鴨疫里默氏桿菌血清型鑒定及耐藥性分析

蔡丙嚴　王濤　吳植　李巨銀

摘要：從泰州地區疑似鴨疫里默氏桿菌感染鴨場采集病料，經細菌分離培養得到2株菌株，通過細菌形態、培養特性、生化試驗等方法鑒定為鴨疫里默氏桿菌，分別命名為TY1株和TY2株。采用玻片凝集試驗對2個分離株進行血清型鑒定、K-B 紙片擴散法進行12種常用抗菌藥物的藥敏試驗，結果顯示，TY1和TY2株均為血清1型，對頭孢吡肟、環丙沙星高度敏感，對復方新諾明、阿米卡星、慶大霉素、青霉素、鏈霉素、阿奇霉素、林可霉素、利福平耐藥。

關鍵詞：鴨疫里默氏桿菌；血清型；鑒定；藥敏試驗

中圖分類號： S858.322.61文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0168-02

收稿日期：2013-05-09

基金項目：江蘇省高等學校大學生實踐創新訓練計劃（編號：2012JSSPITP3463）；江蘇農牧科技職業學院科技資助項目（編號：YB1204）。

作者簡介：蔡丙嚴（1980—），男，河南濮陽人，碩士，講師，主要從事動物防疫與檢疫專業的教學及科研工作。E-mail：caibingyan20@163.com。鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）是一種革蘭氏陰性、無鞭毛、無芽孢的棒狀桿菌，瑞氏染色呈兩極著色。鴨疫里默氏桿菌所引起的傳染病稱為鴨傳染性漿膜炎，該病呈世界范圍分布，給養鴨業帶來了巨大的經濟損失[1]。

RA對營養要求較高，在普通營養瓊脂和麥康凱瓊脂上不生長，在胰酶大豆瓊脂（TSA）、血液瓊脂、巧克力瓊脂上生長良好。RA在初次分離培養時對CO2依賴性強，一般在燭罐或CO2培養箱中，提高CO2濃度和濕度，37 ℃培養 48～72 h，RA生長最佳[2]。RA血清型眾多且非常復雜，現在國際上報道的血清型共有21 種，其中優勢血清型為 1 型和 2 型[3]，在我國，程安春等在此基礎上又發現了4 個新的血清型[4]。血清型的復雜及血清型之間無交叉保護力給此病的防治帶來極大的困難，多年來，由于生產上盲目用藥、濫用藥或超劑量用藥，RA對各種抗生素均產生不同程度的耐藥性，尤其對喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素的耐藥性非常普遍，耐藥率極高，耐藥情況復雜，并且來自同一群不同株對同一藥物敏感性有差異的情況非常普遍[5-6]。

從江蘇泰州周邊地區2個規模養鴨場臨床疑似鴨疫里默氏桿菌感染的病死鴨中，進行病原分離和血清型鑒定，并且對分離菌株進行藥敏試驗，為切實做好該病的防治工作提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來源2013年3月，從泰州周邊地區獲得臨床具有典型鴨疫里默氏桿菌感染的病死鴨，從病死鴨的腦、心血、肝臟中分離獲得2株菌株，分別命名為TY1、TY2。

1.1.2培養基胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA，批號：2107469）、胰蛋白酶大豆肉湯培養基（TSB，批號：2191068），均購自碧迪醫療器械（上海）有限公司；麥康凱瓊脂培養基（批號：12075）、普通瓊脂培養基（批號：120909），均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3藥品阿莫西林、慶大霉素、環丙沙星、多西環素、頭孢吡肟、阿米卡星、復方新諾明、青霉素、鏈霉素、阿奇霉素、林可霉素、利福平等12種藥敏試紙（批號：20120920），購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4試劑革蘭氏染液、瑞氏染液、微量生化發酵管，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；犢牛血清，購自浙江天航生物科技有限公司；鴨疫里默氏桿菌1～10型陽性血清，購自中國獸醫藥品監察所。

