理學版，2008，46（5）：997-1001.

[5]Cheng Y M，Wang L，Yu D H，et a1.Preparation of glycidol by combination of enzymatic and chemical methods[J].Journal of Jilin University：Science Edition，2007，45（4）：681-685.

[6]Liang J，Borup B，Mitchell V，et al.Ketoreductase polypeptides and uses thereof：US，20090155863A1[P].2009-06-18.

[7]Weis R，Glieder A，Gruber K，et al.R-hydroxynitrile lyases having improved substrate acceptance and the use thereof：US，20100041110A1[P].2010-02-18.

[8]Davis S C，Jenne S J，Krebber A，et al.Glucose dehydrogenase polypetides and related polynucleotides：US，20100304459A1[P].2010-12-02.

[9]Holt J，Hanefeld U.Enantioselective enzyme-catalysed synthesis of cyanohydrins[J].Current Organic Synthesis，2009，6：15-37.

[10]Kamal A，Ramu R，Krishnaji T，et al.Chemo-enzymatic synthesis of duloxetine and its enantiomer：Lipase catalyzed resolution of 3-hydroxy-3-(2-thienyl) propaneitrile[J].Tetrahedron Lett.，2003，44（25）：4783-4787.

[11]Liu H L，Hoff B H，Anthonsen T.Chemo-enzymatic synthesis of the antidepressant duloxetine and its enantiomer[J].Chirality.，2000，12（1）：26-29.

[12]Savile C，Gruber J M，Mundorff E，et al.Polynucleotides encoding engineered ketoreductase polypeptides：US，20130005017A1[P].2013-01-03.

[13]Sturmer R，Kesseler M，Hauer B，et al.Method for producing optically active alcohol from alkanones using a dehydrogenase of azoarcus：US，20080206824A1[P].2008-08-28.

[14]Qu Z M，Sun X Y，Shi H B，et al.Synthesis of duloxetine intermediate (S)-3-chloro-1-(2-thienyl)-1-propanol with liquid-core immobilized candida pseudotropicalis 104[J].Appl.Biochem.Biotechnol.， 2012，168：2297-2308.

[15]Schneider N，Hoffken H W.Biocatalysts for manufacturing duloxetine alcohol： US，20110250655A1[P].2011-10-13.

[16]Soni P，Banerjee U C.Biotransformations for the production of the chiral drug (S)-duloxetine catalyzed by a novel isolate of candida tropicalis[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.， 2005，67：771-777.

[17]Savile C，Gruber J M，Mundorff E，et al.Ketoreductase polypeptides for the production of a 3-aryl-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-keto-propanamine ：US，20100151534A1[P].2010-06-17.

[18]Richard A，Berglund.Asymmetric synthesis of (S)-(+)-N，N-dimeth-yl-3-(1-naphthalenyloxy)-3-(2-thienyl)propanamine an intermediate in the preparation of duloxetine：CA，2133899[P].2007-02-13.

[19]Wada M，Furukawa Y，Takagi H，et al.Cloning and overexpression of theExiguobacteriumsp.F42 gene encoding a new short chain dehydrogenase，which catalyzes the steroselective reduction of ethyl 3-oxo-3-(2-thienyl) propanoate to ethyl(S)-3-hydroxy-3-(2-thienyl) propanoate[J].Biosci.Biotechnol.and Biochem.， 2004，68（7）：1481-1488.

[20]Jun T，Qu J P，Kazuaki K，et al.3-hydroxy-3-(2-thienyl)propionamide compound，process for producing the same，and process for producing 3-amino-1-(2-thienyl)-1-propanol compound therefrom：WO，2003078418[P].2003-09-25.

[21]Tang C G，Lin H.Wu Z L，et al.Highly enantioselective bioreduction ofN-methyl-3-oxo-3-(thiophen-2-yl) propanamide for the production of (S)-duloxetine[J].Biotechnol.Lett.，2011，33（7）：1435-1440.

[22]Traff A，Lihammar R，Backvall J E.A chemo-enzymatic dynamic kinetic resolution approach to enantiomerically pure (R)- and (S)-duloxetine[J].The Journal of Organic Chemistry，2011，76：3917-3921.

[23]Rej R K，Das T，Hazra S，et al.Chemoenzymatic asymmetric synthesis of fluoxetine，atomoxetine，nisoxetine and duloxetine[J].Tetrahedron：Asymmetry，2013，24：913-918.