3株鱸魚體表可疑性致病真菌的分離鑒定與生物學(xué)特性

魏福倫　朱里鵬　王慶容

摘要：以患病鱸魚為材料，從中分離出7株真菌，再篩選出3株真菌，采用形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)方法對(duì)它們進(jìn)行鑒定；進(jìn)一步對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，確定其生長(zhǎng)的最適溫度和pH值。鑒定結(jié)果表明，篩選出的3株真菌分別為斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum）、變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）和銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）。毛霉生長(zhǎng)的最適溫度是25 ℃左右，低于5 ℃或高于37 ℃均不生長(zhǎng)；低于10 ℃時(shí)枝孢霉菌絲不萌發(fā)生長(zhǎng)，而高于37 ℃對(duì)其生長(zhǎng)影響不大。分離到的3種菌株生長(zhǎng)的最適pH值是中性偏酸性。

關(guān)鍵詞：鱸魚；可疑性致病真菌；分離鑒定；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)： S917.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0187-03

收稿日期：2013-05-08

基金項(xiàng)目：貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目[編號(hào)：黔科合人才團(tuán)隊(duì)（2012）4004]；貴州省遵義市科技局項(xiàng)目[編號(hào)：遵市科合社字（2009）26號(hào)]。

作者簡(jiǎn)介：魏福倫（1964—），男，貴州習(xí)水人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng)及病害預(yù)防的教學(xué)和研究工作。E-mail：1050089863@qq.com。

通信作者：王慶容，副教授，主要從事魚類分子生物學(xué)及病害預(yù)防的研究工作。E-mail：wqr_1025@163.com。鱸魚（Lateolabrax japonicus）屬于脊索動(dòng)物門、魚綱，別稱花鱸、鱸板、花寨、鱸子魚，為常見的經(jīng)濟(jì)魚類之一，也是發(fā)展海水養(yǎng)殖的品種[1]。它主要生活在近岸淺海中下層，常棲息于河口咸淡水處，也可生活于淡水中。春夏間幼魚有成群溯河習(xí)性，冬季返歸海中，主食魚、蝦類。真菌性疾病是困擾鱸魚養(yǎng)殖較嚴(yán)重的病害之一[1]，其危害遍及鱸魚身體的各個(gè)部分，但最常見的危害部位是體表，所以對(duì)鱸魚體表寄生的真菌進(jìn)行分離和鑒定顯得尤為重要。

真菌是與人們的生產(chǎn)和生活密切相關(guān)的類群，許多種類可以食用和藥用，但也有有害的一面，如引起人、畜中毒，尤其是引起皮膚病和內(nèi)臟病等。為了更好地開發(fā)利用或預(yù)防它們，對(duì)它們作出準(zhǔn)確的鑒定尤為必要。大部分菌物的種類多、分布廣、形態(tài)特征復(fù)雜，且少數(shù)生理生化指標(biāo)和形態(tài)特征會(huì)隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定，導(dǎo)致鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力并且不準(zhǔn)確。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等相關(guān)學(xué)科的迅速發(fā)展，一系列分子生物學(xué)方法逐漸被應(yīng)用到真菌的分類鑒定中[2]，其中rDNA序列分析是目前真菌分類鑒定中常用的方法，它通過測(cè)定真菌rDNA序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)，將其輸入GenBank數(shù)據(jù)庫與同源序列比較來確定其種屬關(guān)系。將傳統(tǒng)分類方法與分子鑒定相結(jié)合，可以使真菌分類鑒定更加快速、穩(wěn)定、可靠。本研究以患病鱸魚為材料，先擴(kuò)增分離所得菌株的18S rRNA基因，測(cè)定其序列，將測(cè)序結(jié)果輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，通過同源性比對(duì)確定該菌株所在的屬，再根據(jù)其形態(tài)特征和顯微結(jié)構(gòu)鑒定到種。在此基礎(chǔ)上，初步研究它們?cè)诓煌瑴囟群蚿H值的生長(zhǎng)狀況，為更好地開發(fā)利用或預(yù)防它們提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