1.2方法

1.2.1細菌分離培養與形態觀察無菌采取病死鴨腦、心血、肝臟等病料，分別接種于普通瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）、巧克力瓊脂培養基、鮮血瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基平板上，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養 48 h。觀察菌落形態，挑取單個疑似菌落涂片，革蘭氏染色和瑞氏染色鏡檢，純培養后，以40%甘油生理鹽水于-70 ℃保存備用。

1.2.2生化試驗挑取TSA 瓊脂培養基、鮮血瓊脂培養基平板上純化的疑似 RA 菌株，按 Edwards PR 的方法用接種環在超凈臺將菌落接種于乳糖、半乳糖、蕈糖、果糖、蔗糖、棉子糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、枸櫞酸鹽、H2S、M-R、V-P 尿素酶、吲哚等生化培養基上，繼續培養 48～72 h 觀察試驗結果。

1.2.3血清型鑒定將純化培養的分離菌株在含有5%犢牛血清的 TSA 培養基上，37 ℃、5% CO2培養箱中培養36 h。取1滴標準陽性血清滴于干凈玻片上，挑取少量菌落混勻于標準陽性血清中，靜置片刻觀察玻片凝集結果。

1.2.4藥敏試驗采用K-B紙片擴散法，將保存的2株菌株分別在TSA瓊脂培養基平板上擴增培養，刮取菌落，用滅菌生理鹽水稀釋細菌懸液至1.5×108個/mL，吸取0.1 mL均勻涂布于TSA瓊脂培養基平板上，待菌液表面干燥后，用滅菌鑷子將抗生素紙片貼附在瓊脂表面，繼續培養 48 h后測量抑菌圈直徑。

2結果與分析

2.1細菌分離培養特性與形態特征

分離菌株在胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）上生長良好，菌落濕潤，小菌落呈露滴樣，在麥康凱瓊脂培養基和營養瓊脂培養基上不生長。取菌落涂片、染色鏡檢，革蘭氏染色可見陰性小桿菌，單個或成雙存在；瑞氏染色呈現兩極濃染的小桿菌。

2.2生化試驗

由表1可見，TY1和TY2株均不發酵乳糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等多種碳水化合物，不產生靛基質和硫化氫，過氧化氫酶、氧化酶和明膠液化試驗為陽性，符合鴨疫里默氏桿菌的生化反應特征。

表12株分離菌株生化特性鑒定結果

項目1結果1項目1結果1項目1結果乳糖1-1麥芽糖1-1M-R1-半乳糖1-1甘露醇1-1H2S1-覃糖1-1山梨醇1-1過氧化氫酶1+果糖1-1枸櫞酸鹽1-1尿素酶1-蔗糖1-1硝酸鹽還原1-1氧化酶1+棉子糖1-1檸檬酸鹽1-1吲哚1-葡萄糖1-1V-P1-1明膠液化1+

2.3血清型鑒定

將TY1和TY2株分別與鴨疫里默氏桿菌1～10型單因子陽性血清做玻片凝集試驗，兩菌株均與1型陽性血清出現清晰的乳白色絮狀凝集塊，與其他型陽性血清均不反應。由此鑒定，TY1和TY2株均為血清1型。

2.4藥敏試驗

由表2可見，TY1和TY2株對頭孢吡肟、環丙沙星高度敏感，對強力霉素、阿莫西林中度敏感，對復方新諾明、阿米卡星、慶大霉素、青霉素、鏈霉素、阿奇霉素、林可霉素、利福平耐藥。

表22株分離菌株的藥敏試驗結果

藥物名稱1抑菌圈直徑（mm）TY11TY21藥物濃度

（μg/片）頭孢吡肟119118115環丙沙星11611715強力霉素112113130阿莫西林114111110復方新諾明1919123.71、1.25阿米卡星1918130慶大霉素1818110青霉素1917110鏈霉素1718110阿奇霉素1816115林可霉素151712利福平151315注：抑菌圈直徑10 mm 以下為耐藥（不敏感）；10～15 mm為中度敏感；15 mm以上為高度敏感。

