分光光度法測定達氏鱘精子密度標準的研究

陳春娜　黃穎穎　陳先均　龍治?！《跑?/p>

摘要：通過比較分光光度計3種波長（380、530、780 nm）下吸光度（D）與精子密度（C）的關系，研究建立測定達氏鱘精子密度的方法，以加快精子計數程序的標準化。結果表明，在3種不同波長下，隨著精子密度增加，精子的吸光度也不斷增大；通過對精子密度與吸光度的關系進行回歸分析，發現精子密度與吸光度呈良好的對數關系，380 nm為最適檢測波長，其回歸方程為D380 nm=-7.212+0.513lnC（r2=0.975）。

關鍵詞：達氏鱘；精子；密度；分光光度法

中圖分類號： S965.215.12+2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0184-03

收稿日期：2013-05-23

基金項目：四川省財政基因工程青年基金（編號：2012QNJJ-016）。

作者簡介：陳春娜（1981—），女，四川自貢人，碩士，助理研究員，從事水產名特優繁育和魚類生理生化研究。E-mail：hc_1981_2001@sina.com。精子密度是評價精子質量的一個重要指標，不僅可以用來判斷精液品質的優劣，還直接關系到人工授精中精子用量的有效精子數。在受精過程中，精子濃度過低會降低受精率，過高會造成受精卵后期發育脫膜畸變。通過測定精子密度，可以在人工授精中建立最佳精卵比例，避免多精入卵[1-2]。同時，精子密度也是反應魚類繁殖潛力的重要指標，是優化個體遺傳潛力的主要考慮因素。此外，精子密度能顯著影響精子冷凍保存效果，正確測定精子密度有助于將精子稀釋至冷凍保存所需濃度范圍[3]，有利于精子冷凍保存。

測定精子密度最常見的方法有目測法、血球計數法和庫爾特顆粒計數法[4]。目測法雖然簡單，但十分不精確，計數法雖然精確，但費時、費力，在處理大量樣品時很難做到快速及時。用分光光度計測定精子密度，具有操作方法簡便、快速及結果準確等特點，在很多領域上都有應用，尤其是在家畜精子密度研究中應用較多[5-8]。有關測定水產動物精子密度的研究較少。國外應用分光光度法已建立了虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、白鰕虎魚（Leucopsarion petersi）、金鱸（Perca flavescens）、銀大麻哈魚（Oncorhynchus kisutch）、硬頭鱒（Salmo gairdneri、Oncorhynchus mykiss）、塞巴各湖鱒（Salmo salar m. sebago Girard）、花鱸（Lateolabrax japonicus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、西伯利亞鱘（Acipenser baerii）、小體鱘（Acipenser ruthenus）、牡蠣（Crassostorea gigas、Crassostrea virginica）和紫貽貝（Mytilus edulis）等水產動物精液密度和光密度的相關關系[9-17]，國內利用該方法建立了俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedtii）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）和中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）精子密度的標準曲線[4，18]。

達氏鱘（Acipenser dabryanus Dumeril）英文名Dabrys turgeon、Yangtze sturgeon，別稱長江鱘和沙臘子，是我國特有的淡水定居性鱘科鱘屬魚類[19]，分布于長江上游和金沙江下游，為國家一級重點保護動物、國際自然保護聯盟（IUCN）極危級（CR）物種、國際瀕危動植物種貿易公約（CITES）附錄Ⅱ保護物種、長江上游珍稀特有魚類國家級自然保護區的主要保護對象之一，具有很高的學術價值和生態價值。目前，國內外尚未見利用分光光度法測定達氏鱘精子密度的相關報道。本研究探討了不同波長和密度下吸光度與精子密度之間的關系，旨在建立分光光度法測定達氏鱘精子密度的標準化方法，以便于快速檢測精子密度。

1材料與方法

1.1材料

性成熟雄性達氏鱘親魚為四川省農業科學院水產研究所養殖，2012年4月經注射催產，采取腹部擠壓法收集精液，確保精液不含尿液等雜質。收集得到的精液保存在干燥的離心管中，于4 ℃下保存。

1.2方法

以0.65% NaCl為稀釋液，將鮮精液分別稀釋成10份濃度梯度不同的樣品，利用紫外可見分光光度計（島津 UVmini-1240 ）分別在波長380、530、780 nm處測吸光度，每一樣品在同一波長下測定3次，取平均值作為該樣品的吸光度（D），以0.65% NaCl溶液做空白，用血球計數板分別計數每個濃度梯度的樣品濃度（C）。

1.3數據分析

試驗數據采用Excel及SPSS統計軟件進行分析處理，并進行回歸差異檢驗和比較。

2結果與分析

由圖1可見，在3種不同波長下，隨著精子密度增加，精子的吸光度也不斷增大；當精子密度小于1×106個/mL時，吸光度變化不大，因此確定1×106個/mL為檢測下限。通過對精子密度與吸光度關系的回歸分析發現，精子密度與吸光度呈良好的對數關系，其回歸方程為D=a+blnC，將對數函數進行線性變換：Y=a+bX，其中Y=D，X=lnC。3種波長下精子密度與吸光度的相關系數都較高，其回歸方程分別為D380 nm=-7.212+0513lnC（r2=0.975）；D530 nm=-6.969+0.492lnC（r2=0968）；D780 nm=-6.504+0.454lnC（r2=0953）。