烏江偏巖河段網(wǎng)箱養(yǎng)殖場(chǎng)的病害鱸魚。

1.2菌株的分離和培養(yǎng)

選取幾條體表有真菌侵害癥狀的鱸魚，分別用無菌水清洗后，用滅菌棉簽蘸取損傷部位，用劃線法接種到的PDA平板上（每次接種設(shè)3個(gè)重復(fù)）。25 ℃培養(yǎng)，待其長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落劃線轉(zhuǎn)接到另一PDA平板上，多次轉(zhuǎn)板直到培養(yǎng)基上只生長(zhǎng)1種菌落。

1.3菌株的分子鑒定

1.3.1真菌DNA的提取將篩選出的真菌接種于PDA平板培養(yǎng)基上常溫下培養(yǎng)3 d，從平板上挑取新鮮菌絲放于研磨鍋中，加入700 μL的2%CTAB溶液，用滅菌石英砂研磨菌絲體，轉(zhuǎn)移于2 mL的EP管中，在恒溫水浴鍋上于65 ℃下保溫30 min（每10 min振蕩1次），離心加等體積氯仿-異戊醇混合液（氯仿 ∶異戊醇體積比24 ∶1）輕輕充分搖勻，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min。取上清液至一新EP管中，加等體積的異丙醇在常溫下靜置30 min，12 000 r/min離心10 min。取上清液至一新EP管中，加2倍體積的75%乙醇沉淀DNA，7 500 r/min 離心5 min，倒去上清液后，在室溫下晾干，將DNA溶解于50 μL TE緩沖液中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.218S rRNA基因的PCR擴(kuò)增擴(kuò)增使用的引物是通用引物NS1與NS6[3]，NS1引物序列為5′-ACCGGAATTCGCCTGAGAAACGGCTACCAC-3′，NS6引物序列為5′-ACCGGAATTCGGCAGGAGCGTAATCAACGC-3′。PCR 擴(kuò)增體系（50 μL）：10 μmol/L引物各2 μL，Taq 酶 0.5 μL，dNTP 4 μL，10× buffer 5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 34.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，59 ℃復(fù)性 50 s，72 ℃ 延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序引物為擴(kuò)增引物，測(cè)序方法為引物行走法。

1.3.3菌株的分子鑒定將菌株的18S rRNA基因序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，用BLAST工具對(duì)序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，同時(shí)用MEGA 5.1進(jìn)行分子發(fā)育系統(tǒng)樹的構(gòu)建。

1.4菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將真菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～12 d，每天觀察菌落形態(tài)與顏色，再在顯微鏡下觀察其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子梗著生情況及孢子形態(tài)、大小、顏色等。

1.5菌株的生物學(xué)特性初步研究

1.5.1菌株在不同溫度的生長(zhǎng)狀況將真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培養(yǎng)3～12 d，觀察菌株的生長(zhǎng)狀況。

1.5.2菌株在不同pH值下的生長(zhǎng)狀況將真菌接種在pH值4、5、6、7、8、9，10、11的PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃下培養(yǎng) 3～12 d，觀察菌株的生長(zhǎng)狀況。

2結(jié)果與分析

2.1鱸魚體表可疑性致病真菌的分離結(jié)果

從鱸魚體表一共分離出7株可疑性致病真菌，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號(hào)為鱸體表1、鱸體表3、鱸體表7。

2.2菌株18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及分子鑒定結(jié)果

3個(gè)菌株18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1，3個(gè)菌株都擴(kuò)增出約1 500 bp的片段。將3個(gè)菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中（鱸體表1的登錄號(hào)為KC977560，鱸體表3的登錄號(hào)為KC977562，鱸體表7的登錄號(hào)為KC977559），分子鑒定結(jié)果見表1。將3個(gè)菌株18S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的同源序列用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。從表1和圖2可以看出，鱸體表1屬于枝孢屬，鱸體表3和鱸體表7屬于毛霉屬。