3小結與討論

鴨疫里默氏桿菌初次分離培養，由于所需生長條件苛刻、病料不新鮮和鴨場大量使用抗生素等原因，往往不易分離到，因此，RA初次分離，病料的采取和培養條件的選擇至關重要。從分離過程中發現，在病鴨剛死亡或瀕臨死亡時無菌采取鴨腦組織和心血，且在TSA瓊脂培養基平板上37 ℃、5% CO2培養箱中培養24～48 h，病菌分離成功率較高。

血清型鑒定有利于疫苗的研究和RA 控制。由于RA 血清型較多，且各血清型之間的交叉保護性差， 因此，研制針對本地血清型的RA疫苗對于鴨疫里默氏桿菌的防治具有重要意義[7]。根據胡清海等人的調查，江蘇地區主要以1、2、10 型為主[8]。從本次試驗結果可知，泰州周邊地區規模鴨場分離的2株RA菌株均為血清1型，基本摸清了本地區流行RA菌株的優勢血清型，為研制相應血清型的疫苗、控制該病的發生奠定了理論基礎。

目前，鴨疫里默氏桿菌已成為國內危害養鴨業最嚴重的傳染病之一，大部分鴨場，尤其是肉鴨場都有此病發生。雖然 RA 對多種抗生素敏感，但極易產生耐藥性，而且不同地區、不同菌株對抗菌藥物的敏感性不一，給實際治療工作帶來困難，最好能對當地分離菌株進行藥敏試驗，以便選擇最佳藥物進行治療[9]。頭孢吡肟為新的第四代注射用頭孢菌素，對葡萄球菌屬和腸桿菌屬（尤其產氣和陰溝腸桿菌）的作用更強，對多種質粒介導和染色體介導的β內酰胺酶穩定，獸醫臨床應用較少。本次藥敏試驗結果表明，泰州地區鴨疫里默氏桿菌對頭孢吡肟和環丙沙星高度敏感，對氨基糖苷類抗生素如慶大霉素、丁胺卡那霉素、林可胺類抗生素和磺胺類抗生素等耐藥。因此，臨床選擇用藥時必須以藥敏試驗結果為依據，才能做到正確用藥，減少耐藥菌的產生，從而提高治愈率，減少經濟損失[10]，有條件的鴨場更應定期對環境中RA的藥敏特性進行監測，以便在發病時及時有效地用藥。

參考文獻：

[1]Calnek B W. 禽病學[M]. 11版. 高福，蘇敬良，索勛，等譯. 北京：中國農業出版社，2005：767-772.

[2]馬志偉，劉世超，許家榮，等. 鴨疫里默氏桿菌的分離、鑒定及培養條件優化[J]. 浙江農業科學，2010（5）：1123-1126，1155.

[3]Pathanasophon P，Phuektes P，Tanticharoenyos T，et al. A potential new serotype of Riemerella anatipestifer isolated from ducks in Thailand[J]. Avian Pathology，2002，31（3）：267-270.

[4]程安春，汪銘書，陳孝躍，等. 我國鴨疫里默氏桿菌血清型調查及新血清型的發現和病原特性[J]. 中國獸醫學報，2003，23（4）：320-323.

[5]劉穎，蘇敬良，劉文華，等. 鴨疫里默氏菌的藥物敏感性檢測[J]. 中國獸醫雜志，2005，41（5）：10-12.

[6]許金俊，范海峰，金文杰，等. 徐州地區鴨傳染性漿膜炎的病原分離鑒定及藥敏試驗[J]. 中國預防獸醫學報，2006，28（5）：503-506.

[7]呂敏娜，黃承鋒，張毓金. 鴨疫里默氏桿菌大腸桿菌二聯蜂膠苗的研制[J]. 中國獸醫雜志，2005，41（1）：48-50.

[8]胡清海，張知良，苗晉鋒，等. 江蘇安徽兩省鴨疫里默氏桿菌病的流行病學調查研究[J]. 中國獸醫科技，2001，31（8）：12-13.

[9]謝永平，陳澤祥，許力干，等. 鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及耐藥性研究[J]. 廣西農業科學，2010，41（7）：729-731.

[10]都振玉.濰坊地區鴨傳染性漿膜炎病原體的分離鑒定與疫苗制備應用研究[D]. 泰安：山東農業大學，2009：1-47.成鋼，王文龍，趙銘，等. 湖區波爾山羊常見寄生蟲病臨床診斷與綜合防控[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：170-171.

