電針對慢性應激抑郁大鼠海馬CNTF Rα、EGFR蛋白表達的影響

胡 誠 王 晶 張丹妹 史榕荇 包伍葉 宋映周 盧 俊 圖 婭 鄔繼紅

(1 北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京，100029; 2 世界中醫藥學會聯合會，北京，100101; 3 中日友好醫院針灸科，北京，100029)

電針對慢性應激抑郁大鼠海馬CNTF Rα、EGFR蛋白表達的影響

胡 誠1王 晶2張丹妹1史榕荇3包伍葉1宋映周1盧 俊1圖 婭1鄔繼紅1

(1 北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京，100029; 2 世界中醫藥學會聯合會，北京，100101; 3 中日友好醫院針灸科，北京，100029)

目的：觀察電針對抑郁大鼠海馬睫狀神經營養因子受體(CNTF Rα)、表皮生長因子受體(EGFR)蛋白表達的影響，探討慢性應激抑郁模型(CUMS)大鼠星形膠質細胞功能的改變及電針的干預作用趨勢。方法：雄性SD大鼠隨機分為4組：空白組、模型組、模型+電針組、模型+氟西汀組，每組10只。利用生物素標記蛋白芯片技術，檢測大鼠CNTF Rα、EGFR蛋白的表達。結果：模型組與空白組比較，大鼠海馬CNTF Rα、EGFR蛋白表達上調(fold change=1.50，1.37)。模型+電針組、模型+氟西汀組與模型組比較，CNTF Rα水平下調(fold change=0.73，0.50)，EGFR表達水平下調(fold change=0.61，0.47)。結論：各組大鼠海馬CNTF Rα、EGFR的表達存在差異性，這可能是星形膠質細胞功能改變及針刺抗抑郁的機制之一。

電針;抑郁癥;慢性應激;海馬;星形膠質細胞

抑郁癥是一種常見的精神疾患，主要表現為顯著而持久的心境低落，思維行為改變，并伴有軀體癥狀[1]。電針治療抑郁癥可起到減輕軀體癥狀、降低抗抑郁藥物不良反應的作用，并且針藥結合使用，還可使療效疊加[2]。針刺治療抑郁癥已成為臨床中的重要組成部分，顯示出了較大的優勢，但其作用途徑較復雜，且尚沒有統一的定論。本研究首次利用生物素標記蛋白芯片技術，篩選出與星形膠質細胞功能變化相關的睫狀神經營養因子受體(CNTF Rα)、表皮生長因子受體(EGFR)，旨在豐富針刺治療抑郁癥的機制研究。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠(200±20)g，清潔級，共40只。由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證編號：SCXK(京)2004-2007。所有動物在實驗前適應性喂養1周，實驗室溫度(23±1)℃、濕度55%～60%。

1.2 主要試劑和儀器電針儀 (華佗牌，SDZ-II型);氟西汀(Fluoxetine hydrochloride，法國禮來公司，批號：J20120001);AAR-BLM-1試劑盒(美國RayBiotech公司，芯片批號：4015806、4015807)：包括膜芯片(RayBio? Biotin label-based Rat antibody array 1)、標記試劑、終止液、封閉緩沖液、紅外熒光劑—鏈霉親和素、透析管和浮漂、20X的洗液I、20X的洗液II、純化柱、孵育盒;紅外熒光掃描儀(Licor-Odyssey，美國LI-COR公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 對參考文獻的造模方法進行改進[3]。除空白組外，其余3組大鼠進行28 d各種不同的應激刺激，包括：斷食24 h;斷水24 h;夜間光照12 h;冷水游泳(4 ℃，5 min，水深30 cm);潮濕墊料;夾尾2 min;束縛3 h。

1.3.2 動物分組 采用隨機數字表的方法將大鼠分為空白組、模型組、模型+電針組、模型+氟西汀組，每組10只。空白組動物自由攝食飲水，不接受任何刺激且群養。其他3組動物孤養，且每天進行慢性應激造模處理。其中，模型+電針組動物每日在應激刺激前1 h，進行電針干預。模型+氟西汀組動物每日在應激刺激前1 h，進行氟西汀灌胃干預。

1.3.3 針刺方法 取穴：針刺穴位參考《實驗針灸學》[4]，選取“百會”“印堂”穴。操作：針具選用30號1寸毫針(2.5 cm)，平刺進針，深度為0.5～1 cm。進針后，接電針治療儀，以大鼠頭部微顫為宜，留針20 min/次。