2.3菌株的形態(tài)觀察

2.3.1鱸體表1的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上，菌落直徑為1.30～1.45cm，鼠灰色絨毛狀，中央高凸，呈紐扣狀，表面

有不規(guī)則皺褶，37℃生長(zhǎng)良好。在Sabouand培養(yǎng)基上，菌落稍大，灰棕色絨毛狀，背面黑色（圖3-a）。菌絲灰棕色，叢

生，不分隔（圖3-b）。分生孢子橢圓形、枝孢梨形、鏈生，形成彎曲的芽生孢子短鏈（圖3-c、圖3-d）。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，初步鑒定該菌株為叢梗孢目（Miniliales）、暗色孢科（Dematiaceae）、枝孢屬（Cladosporium）的斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum）[4]。2.3.2鱸體表3的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)迅速，無假根，孢子囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，孢子囊梗分枝，全部頂生孢子囊（圖4-a）；菌叢較高，軟弱，先呈白色，后變灰色或褐色；孢子囊梗多分枝，常無菌絲孢子，囊膜易融化，主梗不作軸狀分枝。孢子囊多孢子，灰褐色，有囊軸（圖4-b）；孢子囊大，球形，孢囊孢子形狀不規(guī)則，卵形至圓形，壁薄，平滑（圖4-c）。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，初步鑒定該菌株為毛霉目（Mucorales）、 毛霉科（Mucoraceae）、 毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）的變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）[5]。

2.3.3鱸體表7的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～12 d，菌絲萌發(fā)時(shí)白色，后變?yōu)辄S色轉(zhuǎn)褐色，背面磚紅色。菌絲生長(zhǎng)迅速，無假根，孢囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，菌絲全部頂生孢子囊，褐色，孢子囊梗長(zhǎng)，合軸分枝（圖5-a）；孢子囊大，球形，頂生，囊柄易凋萎（圖5-b）；孢子囊多孢子，球形，含孢子甚多，灰褐色，有囊軸；孢囊孢子橢圓形，壁薄，平滑（圖5-c）。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，初步鑒定該菌株為毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）、毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）的銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）[5]。

2.4可疑性致病真菌的生物學(xué)特性

2.4.1不同溫度對(duì)3種真菌生長(zhǎng)速率的影響由表2可以看出，不同溫度條件下不同真菌的生長(zhǎng)速率不同：3種菌株在5 ℃時(shí)都基本不萌發(fā)，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，真菌生長(zhǎng)速率加快，25 ℃左右是真菌生長(zhǎng)的最適溫度。37 ℃以上時(shí)，枝孢屬的鱸體表1生長(zhǎng)旺盛，生長(zhǎng)速率幾乎不受影響，而毛霉屬的鱸體表3和鱸體表7幾乎不能生長(zhǎng)。

表2不同溫度對(duì)3種真菌生長(zhǎng)速率的影響

菌株編號(hào)1不同溫度下的生長(zhǎng)速率（cm/d）5 ℃110 ℃115 ℃120 ℃125 ℃130 ℃137 ℃鱸體表11—1—10.2310.2510.3810.3710.40鱸體表31—10.5211.2211.5412.4511.831—鱸體表71—10.5111.1211.4012.0111.731—

2.4.2不同pH值對(duì)3種真菌生長(zhǎng)速率的影響由表3可以看出，不同pH值條件下不同真菌的生長(zhǎng)速率不同：3種菌株在pH值為4～7時(shí)均能生長(zhǎng)，鱸體表1和鱸體表7在pH值為5時(shí)生長(zhǎng)最快，鱸體表3在pH值為6時(shí)生長(zhǎng)最快，在其他pH值條件下生長(zhǎng)速率有所下降。總體來說，分離到的3種菌

