分光光度法測(cè)定達(dá)氏鱘精子密度標(biāo)準(zhǔn)的研究

陳春娜　黃穎穎　陳先均　龍治海　杜軍

摘要：通過(guò)比較分光光度計(jì)3種波長(zhǎng)（380、530、780 nm）下吸光度（D）與精子密度（C）的關(guān)系，研究建立測(cè)定達(dá)氏鱘精子密度的方法，以加快精子計(jì)數(shù)程序的標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果表明，在3種不同波長(zhǎng)下，隨著精子密度增加，精子的吸光度也不斷增大；通過(guò)對(duì)精子密度與吸光度的關(guān)系進(jìn)行回歸分析，發(fā)現(xiàn)精子密度與吸光度呈良好的對(duì)數(shù)關(guān)系，380 nm為最適檢測(cè)波長(zhǎng)，其回歸方程為D380 nm=-7.212+0.513lnC（r2=0.975）。

關(guān)鍵詞：達(dá)氏鱘；精子；密度；分光光度法

中圖分類號(hào)： S965.215.12+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0184-03

收稿日期：2013-05-23

基金項(xiàng)目：四川省財(cái)政基因工程青年基金（編號(hào)：2012QNJJ-016）。

作者簡(jiǎn)介：陳春娜（1981—），女，四川自貢人，碩士，助理研究員，從事水產(chǎn)名特優(yōu)繁育和魚(yú)類生理生化研究。E-mail：hc_1981_2001@sina.com。精子密度是評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，不僅可以用來(lái)判斷精液品質(zhì)的優(yōu)劣，還直接關(guān)系到人工授精中精子用量的有效精子數(shù)。在受精過(guò)程中，精子濃度過(guò)低會(huì)降低受精率，過(guò)高會(huì)造成受精卵后期發(fā)育脫膜畸變。通過(guò)測(cè)定精子密度，可以在人工授精中建立最佳精卵比例，避免多精入卵[1-2]。同時(shí)，精子密度也是反應(yīng)魚(yú)類繁殖潛力的重要指標(biāo)，是優(yōu)化個(gè)體遺傳潛力的主要考慮因素。此外，精子密度能顯著影響精子冷凍保存效果，正確測(cè)定精子密度有助于將精子稀釋至冷凍保存所需濃度范圍[3]，有利于精子冷凍保存。

測(cè)定精子密度最常見(jiàn)的方法有目測(cè)法、血球計(jì)數(shù)法和庫(kù)爾特顆粒計(jì)數(shù)法[4]。目測(cè)法雖然簡(jiǎn)單，但十分不精確，計(jì)數(shù)法雖然精確，但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，在處理大量樣品時(shí)很難做到快速及時(shí)。用分光光度計(jì)測(cè)定精子密度，具有操作方法簡(jiǎn)便、快速及結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，在很多領(lǐng)域上都有應(yīng)用，尤其是在家畜精子密度研究中應(yīng)用較多[5-8]。有關(guān)測(cè)定水產(chǎn)動(dòng)物精子密度的研究較少。國(guó)外應(yīng)用分光光度法已建立了虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、白鰕虎魚(yú)（Leucopsarion petersi）、金鱸（Perca flavescens）、銀大麻哈魚(yú)（Oncorhynchus kisutch）、硬頭鱒（Salmo gairdneri、Oncorhynchus mykiss）、塞巴各湖鱒（Salmo salar m. sebago Girard）、花鱸（Lateolabrax japonicus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、西伯利亞鱘（Acipenser baerii）、小體鱘（Acipenser ruthenus）、牡蠣（Crassostorea gigas、Crassostrea virginica）和紫貽貝（Mytilus edulis）等水產(chǎn)動(dòng)物精液密度和光密度的相關(guān)關(guān)系[9-17]，國(guó)內(nèi)利用該方法建立了俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedtii）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）和中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）精子密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線[4，18]。

達(dá)氏鱘（Acipenser dabryanus Dumeril）英文名Dabrys turgeon、Yangtze sturgeon，別稱長(zhǎng)江鱘和沙臘子，是我國(guó)特有的淡水定居性鱘科鱘屬魚(yú)類[19]，分布于長(zhǎng)江上游和金沙江下游，為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物、國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）極危級(jí)（CR）物種、國(guó)際瀕危動(dòng)植物種貿(mào)易公約（CITES）附錄Ⅱ保護(hù)物種、長(zhǎng)江上游珍稀特有魚(yú)類國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的主要保護(hù)對(duì)象之一，具有很高的學(xué)術(shù)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)利用分光光度法測(cè)定達(dá)氏鱘精子密度的相關(guān)報(bào)道。本研究探討了不同波長(zhǎng)和密度下吸光度與精子密度之間的關(guān)系，旨在建立分光光度法測(cè)定達(dá)氏鱘精子密度的標(biāo)準(zhǔn)化方法，以便于快速檢測(cè)精子密度。

