甘草皂苷對卡拉庫爾羊血液中免疫球蛋白IgA和IgG的影響

劉俊峰　郭雪峰

摘要：為了研究甘草皂苷對卡拉庫爾羊血液中免疫球蛋白IgA和IgG的影響，探討甘草皂苷的免疫學效應。選取健康的卡拉庫爾羊6只，隨機分為2組，每組3只，平均體重為18.65 kg/只。飼養的第15、第30、第45天采集血液并分離血清，采用酶聯免疫吸附法檢測卡拉庫爾羊血清中免疫球蛋白IgA、IgG的水平。結果顯示：第15、第30、第45天的IgA試驗組含量分別為84.75、93.16、86.31 μg/mL，對照組含量分別為43.13、42.57、32.63 μg/mL，且試驗組顯著高于對照組（P<0.05）；IgG試驗組的含量分別為87.99、83.00、76.29 μg/mL，對照組的含量分別為46.05、43.57、41.55 μg/mL，且試驗組顯著高于對照組（P<0.05）。說明甘草皂苷可顯著提高卡拉庫爾羊血液中免疫球蛋白IgA、IgG的含量。

關鍵詞：甘草皂苷；卡拉庫爾羊；血液；IgA；IgG

中圖分類號： S858.262.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0172-02

收稿日期：2013-05-31

基金項目：新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室課題（編號：HS201106）；新疆生產建設兵團博士基金（編號：2009JC08）。

作者簡介：劉俊峰（1980—），男，內蒙古烏蘭察布人，碩士，講師，從事獸醫藥理與免疫藥理學研究。E-mail：liujunfeng423@163.com。

通信作者：郭雪峰，博士，副教授，從事反芻動物營養與飼料添加劑研究。E-mail：guoxuefeng807@163.com。甘草皂苷別稱甘草酸，是甘草的主要成分之一[1]，具有甜味（即甘草甜素），它屬于三萜類皂苷，為次生代謝產物。由于它的水溶液容易引起肥皂樣持久性泡沫，因此稱之為皂苷。隨著免疫學的迅速發展，對中草藥添加劑的免疫藥理研究也取得了較快的發展。國內外許多科學家對中草藥添加劑在人、畜疾病上的免疫，尤其是與免疫有關的疾病防治進行了大量的科學研究。例如，苜草素是一種苜蓿提取物，能增強免疫系統功能，相對減少了營養的沉積量[2]；黃芪皂苷能提高和促進調節機體免疫功能。另外，還有一些關于皂苷對人的免疫及其他應用的研究，如高血脂病人應用甘草甜素后，血漿免疫球蛋白IgG、IgA及補體C3含量均顯著降低，其作用主要為免疫增強、免疫調節和免疫抑制3種。皂苷成分類型多樣，結構復雜，性質不穩。

20世紀80年代，日本學者首次用試驗證明，甘草甜素可抑制HIV增殖，并具有免疫激活作用[3]。張嫻文等發現三七皂苷具有抗肝纖維化作用[4]。甘草皂苷主要具有增強巨噬細胞和細胞免疫的功能，但對體液免疫功能有抑制作用。甘草提取物抑制抗體的作用已經有不少報道，以羊的紅細胞作為抗原免疫動物，其注射后不久，受抑制反應就會明顯，而抑制程度與甘草提取物的劑量有關；甘草皂苷也可以促進羔羊生長，提高綿羊產毛量和產奶量；對綿羊疾病防治都有過研究，其效果也相對突出。本研究對卡拉庫爾羊飼喂添加甘草皂苷的日糧，采集卡拉庫爾羊血液并分離血清，測定免疫指標，旨在確定甘草皂苷對卡拉庫爾羊血液IgA和IgG的影響，為開發以甘草皂苷為主要成分的飼料添加劑提供基礎數據。

1材料與方法

1.1甘草皂苷的檢驗

1.1.1甘草的采集與前處理甘草于2012年3月在新疆阿克蘇阿拉爾市十二團隨機采集，將采集回來的甘草切成1～2 cm 的小段，曬至半干，再放于50 ℃恒溫箱中烘干，再將樣品放入精密粉碎機（xf-96b）中進行粉碎，重復2次，得到樣本，采用新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室已經建立的提取方法提取甘草皂苷。