3討論

從患病鱸魚體表中共分離出7株真菌，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號(hào)為鱸體表1、鱸體表3、鱸體表7，根據(jù)分子鑒定結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定出鱸體表1屬于枝孢屬（Cladosporium），鱸體表3和鱸體表7屬于毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）。再結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)一步確定鱸體表1為斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum），鱸體表3為變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）， 鱸體表7為銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）。真菌的種類多、分布廣、形態(tài)特征復(fù)雜，且少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)隨著環(huán)境的變

化而不穩(wěn)定，可能造成鑒定結(jié)果有一定偏差，增加了鑒定難度，今后可以嘗試用多種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以求增加鑒定結(jié)果的可靠性。

對(duì)分離并鑒定的3種菌株進(jìn)行生物學(xué)特性的初步研究，將菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度下恒溫培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)毛霉生長(zhǎng)的最適溫度是25 ℃左右，低于5 ℃或高于37 ℃均不生長(zhǎng)；低于10 ℃時(shí)枝孢霉菌絲不萌發(fā)生長(zhǎng)，而高于37 ℃對(duì)其生長(zhǎng)影響不大。將菌株接種到不同pH值的PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)分離到的3種菌株生長(zhǎng)的最適pH值是中性偏酸性。

鱸魚體表常見的真菌性疾病是水霉病，病原是水霉科的某些種類[6]。本研究從鱸魚體表的病害部位采集標(biāo)本，共分離到7種菌株，根據(jù)肉眼觀察菌落形態(tài)進(jìn)行取舍，在篩選出的3種菌株中沒有水霉，可能人為取舍時(shí)將水霉丟掉了，也可能是因培養(yǎng)基種類的原因而沒有分離到水霉。篩選出的3種菌株中，斑替枝孢霉在人體主要引起腦部的暗色絲孢霉病，肺部和皮膚感染較少見[7]，也沒有見到在魚體上分離到的報(bào)道。毛霉屬的某些種類能引起人類或其他動(dòng)物患皮膚病，但變孢毛霉和銹色毛霉是否能引起鱸魚患皮膚病還有待于進(jìn)一步確認(rèn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊秀榮，王慶容.烏江偏巖河段網(wǎng)箱養(yǎng)魚病害現(xiàn)狀與防治對(duì)策[J]. 遵義師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，10（4）：43-44.

[2]林劍偉，闕友雄，陳天生，等. 核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列標(biāo)記在真菌分類鑒定中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通訊，2007，18（2）：292-294.

[3]周小玲，沈微，饒志明，等. 一種快速提取真菌染色體DNA的方法[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（4）：89-92.

[4]張中義.中國(guó)真菌志：第34卷：枝孢屬[M]. 北京：科學(xué)出版社，2003.

[5]魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

[6]金珊，王國(guó)良，趙青松，等. 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖鱸魚的主要疾病與防治[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，19（1）：51-54.

[7]秦振宇，吳紹熙，譚升順. 淺析致病真菌分類的動(dòng)態(tài)性[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)：皮膚性病學(xué)分冊(cè)，2000，26（1）：31-34.林小園，劉紅全，袁衛(wèi)生. 海洋微藻的玻璃化凍存技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：190-194.

1.5.1菌株在不同溫度的生長(zhǎng)狀況將真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培養(yǎng)3～12 d，觀察菌株的生長(zhǎng)狀況。

1.5.2菌株在不同pH值下的生長(zhǎng)狀況將真菌接種在pH值4、5、6、7、8、9，10、11的PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃下培養(yǎng) 3～12 d，觀察菌株的生長(zhǎng)狀況。

2結(jié)果與分析

2.1鱸魚體表可疑性致病真菌的分離結(jié)果

從鱸魚體表一共分離出7株可疑性致病真菌，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號(hào)為鱸體表1、鱸體表3、鱸體表7。