項目1結果1項目1結果1項目1結果乳糖1-1麥芽糖1-1M-R1-半乳糖1-1甘露醇1-1H2S1-覃糖1-1山梨醇1-1過氧化氫酶1+果糖1-1枸櫞酸鹽1-1尿素酶1-蔗糖1-1硝酸鹽還原1-1氧化酶1+棉子糖1-1檸檬酸鹽1-1吲哚1-葡萄糖1-1V-P1-1明膠液化1+

2.3血清型鑒定

將TY1和TY2株分別與鴨疫里默氏桿菌1～10型單因子陽性血清做玻片凝集試驗，兩菌株均與1型陽性血清出現清晰的乳白色絮狀凝集塊，與其他型陽性血清均不反應。由此鑒定，TY1和TY2株均為血清1型。

2.4藥敏試驗

由表2可見，TY1和TY2株對頭孢吡肟、環丙沙星高度敏感，對強力霉素、阿莫西林中度敏感，對復方新諾明、阿米卡星、慶大霉素、青霉素、鏈霉素、阿奇霉素、林可霉素、利福平耐藥。

表22株分離菌株的藥敏試驗結果

藥物名稱1抑菌圈直徑（mm）TY11TY21藥物濃度

（μg/片）頭孢吡肟119118115環丙沙星11611715強力霉素112113130阿莫西林114111110復方新諾明1919123.71、1.25阿米卡星1918130慶大霉素1818110青霉素1917110鏈霉素1718110阿奇霉素1816115林可霉素151712利福平151315注：抑菌圈直徑10 mm 以下為耐藥（不敏感）；10～15 mm為中度敏感；15 mm以上為高度敏感。

3小結與討論

鴨疫里默氏桿菌初次分離培養，由于所需生長條件苛刻、病料不新鮮和鴨場大量使用抗生素等原因，往往不易分離到，因此，RA初次分離，病料的采取和培養條件的選擇至關重要。從分離過程中發現，在病鴨剛死亡或瀕臨死亡時無菌采取鴨腦組織和心血，且在TSA瓊脂培養基平板上37 ℃、5% CO2培養箱中培養24～48 h，病菌分離成功率較高。

血清型鑒定有利于疫苗的研究和RA 控制。由于RA 血清型較多，且各血清型之間的交叉保護性差， 因此，研制針對本地血清型的RA疫苗對于鴨疫里默氏桿菌的防治具有重要意義[7]。根據胡清海等人的調查，江蘇地區主要以1、2、10 型為主[8]。從本次試驗結果可知，泰州周邊地區規模鴨場分離的2株RA菌株均為血清1型，基本摸清了本地區流行RA菌株的優勢血清型，為研制相應血清型的疫苗、控制該病的發生奠定了理論基礎。

目前，鴨疫里默氏桿菌已成為國內危害養鴨業最嚴重的傳染病之一，大部分鴨場，尤其是肉鴨場都有此病發生。雖然 RA 對多種抗生素敏感，但極易產生耐藥性，而且不同地區、不同菌株對抗菌藥物的敏感性不一，給實際治療工作帶來困難，最好能對當地分離菌株進行藥敏試驗，以便選擇最佳藥物進行治療[9]。頭孢吡肟為新的第四代注射用頭孢菌素，對葡萄球菌屬和腸桿菌屬（尤其產氣和陰溝腸桿菌）的作用更強，對多種質粒介導和染色體介導的β內酰胺酶穩定，獸醫臨床應用較少。本次藥敏試驗結果表明，泰州地區鴨疫里默氏桿菌對頭孢吡肟和環丙沙星高度敏感，對氨基糖苷類抗生素如慶大霉素、丁胺卡那霉素、林可胺類抗生素和磺胺類抗生素等耐藥。因此，臨床選擇用藥時必須以藥敏試驗結果為依據，才能做到正確用藥，減少耐藥菌的產生，從而提高治愈率，減少經濟損失[10]，有條件的鴨場更應定期對環境中RA的藥敏特性進行監測，以便在發病時及時有效地用藥。

參考文獻：

[1]Calnek B W. 禽病學[M]. 11版. 高福，蘇敬良，索勛，等譯. 北京：中國農業出版社，2005：767-772.