1.1.2皂苷的檢測

1.1.2.1泡沫試驗取檢品的熱水溶液2 mL于帶塞試管中，用力振搖3 min，即產生持久性蜂窩狀泡沫（維持10 min以上），且泡沫量不少于液體體積的1/3。

1.1.2.2醋酐濃硫酸試驗取樣品水溶液并置于平皿中，于水浴上蒸干，殘渣加入少量冰醋酸使其溶解，再加入醋酐濃硫酸（19 ∶1）試液，呈現紅紫色并變成綠色。

1.1.2.3比色法[5]準確吸取標準品溶液，置于具塞試管中，水浴揮干溶劑，加入一定量的5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入定量的高氯酸，搖勻，于水浴中加熱，立即取出用流水冷卻至室溫，加入冰醋酸稀釋，搖勻，以不加標準品的樣品管為空白，于400～700 nm波長處進行掃描，香草醛高氯酸試劑在589 nm處有最大吸收峰，精密度高，加樣回收率99.23%。

1.2卡拉庫爾羊免疫球蛋白IgA、IgG的檢測

1.2.1試驗動物的飼養管理選取健康的卡拉庫爾羊6只，隨機分為2組，每組3只，平均體重為18.65 kg/只。試驗所用基礎日糧參照我國蘇尼特羊營養標準[6-7]配制，精糧組成為：玉米68.53%，麩皮3.08%，胡麻餅20.09%，預混料804%，食鹽0.27%；營養水平為：消化能8.41 MJ/kg，粗蛋白11%，鈣4.96%，磷2.93%。精粗比為30 ∶70，精料 0.30 kg/（只·d），粗料為棉籽殼0.26 kg/（只·d）及青貯 0.44 kg/（只·d）。甘草皂苷在日糧中的添加量為 150 mg/kg，甘草皂苷由新疆阿拉爾新農甘草產業有限責任公司按照試驗要求提供，經檢驗符合試驗標準。

1.2.2采血及血液處理靜脈采血5 mL，注入真空采血管，3 000 r/min離心10 min，取上清4 ℃冷藏待測。

1.2.3IgA、IgG檢測確定標準品中IgA的濃度梯度為160、80、40、20、10、5 μg/mL，IgG的濃度梯度則為64、32、16、8、4、2 μg/mL。由標準品稀釋5倍得到樣品稀釋液，用稀釋液濃度和D值共同繪制標準曲線。根據ELISA檢測試劑盒說明書，檢測卡拉庫爾羊血清樣品中IgA、IgG的含量。

1.3數據處理

試驗結果用“平均值±標準差”表示，數據統計分析采用SPSS 17.0軟件中的平衡試驗設計方差分析過程（ANOVA），均值的多重比較采用Duncans法進行，同時繪制標準曲線。

2結果與分析

2.1甘草皂苷提取結果檢測

由泡沫試驗、醋酐濃硫酸試驗、比色法證明試驗所的甘草提取物為甘草皂苷。

2.2甘草皂苷對卡拉庫爾羊IgA含量的影響

2.2.1IgA含量的擬合方程根據試劑盒說明書，利用紫外分光光度計，在波長450 nm、光徑1 cm下，蒸餾水調零，測定標品吸光度（x），擬合方程為y=0.051 1x+0.195 2（r2= 0.994 7），其中y為樣品IgA的含量，在0.05水平顯著，該方程符合試劑盒要求，可以以此為標準計算樣品中IgA含量。

2.2.2皂苷對IgA含量影響IgA為血清中的免疫球蛋白[7]，約占20%，結構有多體形態，免疫功能分為血清型和分泌型，缺乏會導致體液免疫降低。有研究表明，馬的血液中IgA含量為27.5～120 μg/mL，綿羊的正常IgA含量范圍為 10～150 μg/mL，而人的正常范圍在0～3 900 μg/mL。本試驗測得卡拉庫爾羊血液中IgA的含量在32～94 μg/mL范圍內，與其他動物結果一致，說明本試驗結果屬于正常范圍。由表1看出，在第15、第30、第45天測得試驗組卡拉庫爾羊血液中IgA含量均顯著大于對照組（P<0.05）。說明甘草皂苷能顯著提高卡拉庫爾羊血液中免疫球蛋白IgA含量。 表1添加甘草皂苷對卡拉庫爾羊血清中IgA的影響

組別1各試驗期血清中IgA含量（μg/mL）第15天1第30天1第45天1平均值對照組143.23±28.92a142.57±32.93a132.63±32.04a139.47±31.29a試驗組184.75±21.10b193.16±22.47b186.31±9.31b188.07±17.63b注：同列數據后標有不同小寫字母者表示差異顯著（P<0.05）。下表同。