2.2菌株18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及分子鑒定結(jié)果

3個(gè)菌株18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1，3個(gè)菌株都擴(kuò)增出約1 500 bp的片段。將3個(gè)菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中（鱸體表1的登錄號(hào)為KC977560，鱸體表3的登錄號(hào)為KC977562，鱸體表7的登錄號(hào)為KC977559），分子鑒定結(jié)果見表1。將3個(gè)菌株18S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的同源序列用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。從表1和圖2可以看出，鱸體表1屬于枝孢屬，鱸體表3和鱸體表7屬于毛霉屬。

2.3菌株的形態(tài)觀察

2.3.1鱸體表1的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上，菌落直徑為1.30～1.45cm，鼠灰色絨毛狀，中央高凸，呈紐扣狀，表面

有不規(guī)則皺褶，37℃生長(zhǎng)良好。在Sabouand培養(yǎng)基上，菌落稍大，灰棕色絨毛狀，背面黑色（圖3-a）。菌絲灰棕色，叢

生，不分隔（圖3-b）。分生孢子橢圓形、枝孢梨形、鏈生，形成彎曲的芽生孢子短鏈（圖3-c、圖3-d）。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，初步鑒定該菌株為叢梗孢目（Miniliales）、暗色孢科（Dematiaceae）、枝孢屬（Cladosporium）的斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum）[4]。2.3.2鱸體表3的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)迅速，無假根，孢子囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，孢子囊梗分枝，全部頂生孢子囊（圖4-a）；菌叢較高，軟弱，先呈白色，后變灰色或褐色；孢子囊梗多分枝，常無菌絲孢子，囊膜易融化，主梗不作軸狀分枝。孢子囊多孢子，灰褐色，有囊軸（圖4-b）；孢子囊大，球形，孢囊孢子形狀不規(guī)則，卵形至圓形，壁薄，平滑（圖4-c）。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，初步鑒定該菌株為毛霉目（Mucorales）、 毛霉科（Mucoraceae）、 毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）的變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）[5]。

2.3.3鱸體表7的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～12 d，菌絲萌發(fā)時(shí)白色，后變?yōu)辄S色轉(zhuǎn)褐色，背面磚紅色。菌絲生長(zhǎng)迅速，無假根，孢囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，菌絲全部頂生孢子囊，褐色，孢子囊梗長(zhǎng)，合軸分枝（圖5-a）；孢子囊大，球形，頂生，囊柄易凋萎（圖5-b）；孢子囊多孢子，球形，含孢子甚多，灰褐色，有囊軸；孢囊孢子橢圓形，壁薄，平滑（圖5-c）。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，初步鑒定該菌株為毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）、毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）的銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）[5]。

2.4可疑性致病真菌的生物學(xué)特性

2.4.1不同溫度對(duì)3種真菌生長(zhǎng)速率的影響由表2可以看出，不同溫度條件下不同真菌的生長(zhǎng)速率不同：3種菌株在5 ℃時(shí)都基本不萌發(fā)，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，真菌生長(zhǎng)速率加快，25 ℃左右是真菌生長(zhǎng)的最適溫度。37 ℃以上時(shí)，枝孢屬的鱸體表1生長(zhǎng)旺盛，生長(zhǎng)速率幾乎不受影響，而毛霉屬的鱸體表3和鱸體表7幾乎不能生長(zhǎng)。

表2不同溫度對(duì)3種真菌生長(zhǎng)速率的影響

菌株編號(hào)1不同溫度下的生長(zhǎng)速率（cm/d）5 ℃110 ℃115 ℃120 ℃125 ℃130 ℃137 ℃鱸體表11—1—10.2310.2510.3810.3710.40鱸體表31—10.5211.2211.5412.4511.831—鱸體表71—10.5111.1211.4012.0111.731—