1.3.4 給藥方法 將藥物溶于蒸餾水中，給藥容積為5 mL/kg體重，用藥劑量10 mg/kg體重。

1.4 取材及檢測方法 于慢性應激4周后，灌流，取腦放入液氮中，然后轉移到-80 ℃冰箱保存待測。1)樣品透析：將每組的10個大鼠海馬組織混合，取200 μL組織裂解液加入透析管中，然后在4 000 mL的1×PBS(pH=8)中4 ℃邊攪拌邊透析。更換透析液1次/3 h。2)測定蛋白濃度：采用BCA試劑盒(Pierce公司，貨號：23227)檢測淋巴液蛋白濃度。3)生物素標記：將標記試劑小管快速離心，管中加入500 μL 1×PBS溶解粉末，上下吹打將標記試劑混勻，制備成1×標記試劑溶液;向新的離心管中加入適當量的標記試劑，快速混勻，此后，每5 min輕彈離心管以混合反應試劑，搖床上室溫孵育30 min;加入5 μL終止液，用純化柱去除未與芯片上蛋白結合的生物素;將柱子放入50 mL收集管中;于3 000 r/min離心機離心3 min，去掉儲存液，重復兩次此操作后，清洗干凈柱子;將柱子放入一個新的50 mL離心管中，緩慢將標記好的樣品加入樹脂床的中央。4)封閉和孵育：用鑷子拖著膜或者夾著膜的邊緣將膜緩慢浸沒到2.5 mL的封閉緩沖液中，有標志的面朝上，避免氣泡產生，蓋上孵育盒的蓋子，室溫振蕩孵育1 h;用抽液泵抽去封閉液，每張膜芯片加入2.5 mL封閉液稀釋好的樣品，蓋上蓋子，包上塑料薄膜，4 ℃環境下過夜;抽去樣品，每個孵育盒中加入約3 mL的1×洗液I(20×洗液用去離子水稀釋)室溫振蕩洗膜，洗膜4次，5 min/次;抽去1×洗液I，加入1×洗液II室溫振蕩洗膜，洗膜3次，5 min/次;抽去1×洗液II，每張膜加入2.5 mL用封閉液8 000倍稀釋的CW800-鏈霉親和素;室溫避光振蕩孵育2 h;洗膜(步驟同上)。5)掃描：使用美國LI-COR公司的LI-COR Odyssey Scanner進行掃描，設定波長為800掃描通道，掃描強度intensity為7.0，分辨率為42 μm。采用儀器自帶分析軟件提取數據，采用AAR-BLM-1的數據分析軟件來進行數據預分析。

2 結果

4周應激處理后，與空白組相比，模型組大鼠海馬CNTF Rα表達上調(fold change=1.50);相較于模型組，模型+電針組、模型+氟西汀組CNTF Rα表達下調(fold change=0.73，0.50)。見圖1。

圖1 各組海馬CNTF Rα的表達

與空白組相比，模型組大鼠海馬EGFR蛋白的表達上調(fold change=1.37);與模型組相比，模型+電針組、模型+氟西汀組EGFR表達下調(fold change=0.47)。見圖2。

圖2 各組海馬EGFR的表達

3 討論

3.1 星形膠質細胞與抑郁癥 星形膠質細胞(Astrocyte，AST)，作為中樞神經系統中數量最多、分布最廣的一類細胞，是神經元的支持細胞。在突觸重塑、神經細胞再生、神經元調節方面，AST也起著重要的作用[5]。AST與情緒障礙性疾病的發生有著密切的聯系。Czeh等[6]對成年雄性樹鼩進行5周心理應激，發現其海馬AST總數減少，胞體體積減小。Lori L[7]等用磁共振成像技術觀察包括抑郁障礙的情緒障礙性疾病患者，發現其星型膠質細胞密度減少。AST在腦損傷中起著雙重作用。郭志慧等[8]認為，腦組織受損后釋放多種因子激活了AST，而活化的AST在早期對神經元有保護作用，另一方面，也通過釋放多種損傷因子對神經元產生毒性。姜碩等[9]建立抑郁大鼠模型并用針刺治療發現，模型大鼠AST明顯減少，針刺干預后AST增多。

3.2 關于指標的選擇 生物素標記蛋白芯片技術具有實用性強、快速、準確、高通量、高靈敏度等特點[10]。彌補了基因組研究不能獲得對疾病狀態進行了解的缺陷。本課題應用生物素標記蛋白芯片技術，共檢測出大鼠90個蛋白的表達情況。著重關注了CNTF Rα和EGFR兩個指標。CNTF Rα是睫狀神經營養因子(CNTF)的特異性結合蛋白質。KAHN等[11]發現體外培養的AST表面均有CNTF受體的表達。EGFR具有絡氨酸激酶活性。有研究表明[8]，AST活化后，EGFR表達明顯上調，而抑制EGFR會抑制AST的活化。此外，何健等[12]認為，AST被激活后，細胞表面的CNTF Rα、EGFR超表達，通過改善復雜的內環境，有利于定向誘導神經干細胞向神經元分化。這對進一步探討抑郁狀態下AST功能的變化及針刺干預的影響，完善針刺抗抑郁的機制研究有著重要的意義。