波長為380 nm時，達氏鱘精子密度與吸光度回歸方程的判定系數r2=0. 975，高于波長530 nm和780 nm時回歸方程的判定系數，這表明380 nm為最適檢測波長。對回歸方程回歸系數和常數項的顯著性檢驗結果表明，精子密度對數與吸光度間存在著顯著的正線性關系。

3小結與討論

3.1不同回歸模型及不同波長下精子密度與吸光度的回歸關系

研究發現，精子密度與吸光度隨著種類的不同而呈現不同的函數關系：豬呈三次函數回歸關系、牛呈二項式回歸關系、羊呈線形回歸關系、太平洋牡蠣呈對數回歸關系、紫貽貝呈線形回歸關系、俄羅斯鱘呈對數回歸關系[4，6-8，15，17]。本研究中達氏鱘精子密度與吸光度的分布趨勢以對數函數曲線擬合時相關性最為顯著，通過變換能將對數函數轉換為線性函數，利用該曲線方程能通過吸光度快速準確地推算精子密度。

測定時選擇合適的波長尤為重要。精液由多種成分組成，在任一波長下的吸光度是全部組分之和，通常吸光度在最適波長時有1個比較寬的波峰，得到的回歸方程相關系數也比較高[20]，已報道測定精子濃度的波長范圍大多選用375～630 nm[21]，如太平洋牡蠣最適波長為581 nm、紫貽貝為 320 nm、大菱鲆為420 nm、俄羅斯鱘為530 nm、三疣梭子蟹和中華絨螯蟹為520 nm[4，13，15，17-18，21]。本研究采用了3種可見光波長380、530、780 nm，發現在380 nm波長下得到的回歸方程相關系數較高，380 nm為最佳檢測波長。

3.2影響分光光度計測定精子密度精確度的因素

分光光度法測定精子密度可以廣泛應用于水產動物精子質量評估、人工繁殖、精子冷凍保存和遺傳育種等方面，但是在使用分光光度計檢測精子密度的過程中，會受到一些因素的影響。

在測定時，需要將精液稀釋成不同濃度的精子懸液，研究發現，當加入不同濃度的稀釋液時，精子會呈現出不同的運動水平，運動水平的快慢會直接影響精子懸液形成的時間，從而會影響到吸光度的讀數[22]，因此在選擇稀釋液濃度時，應盡可能選擇抑制精子運動的最低濃度。精液稀釋的比例是影響光度計測定精子密度精確度的另一因素[21]，由于受光度計示值范圍因素的影響，精液濃度過高會超出檢測儀器的最大量程，濃度過低會使吸光度變化不大，濃度過高或過低均會造成較大的測定誤差，因此應根據光度計的示值范圍確定稀釋倍數。由于受稀釋方式、量器精度等因素的影響，用于稀釋的精液量也會造成不同程度的測量誤差，從而影響分析結果的準確性，因此，用于稀釋的精液體積一定要精確[9]。另外，在測量開始時，精子由于重力作用，可能在樣品中分布不均，因此，在測定濃度和吸光度之前，精子懸液是否充分搖勻也會影響讀數。在收集精液的過程中還要注意防止尿液等物質污染精液，這些污染物也會影響到精確度。

因此，為使分光光度計測定精子密度更精確，在精液樣本的準備階段和測量過程中都應嚴格按標準程序進行。

3.3測定精子密度在達氏鱘研究中的重要性

達氏鱘是一類較大型的魚類，性成熟年齡長，種群中存在著“生殖間期”的現象，即當年產卵的親魚第2年可能不會產卵。如何利用好當年性成熟的個體，在人工繁殖中提高卵的受精率與孵化率，精子用量及精卵比例在人工授精過程中就顯得十分重要。精子濃度過低受精率會偏低，過高則部分受精卵會出現脫膜畸變[2]。因為同一尾鱘魚不同時間段采集到的精液濃度不一致[4]，在自然產卵季節，在實際生產中不能以精液體積作為精液用量的依據，對于采集到的精液，可以運用分光光度計法對其質量進行評估，快速、準確測定達氏鱘精子密度，確定最適精卵比例，為人工授精精子用量提供參考。

目前，達氏鱘的人工繁殖親本仍取自自然繁殖種群。因環境因子等破壞，達氏鱘自然繁殖群體數量已處于瀕危狀態，且雌雄性比嚴重失調，雄性比例顯著下降。為保護好達氏鱘的種質資源，開展精液的冷凍保存技術在達氏鱘研究中顯得十分必要，而精子密度則是影響精子冷凍保存的關鍵因素之一。在水生動物精子的短期保存中，有研究發現，精子密度越高，活力保持越長，這是因為精子存活期間消耗的氧是固定的，濃度高的精液會降低體系溶解氧，有利于保存精子的能量物質[23-25]。在水生動物精子超低溫冷凍保存研究中發現，由于缺乏統一的精子濃度標準，即使是在相同的試驗條件下，同一物種中成功冷凍保存的方案也很難重復[3]。因此，可以利用分光光度計快速、精確測定精液濃度，為今后達氏鱘精子超低溫冷凍保存中精液用量提供統一的量化范圍，為該種群資源保護起到指導性作用。

參考文獻：

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