2.4.2不同pH值對(duì)3種真菌生長(zhǎng)速率的影響由表3可以看出，不同pH值條件下不同真菌的生長(zhǎng)速率不同：3種菌株在pH值為4～7時(shí)均能生長(zhǎng)，鱸體表1和鱸體表7在pH值為5時(shí)生長(zhǎng)最快，鱸體表3在pH值為6時(shí)生長(zhǎng)最快，在其他pH值條件下生長(zhǎng)速率有所下降。總體來說，分離到的3種菌

3討論

從患病鱸魚體表中共分離出7株真菌，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號(hào)為鱸體表1、鱸體表3、鱸體表7，根據(jù)分子鑒定結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定出鱸體表1屬于枝孢屬（Cladosporium），鱸體表3和鱸體表7屬于毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）。再結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)一步確定鱸體表1為斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum），鱸體表3為變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）， 鱸體表7為銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）。真菌的種類多、分布廣、形態(tài)特征復(fù)雜，且少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)隨著環(huán)境的變

化而不穩(wěn)定，可能造成鑒定結(jié)果有一定偏差，增加了鑒定難度，今后可以嘗試用多種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以求增加鑒定結(jié)果的可靠性。

對(duì)分離并鑒定的3種菌株進(jìn)行生物學(xué)特性的初步研究，將菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度下恒溫培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)毛霉生長(zhǎng)的最適溫度是25 ℃左右，低于5 ℃或高于37 ℃均不生長(zhǎng)；低于10 ℃時(shí)枝孢霉菌絲不萌發(fā)生長(zhǎng)，而高于37 ℃對(duì)其生長(zhǎng)影響不大。將菌株接種到不同pH值的PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)分離到的3種菌株生長(zhǎng)的最適pH值是中性偏酸性。

鱸魚體表常見的真菌性疾病是水霉病，病原是水霉科的某些種類[6]。本研究從鱸魚體表的病害部位采集標(biāo)本，共分離到7種菌株，根據(jù)肉眼觀察菌落形態(tài)進(jìn)行取舍，在篩選出的3種菌株中沒有水霉，可能人為取舍時(shí)將水霉丟掉了，也可能是因培養(yǎng)基種類的原因而沒有分離到水霉。篩選出的3種菌株中，斑替枝孢霉在人體主要引起腦部的暗色絲孢霉病，肺部和皮膚感染較少見[7]，也沒有見到在魚體上分離到的報(bào)道。毛霉屬的某些種類能引起人類或其他動(dòng)物患皮膚病，但變孢毛霉和銹色毛霉是否能引起鱸魚患皮膚病還有待于進(jìn)一步確認(rèn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊秀榮，王慶容.烏江偏巖河段網(wǎng)箱養(yǎng)魚病害現(xiàn)狀與防治對(duì)策[J]. 遵義師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，10（4）：43-44.

[2]林劍偉，闕友雄，陳天生，等. 核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列標(biāo)記在真菌分類鑒定中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通訊，2007，18（2）：292-294.

[3]周小玲，沈微，饒志明，等. 一種快速提取真菌染色體DNA的方法[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（4）：89-92.

[4]張中義.中國(guó)真菌志：第34卷：枝孢屬[M]. 北京：科學(xué)出版社，2003.

[5]魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

[6]金珊，王國(guó)良，趙青松，等. 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖鱸魚的主要疾病與防治[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，19（1）：51-54.

[7]秦振宇，吳紹熙，譚升順. 淺析致病真菌分類的動(dòng)態(tài)性[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)：皮膚性病學(xué)分冊(cè)，2000，26（1）：31-34.林小園，劉紅全，袁衛(wèi)生. 海洋微藻的玻璃化凍存技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：190-194.