[2]馬志偉，劉世超，許家榮，等. 鴨疫里默氏桿菌的分離、鑒定及培養條件優化[J]. 浙江農業科學，2010（5）：1123-1126，1155.

[3]Pathanasophon P，Phuektes P，Tanticharoenyos T，et al. A potential new serotype of Riemerella anatipestifer isolated from ducks in Thailand[J]. Avian Pathology，2002，31（3）：267-270.

[4]程安春，汪銘書，陳孝躍，等. 我國鴨疫里默氏桿菌血清型調查及新血清型的發現和病原特性[J]. 中國獸醫學報，2003，23（4）：320-323.

[5]劉穎，蘇敬良，劉文華，等. 鴨疫里默氏菌的藥物敏感性檢測[J]. 中國獸醫雜志，2005，41（5）：10-12.

[6]許金俊，范海峰，金文杰，等. 徐州地區鴨傳染性漿膜炎的病原分離鑒定及藥敏試驗[J]. 中國預防獸醫學報，2006，28（5）：503-506.

[7]呂敏娜，黃承鋒，張毓金. 鴨疫里默氏桿菌大腸桿菌二聯蜂膠苗的研制[J]. 中國獸醫雜志，2005，41（1）：48-50.

[8]胡清海，張知良，苗晉鋒，等. 江蘇安徽兩省鴨疫里默氏桿菌病的流行病學調查研究[J]. 中國獸醫科技，2001，31（8）：12-13.

[9]謝永平，陳澤祥，許力干，等. 鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及耐藥性研究[J]. 廣西農業科學，2010，41（7）：729-731.

[10]都振玉.濰坊地區鴨傳染性漿膜炎病原體的分離鑒定與疫苗制備應用研究[D]. 泰安：山東農業大學，2009：1-47.成鋼，王文龍，趙銘，等. 湖區波爾山羊常見寄生蟲病臨床診斷與綜合防控[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：170-171.

項目1結果1項目1結果1項目1結果乳糖1-1麥芽糖1-1M-R1-半乳糖1-1甘露醇1-1H2S1-覃糖1-1山梨醇1-1過氧化氫酶1+果糖1-1枸櫞酸鹽1-1尿素酶1-蔗糖1-1硝酸鹽還原1-1氧化酶1+棉子糖1-1檸檬酸鹽1-1吲哚1-葡萄糖1-1V-P1-1明膠液化1+

2.3血清型鑒定

將TY1和TY2株分別與鴨疫里默氏桿菌1～10型單因子陽性血清做玻片凝集試驗，兩菌株均與1型陽性血清出現清晰的乳白色絮狀凝集塊，與其他型陽性血清均不反應。由此鑒定，TY1和TY2株均為血清1型。

2.4藥敏試驗

由表2可見，TY1和TY2株對頭孢吡肟、環丙沙星高度敏感，對強力霉素、阿莫西林中度敏感，對復方新諾明、阿米卡星、慶大霉素、青霉素、鏈霉素、阿奇霉素、林可霉素、利福平耐藥。

表22株分離菌株的藥敏試驗結果

藥物名稱1抑菌圈直徑（mm）TY11TY21藥物濃度

（μg/片）頭孢吡肟119118115環丙沙星11611715強力霉素112113130阿莫西林114111110復方新諾明1919123.71、1.25阿米卡星1918130慶大霉素1818110青霉素1917110鏈霉素1718110阿奇霉素1816115林可霉素151712利福平151315注：抑菌圈直徑10 mm 以下為耐藥（不敏感）；10～15 mm為中度敏感；15 mm以上為高度敏感。

3小結與討論

鴨疫里默氏桿菌初次分離培養，由于所需生長條件苛刻、病料不新鮮和鴨場大量使用抗生素等原因，往往不易分離到，因此，RA初次分離，病料的采取和培養條件的選擇至關重要。從分離過程中發現，在病鴨剛死亡或瀕臨死亡時無菌采取鴨腦組織和心血，且在TSA瓊脂培養基平板上37 ℃、5% CO2培養箱中培養24～48 h，病菌分離成功率較高。