2.3甘草皂苷對卡拉庫爾羊IgG含量的影響

2.3.1IgG含量的擬合方程根據試劑盒說明書擬合本試驗IgG回歸方程，放入紫外分光光度計，在波長450 nm、光徑1 cm下，蒸餾水調零，測定標品吸光度（x），擬合方程為y=0019 9x+0.232 7（r2=0.992 8），其中y為樣品IgG的含量，在0.05水平顯著，該方程符合試劑盒要求，可以此為標準計算樣品中IgG含量。

2.3.2甘草皂苷對卡拉庫爾羊血清中IgG含量的影響IgG是血清中的免疫球蛋白，是血清的主要抗體成分，約占血清的50%，其半壽命期為10.6～14.5 d，在機體免疫中起保護作用，大多具有抗菌、抗病毒等感染性疾病的作用。有研究表明，兔子的血液中IgG含量為17.5～800.0 μg/mL；小鼠血液中的IgG含量為12.5～40.0 μg/mL。本試驗測得卡拉庫爾羊血液中IgG含量在41～87 μg/mL之間，在報道的綿羊正常范圍（17～120 μg/mL）之內。由表2可知，第15、第30、第45天所測得的試驗組卡拉庫爾羊血清中IgG含量均大于對照組，且差異顯著（P<0.05）。說明本試驗在飼料中添加甘草皂苷能使卡拉庫爾羊的血液中IgG含量明顯升高。表2添加甘草皂苷對卡拉庫爾羊血清中IgG含量的影響

組別1血清中IgG含量（μg/mL）第15天1第30天1第45天1平均值對照組146.05±13.18a143.57±6.68a141.55±9.28a143.72±9.71a試驗組187.99±21.75b183.00±19.80b176.29±15.60b182.43±19.05b

3結論

甘草皂苷具有非特異性免疫調節作用，經研究發現，甘草皂苷能顯著提高小鼠對靜脈碳粒的廓清指數，說明其不僅具有增強網狀內皮系統的活性，同時具有非特異性免疫加強的作用，主要增強了細胞的免疫作用[8]，可選擇性地增強輔助性T細胞的增殖能力和活性，使CD4細胞增加、CD8細胞減少及胸腺外T淋巴細胞分化，對γ-干擾素產生誘發作用和NK細胞活化作用。但由于甘草皂苷同時具有類固醇作用，因而不能簡單地把它歸為免疫抑制劑，實際上它可能是具有雙向作用的免疫調節劑。本試驗在飼料中添加甘草皂苷 150 mg/kg 飼喂卡拉庫爾羊，能提高血液中的IgA、IgG含量，說明甘草皂苷能提高卡拉庫爾羊的免疫水平。因此，可進一步開展關于飼料添加劑應用的研究，以提供更多的基礎試驗數據。

參考文獻：

[1]葉靜，肖美添，湯須崇，等. HPLC-ELSD法測定甘草中3種甘草皂苷的含量[J]. 廣東藥學院學報，2009，25（4）：368-369.

[2]楊江濤，董曉芳，佟建明，等. 苜草素多糖、黃酮和皂苷對小鼠巨噬細胞防御素基因表達的影響[J]. 畜牧獸醫學報，2010，41（5）：608-614.

[3]李鐵民，梁再賦. 甘草提取物及其衍生物的抗病毒研究現狀[J]. 中草藥，1994，25（12）：655-658.

[4]張嫻文，李鳳賢，李輝. 三七皂苷抗肝纖維化作用的現狀[J]. 中國新藥雜志，2007，16（4）：260-263.

[5]張中偉，謝明勇，王遠興，等. 比色法測定苦瓜總皂苷[J]. 南昌大學學報：理科版，2005，29（5）：447-449，453.

[6]曹丙蕾. 山羊IL-18定量抗原捕獲ELISA檢測方法的建立及其免疫增強作用的研究[D]. 青島：山東農業大學，2010：51-53.

[7]Greene D M，Bondy G S，Azcona-Olivera J I，et al. Role of gender and strain in vomitoxin-induced dysregulation of IgA production and IgA nephropathy in the mouse[J]. Journal of Toxicology and Environmental Health，1994，43（1）：37-50.

[8]Yi H，Nakashima I，Isobe K. Enhancement of nitric oxide production from activated macrophages by glycyrrhizin[J]. The American Journal of Chinese Medicine，1996，24（3/4）：271-278.程培培，楊亞軍，劉希望，等. 新型復方氟苯尼考注射液的安全性評價[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：174-176.