1.5.1菌株在不同溫度的生長(zhǎng)狀況將真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培養(yǎng)3～12 d，觀察菌株的生長(zhǎng)狀況。

1.5.2菌株在不同pH值下的生長(zhǎng)狀況將真菌接種在pH值4、5、6、7、8、9，10、11的PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃下培養(yǎng) 3～12 d，觀察菌株的生長(zhǎng)狀況。

2結(jié)果與分析

2.1鱸魚體表可疑性致病真菌的分離結(jié)果

從鱸魚體表一共分離出7株可疑性致病真菌，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號(hào)為鱸體表1、鱸體表3、鱸體表7。

2.2菌株18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及分子鑒定結(jié)果

3個(gè)菌株18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1，3個(gè)菌株都擴(kuò)增出約1 500 bp的片段。將3個(gè)菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中（鱸體表1的登錄號(hào)為KC977560，鱸體表3的登錄號(hào)為KC977562，鱸體表7的登錄號(hào)為KC977559），分子鑒定結(jié)果見表1。將3個(gè)菌株18S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的同源序列用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。從表1和圖2可以看出，鱸體表1屬于枝孢屬，鱸體表3和鱸體表7屬于毛霉屬。

2.3菌株的形態(tài)觀察

2.3.1鱸體表1的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上，菌落直徑為1.30～1.45cm，鼠灰色絨毛狀，中央高凸，呈紐扣狀，表面

有不規(guī)則皺褶，37℃生長(zhǎng)良好。在Sabouand培養(yǎng)基上，菌落稍大，灰棕色絨毛狀，背面黑色（圖3-a）。菌絲灰棕色，叢

生，不分隔（圖3-b）。分生孢子橢圓形、枝孢梨形、鏈生，形成彎曲的芽生孢子短鏈（圖3-c、圖3-d）。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，初步鑒定該菌株為叢梗孢目（Miniliales）、暗色孢科（Dematiaceae）、枝孢屬（Cladosporium）的斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum）[4]。2.3.2鱸體表3的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)迅速，無假根，孢子囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，孢子囊梗分枝，全部頂生孢子囊（圖4-a）；菌叢較高，軟弱，先呈白色，后變灰色或褐色；孢子囊梗多分枝，常無菌絲孢子，囊膜易融化，主梗不作軸狀分枝。孢子囊多孢子，灰褐色，有囊軸（圖4-b）；孢子囊大，球形，孢囊孢子形狀不規(guī)則，卵形至圓形，壁薄，平滑（圖4-c）。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，初步鑒定該菌株為毛霉目（Mucorales）、 毛霉科（Mucoraceae）、 毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）的變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）[5]。

2.3.3鱸體表7的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3～12 d，菌絲萌發(fā)時(shí)白色，后變?yōu)辄S色轉(zhuǎn)褐色，背面磚紅色。菌絲生長(zhǎng)迅速，無假根，孢囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，菌絲全部頂生孢子囊，褐色，孢子囊梗長(zhǎng)，合軸分枝（圖5-a）；孢子囊大，球形，頂生，囊柄易凋萎（圖5-b）；孢子囊多孢子，球形，含孢子甚多，灰褐色，有囊軸；孢囊孢子橢圓形，壁薄，平滑（圖5-c）。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，初步鑒定該菌株為毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）、毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）的銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）[5]。

2.4可疑性致病真菌的生物學(xué)特性

2.4.1不同溫度對(duì)3種真菌生長(zhǎng)速率的影響由表2可以看出，不同溫度條件下不同真菌的生長(zhǎng)速率不同：3種菌株在5 ℃時(shí)都基本不萌發(fā)，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，真菌生長(zhǎng)速率加快，25 ℃左右是真菌生長(zhǎng)的最適溫度。37 ℃以上時(shí)，枝孢屬的鱸體表1生長(zhǎng)旺盛，生長(zhǎng)速率幾乎不受影響，而毛霉屬的鱸體表3和鱸體表7幾乎不能生長(zhǎng)。

表2不同溫度對(duì)3種真菌生長(zhǎng)速率的影響

菌株編號(hào)1不同溫度下的生長(zhǎng)速率（cm/d）5 ℃110 ℃115 ℃120 ℃125 ℃130 ℃137 ℃鱸體表11—1—10.2310.2510.3810.3710.40鱸體表31—10.5211.2211.5412.4511.831—鱸體表71—10.5111.1211.4012.0111.731—