血清型鑒定有利于疫苗的研究和RA 控制。由于RA 血清型較多，且各血清型之間的交叉保護性差， 因此，研制針對本地血清型的RA疫苗對于鴨疫里默氏桿菌的防治具有重要意義[7]。根據胡清海等人的調查，江蘇地區主要以1、2、10 型為主[8]。從本次試驗結果可知，泰州周邊地區規模鴨場分離的2株RA菌株均為血清1型，基本摸清了本地區流行RA菌株的優勢血清型，為研制相應血清型的疫苗、控制該病的發生奠定了理論基礎。

目前，鴨疫里默氏桿菌已成為國內危害養鴨業最嚴重的傳染病之一，大部分鴨場，尤其是肉鴨場都有此病發生。雖然 RA 對多種抗生素敏感，但極易產生耐藥性，而且不同地區、不同菌株對抗菌藥物的敏感性不一，給實際治療工作帶來困難，最好能對當地分離菌株進行藥敏試驗，以便選擇最佳藥物進行治療[9]。頭孢吡肟為新的第四代注射用頭孢菌素，對葡萄球菌屬和腸桿菌屬（尤其產氣和陰溝腸桿菌）的作用更強，對多種質粒介導和染色體介導的β內酰胺酶穩定，獸醫臨床應用較少。本次藥敏試驗結果表明，泰州地區鴨疫里默氏桿菌對頭孢吡肟和環丙沙星高度敏感，對氨基糖苷類抗生素如慶大霉素、丁胺卡那霉素、林可胺類抗生素和磺胺類抗生素等耐藥。因此，臨床選擇用藥時必須以藥敏試驗結果為依據，才能做到正確用藥，減少耐藥菌的產生，從而提高治愈率，減少經濟損失[10]，有條件的鴨場更應定期對環境中RA的藥敏特性進行監測，以便在發病時及時有效地用藥。

參考文獻：

[1]Calnek B W. 禽病學[M]. 11版. 高福，蘇敬良，索勛，等譯. 北京：中國農業出版社，2005：767-772.

[2]馬志偉，劉世超，許家榮，等. 鴨疫里默氏桿菌的分離、鑒定及培養條件優化[J]. 浙江農業科學，2010（5）：1123-1126，1155.

[3]Pathanasophon P，Phuektes P，Tanticharoenyos T，et al. A potential new serotype of Riemerella anatipestifer isolated from ducks in Thailand[J]. Avian Pathology，2002，31（3）：267-270.

[4]程安春，汪銘書，陳孝躍，等. 我國鴨疫里默氏桿菌血清型調查及新血清型的發現和病原特性[J]. 中國獸醫學報，2003，23（4）：320-323.

[5]劉穎，蘇敬良，劉文華，等. 鴨疫里默氏菌的藥物敏感性檢測[J]. 中國獸醫雜志，2005，41（5）：10-12.

[6]許金俊，范海峰，金文杰，等. 徐州地區鴨傳染性漿膜炎的病原分離鑒定及藥敏試驗[J]. 中國預防獸醫學報，2006，28（5）：503-506.

[7]呂敏娜，黃承鋒，張毓金. 鴨疫里默氏桿菌大腸桿菌二聯蜂膠苗的研制[J]. 中國獸醫雜志，2005，41（1）：48-50.

[8]胡清海，張知良，苗晉鋒，等. 江蘇安徽兩省鴨疫里默氏桿菌病的流行病學調查研究[J]. 中國獸醫科技，2001，31（8）：12-13.

[9]謝永平，陳澤祥，許力干，等. 鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及耐藥性研究[J]. 廣西農業科學，2010，41（7）：729-731.

[10]都振玉.濰坊地區鴨傳染性漿膜炎病原體的分離鑒定與疫苗制備應用研究[D]. 泰安：山東農業大學，2009：1-47.成鋼，王文龍，趙銘，等. 湖區波爾山羊常見寄生蟲病臨床診斷與綜合防控[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：170-171.