1材料與方法

1.1材料

性成熟雄性達(dá)氏鱘親魚(yú)為四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖，2012年4月經(jīng)注射催產(chǎn)，采取腹部擠壓法收集精液，確保精液不含尿液等雜質(zhì)。收集得到的精液保存在干燥的離心管中，于4 ℃下保存。

1.2方法

以0.65% NaCl為稀釋液，將鮮精液分別稀釋成10份濃度梯度不同的樣品，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津 UVmini-1240 ）分別在波長(zhǎng)380、530、780 nm處測(cè)吸光度，每一樣品在同一波長(zhǎng)下測(cè)定3次，取平均值作為該樣品的吸光度（D），以0.65% NaCl溶液做空白，用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)每個(gè)濃度梯度的樣品濃度（C）。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel及SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，并進(jìn)行回歸差異檢驗(yàn)和比較。

2結(jié)果與分析

由圖1可見(jiàn)，在3種不同波長(zhǎng)下，隨著精子密度增加，精子的吸光度也不斷增大；當(dāng)精子密度小于1×106個(gè)/mL時(shí)，吸光度變化不大，因此確定1×106個(gè)/mL為檢測(cè)下限。通過(guò)對(duì)精子密度與吸光度關(guān)系的回歸分析發(fā)現(xiàn)，精子密度與吸光度呈良好的對(duì)數(shù)關(guān)系，其回歸方程為D=a+blnC，將對(duì)數(shù)函數(shù)進(jìn)行線性變換：Y=a+bX，其中Y=D，X=lnC。3種波長(zhǎng)下精子密度與吸光度的相關(guān)系數(shù)都較高，其回歸方程分別為D380 nm=-7.212+0513lnC（r2=0.975）；D530 nm=-6.969+0.492lnC（r2=0968）；D780 nm=-6.504+0.454lnC（r2=0953）。

波長(zhǎng)為380 nm時(shí)，達(dá)氏鱘精子密度與吸光度回歸方程的判定系數(shù)r2=0. 975，高于波長(zhǎng)530 nm和780 nm時(shí)回歸方程的判定系數(shù)，這表明380 nm為最適檢測(cè)波長(zhǎng)。對(duì)回歸方程回歸系數(shù)和常數(shù)項(xiàng)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，精子密度對(duì)數(shù)與吸光度間存在著顯著的正線性關(guān)系。

3小結(jié)與討論

3.1不同回歸模型及不同波長(zhǎng)下精子密度與吸光度的回歸關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)，精子密度與吸光度隨著種類的不同而呈現(xiàn)不同的函數(shù)關(guān)系：豬呈三次函數(shù)回歸關(guān)系、牛呈二項(xiàng)式回歸關(guān)系、羊呈線形回歸關(guān)系、太平洋牡蠣呈對(duì)數(shù)回歸關(guān)系、紫貽貝呈線形回歸關(guān)系、俄羅斯鱘呈對(duì)數(shù)回歸關(guān)系[4，6-8，15，17]。本研究中達(dá)氏鱘精子密度與吸光度的分布趨勢(shì)以對(duì)數(shù)函數(shù)曲線擬合時(shí)相關(guān)性最為顯著，通過(guò)變換能將對(duì)數(shù)函數(shù)轉(zhuǎn)換為線性函數(shù)，利用該曲線方程能通過(guò)吸光度快速準(zhǔn)確地推算精子密度。

測(cè)定時(shí)選擇合適的波長(zhǎng)尤為重要。精液由多種成分組成，在任一波長(zhǎng)下的吸光度是全部組分之和，通常吸光度在最適波長(zhǎng)時(shí)有1個(gè)比較寬的波峰，得到的回歸方程相關(guān)系數(shù)也比較高[20]，已報(bào)道測(cè)定精子濃度的波長(zhǎng)范圍大多選用375～630 nm[21]，如太平洋牡蠣最適波長(zhǎng)為581 nm、紫貽貝為 320 nm、大菱鲆為420 nm、俄羅斯鱘為530 nm、三疣梭子蟹和中華絨螯蟹為520 nm[4，13，15，17-18，21]。本研究采用了3種可見(jiàn)光波長(zhǎng)380、530、780 nm，發(fā)現(xiàn)在380 nm波長(zhǎng)下得到的回歸方程相關(guān)系數(shù)較高，380 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2影響分光光度計(jì)測(cè)定精子密度精確度的因素