2.4.2不同pH值對(duì)3種真菌生長(zhǎng)速率的影響由表3可以看出，不同pH值條件下不同真菌的生長(zhǎng)速率不同：3種菌株在pH值為4～7時(shí)均能生長(zhǎng)，鱸體表1和鱸體表7在pH值為5時(shí)生長(zhǎng)最快，鱸體表3在pH值為6時(shí)生長(zhǎng)最快，在其他pH值條件下生長(zhǎng)速率有所下降。總體來說，分離到的3種菌

3討論

從患病鱸魚體表中共分離出7株真菌，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色選擇3株，分別編號(hào)為鱸體表1、鱸體表3、鱸體表7，根據(jù)分子鑒定結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定出鱸體表1屬于枝孢屬（Cladosporium），鱸體表3和鱸體表7屬于毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）。再結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)一步確定鱸體表1為斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum），鱸體表3為變孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）， 鱸體表7為銹色毛霉（Mucor rufescens Fischer）。真菌的種類多、分布廣、形態(tài)特征復(fù)雜，且少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)隨著環(huán)境的變

化而不穩(wěn)定，可能造成鑒定結(jié)果有一定偏差，增加了鑒定難度，今后可以嘗試用多種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以求增加鑒定結(jié)果的可靠性。

對(duì)分離并鑒定的3種菌株進(jìn)行生物學(xué)特性的初步研究，將菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度下恒溫培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)毛霉生長(zhǎng)的最適溫度是25 ℃左右，低于5 ℃或高于37 ℃均不生長(zhǎng)；低于10 ℃時(shí)枝孢霉菌絲不萌發(fā)生長(zhǎng)，而高于37 ℃對(duì)其生長(zhǎng)影響不大。將菌株接種到不同pH值的PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)分離到的3種菌株生長(zhǎng)的最適pH值是中性偏酸性。

鱸魚體表常見的真菌性疾病是水霉病，病原是水霉科的某些種類[6]。本研究從鱸魚體表的病害部位采集標(biāo)本，共分離到7種菌株，根據(jù)肉眼觀察菌落形態(tài)進(jìn)行取舍，在篩選出的3種菌株中沒有水霉，可能人為取舍時(shí)將水霉丟掉了，也可能是因培養(yǎng)基種類的原因而沒有分離到水霉。篩選出的3種菌株中，斑替枝孢霉在人體主要引起腦部的暗色絲孢霉病，肺部和皮膚感染較少見[7]，也沒有見到在魚體上分離到的報(bào)道。毛霉屬的某些種類能引起人類或其他動(dòng)物患皮膚病，但變孢毛霉和銹色毛霉是否能引起鱸魚患皮膚病還有待于進(jìn)一步確認(rèn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊秀榮，王慶容.烏江偏巖河段網(wǎng)箱養(yǎng)魚病害現(xiàn)狀與防治對(duì)策[J]. 遵義師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，10（4）：43-44.

[2]林劍偉，闕友雄，陳天生，等. 核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列標(biāo)記在真菌分類鑒定中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通訊，2007，18（2）：292-294.

[3]周小玲，沈微，饒志明，等. 一種快速提取真菌染色體DNA的方法[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（4）：89-92.

[4]張中義.中國(guó)真菌志：第34卷：枝孢屬[M]. 北京：科學(xué)出版社，2003.

[5]魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

[6]金珊，王國(guó)良，趙青松，等. 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖鱸魚的主要疾病與防治[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，19（1）：51-54.

[7]秦振宇，吳紹熙，譚升順. 淺析致病真菌分類的動(dòng)態(tài)性[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)：皮膚性病學(xué)分冊(cè)，2000，26（1）：31-34.林小園，劉紅全，袁衛(wèi)生. 海洋微藻的玻璃化凍存技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：190-194.