通過檢索發現，國內研究多重復AST特異性標記物膠原纖維酸性蛋白(GFAP)的表達與AST功能的關系，而少有其他相關蛋白的報道。生物素標記蛋白芯片技術為我們提示了CNTF Rα、EGFR蛋白差異性變化的趨勢，但對于所篩選的蛋白的可靠性和二者的作用及影響機制，還有待實驗和臨床的進一步驗證和完善。

[1]Yu S，Holsboer F，Almeida O F.Neuronal actions of glucocorticoids： focus on depression[J].J Steroid Biochem mol Biol，2008，108(3-5)：300-309.

[2]段冬梅，圖婭，陳利平.電針與百優解對伴軀體癥狀抑郁癥有效性的評價[J].中國針灸，2008，28(3)：167-170.

[3]戴巍，李衛東，盧峻，等.電針對慢性應激抑郁大鼠海馬神經元凋亡及JNK信號轉導通路的影響[J].針刺研究，2010，35(5)：330-334.

[4]張露芬.實驗動物學[M].北京：化學工業出版社，2010：150-156.

[5]張敬軍.星形膠質細胞的研究[J].中國藥理學通報，2006，22(7)：788-791.

[6]Czeh B，Simon m，Schmelting B，et al.Astroglial plasticity in the hippocampus is affected by chronic psychosocial stress and concomitant fluoxetine treatment[J].Neuropsychopharmacology，2006，31(8)：1616-1626.

[7]Altshuler，LL，Abulseoud OA，Foland-Ross L，et al.Amygdala Astrocyte Reduction in Subjects with major Depressive Disorder but Not Bipolar Disorder[J].Bipolar Disorders，2010，12(5)：541-549.

[8]郭志慧，武衡.星形膠質細胞活化與表皮生長因子受體表達的相關性研究[J].中風與神經疾病雜志，2010，27(8)：683-685.

[9]姜碩.電針修復慢性應激致抑郁大鼠海馬星形膠質細胞損傷的機制研究[D].廣州：廣州中醫藥大學，2013.

[10]田浩梅，易受鄉.抗體蛋白芯片技術應用研究進展[J].湖南中醫藥大學學報，2009，29(3)：75-78.

[11]KAHN m A，HUANG C J，CARUSO A.Ciliary neurotrophic factor activates JAK/STAT signal transduction cascade and induces transcriptional expression of glial fibrillary acidic protein in glial cells[J].J Neurochem，1997，68(4)：1413-1423.

[12]何健，尹宗生，高維陸，等.大鼠表皮生長因子、睫狀神經營養因子真核表達載體的構建及其體外表達的鑒定[J].中國組織工程研究，2012，16(23)：4284-4289.

(2014-02-12收稿 責任編輯：王明)

Influence of Electro-acupuncture on CNTF Rα、EGFR protein expression in rats with chronic stress depression

Hu Cheng1，Wang Jing2，Zhang Danmei1，Shi Rongxing2，Bao Wuye1，Song Yingzhou1，Lu Jun1，Tu Ya1，Wu Jihong1

(1SchoolofAcu-moxibustionandTuina，BeijingUniversityofChinesemedicine，Beijing100029，China;2WorldFederationofChinesemedicineSocieties，Beijing100101，China; 3China-JapanFriendshipHospital，Beijing100029，China)

Objective：To observe the effect of electroacupuncture on ciliary neurotrophic factor receptor and epidermal growth factor receptor of the hippocampal in the depression model rats.Methods：SD rats were randomly divided into four groups： blank group，model group，model+EA group，and model+ fluoxetine.Use biotin-labeled protein chip technology to detect the expression of CNTF Rα and EGFR.Results：Compared to the blank group，the protein expression of CNTF Rα and EGFR in the model group are upregulation.Compared to the model group，CNTF Rα and EGFR expression are downregulation in model+EA group and model+ fluoxetine group.Conclusion：The different expression of CNTF Rα and EGFR in each group may be one of the mechanisms of antidepressant by acupuncture.

Electro-acupuncture;Depression;Chronic Stress;Hippocampus;Astrocyte

國家自然科學基金面上項目(編號：81173334);北京中醫藥大學2013年校級自主課題(編號：0100604217)

鄔繼紅(1964.4—)，女，碩士研究生，教授，研究方向：影響針灸療效相關因素的研究，E-mail：wujihong@sohu.com

R245.9+7

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.05.024