分光光度法測(cè)定精子密度可以廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物精子質(zhì)量評(píng)估、人工繁殖、精子冷凍保存和遺傳育種等方面，但是在使用分光光度計(jì)檢測(cè)精子密度的過(guò)程中，會(huì)受到一些因素的影響。

在測(cè)定時(shí)，需要將精液稀釋成不同濃度的精子懸液，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入不同濃度的稀釋液時(shí)，精子會(huì)呈現(xiàn)出不同的運(yùn)動(dòng)水平，運(yùn)動(dòng)水平的快慢會(huì)直接影響精子懸液形成的時(shí)間，從而會(huì)影響到吸光度的讀數(shù)[22]，因此在選擇稀釋液濃度時(shí)，應(yīng)盡可能選擇抑制精子運(yùn)動(dòng)的最低濃度。精液稀釋的比例是影響光度計(jì)測(cè)定精子密度精確度的另一因素[21]，由于受光度計(jì)示值范圍因素的影響，精液濃度過(guò)高會(huì)超出檢測(cè)儀器的最大量程，濃度過(guò)低會(huì)使吸光度變化不大，濃度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)造成較大的測(cè)定誤差，因此應(yīng)根據(jù)光度計(jì)的示值范圍確定稀釋倍數(shù)。由于受稀釋方式、量器精度等因素的影響，用于稀釋的精液量也會(huì)造成不同程度的測(cè)量誤差，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，用于稀釋的精液體積一定要精確[9]。另外，在測(cè)量開(kāi)始時(shí)，精子由于重力作用，可能在樣品中分布不均，因此，在測(cè)定濃度和吸光度之前，精子懸液是否充分搖勻也會(huì)影響讀數(shù)。在收集精液的過(guò)程中還要注意防止尿液等物質(zhì)污染精液，這些污染物也會(huì)影響到精確度。

因此，為使分光光度計(jì)測(cè)定精子密度更精確，在精液樣本的準(zhǔn)備階段和測(cè)量過(guò)程中都應(yīng)嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。

3.3測(cè)定精子密度在達(dá)氏鱘研究中的重要性

達(dá)氏鱘是一類較大型的魚(yú)類，性成熟年齡長(zhǎng)，種群中存在著“生殖間期”的現(xiàn)象，即當(dāng)年產(chǎn)卵的親魚(yú)第2年可能不會(huì)產(chǎn)卵。如何利用好當(dāng)年性成熟的個(gè)體，在人工繁殖中提高卵的受精率與孵化率，精子用量及精卵比例在人工授精過(guò)程中就顯得十分重要。精子濃度過(guò)低受精率會(huì)偏低，過(guò)高則部分受精卵會(huì)出現(xiàn)脫膜畸變[2]。因?yàn)橥晃谗\魚(yú)不同時(shí)間段采集到的精液濃度不一致[4]，在自然產(chǎn)卵季節(jié)，在實(shí)際生產(chǎn)中不能以精液體積作為精液用量的依據(jù)，對(duì)于采集到的精液，可以運(yùn)用分光光度計(jì)法對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，快速、準(zhǔn)確測(cè)定達(dá)氏鱘精子密度，確定最適精卵比例，為人工授精精子用量提供參考。

目前，達(dá)氏鱘的人工繁殖親本仍取自自然繁殖種群。因環(huán)境因子等破壞，達(dá)氏鱘自然繁殖群體數(shù)量已處于瀕危狀態(tài)，且雌雄性比嚴(yán)重失調(diào)，雄性比例顯著下降。為保護(hù)好達(dá)氏鱘的種質(zhì)資源，開(kāi)展精液的冷凍保存技術(shù)在達(dá)氏鱘研究中顯得十分必要，而精子密度則是影響精子冷凍保存的關(guān)鍵因素之一。在水生動(dòng)物精子的短期保存中，有研究發(fā)現(xiàn)，精子密度越高，活力保持越長(zhǎng)，這是因?yàn)榫哟婊钇陂g消耗的氧是固定的，濃度高的精液會(huì)降低體系溶解氧，有利于保存精子的能量物質(zhì)[23-25]。在水生動(dòng)物精子超低溫冷凍保存研究中發(fā)現(xiàn)，由于缺乏統(tǒng)一的精子濃度標(biāo)準(zhǔn)，即使是在相同的試驗(yàn)條件下，同一物種中成功冷凍保存的方案也很難重復(fù)[3]。因此，可以利用分光光度計(jì)快速、精確測(cè)定精液濃度，為今后達(dá)氏鱘精子超低溫冷凍保存中精液用量提供統(tǒng)一的量化范圍，為該種群資源保護(hù)起到指導(dǎo)性作用。

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