海洋微藻的玻璃化凍存技術研究進展

林小園　劉紅全　袁衛生

摘要：微藻的營養豐富，在生活和生產實踐中備受研究者的親睞，但由于海洋微藻的長時間培養和多次接種易導致藻種污染或遺傳漂變，使微藻的科研工作和商業化開發受到極大的限制。因此有效的藻種保存方法是進一步研究和開發利用海洋微藻的關鍵。玻璃化保存技術是一門新興的生物技術，具有操作簡便、快速、高效等特點，是目前海洋微藻種質資源長期穩定保存的理想方法。現對玻璃化法超低溫保存的原理、優點，玻璃化凍存法的操作程序、影響因素、關鍵技術和海洋微藻凍存苗的應用前景進行綜述，并對其今后的發展進行了展望。

關鍵詞：海洋微藻；玻璃化凍存；研究進展

中圖分類號：S917.3文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）01-0190-05

收稿日期：2013-05-24

基金項目：國家自然科學基金（編號：30960215）；廣西自然科學基金（編號：桂科青0728019）。

作者簡介：林小園（1989—），女，碩士研究生，主要從事海洋微藻的種質保存及多不飽和脂肪酸研究。E-mail：lxyqzw@126.com。

通信作者：劉紅全，副教授。E-mail：lhongquan@163.com。近年來，隨著陸地資源的衰竭，豐富的海洋微藻資源成了人們研究的熱點。海洋微藻含有高價值的營養成分及藥物活性成分，如蛋白質、色素、脂肪類、維生素等生物活性物質[1-3]，是具有巨大應用價值的潛在資源；但由于藻種保存技術的限制，已成為海洋微藻資源商業化培養開發的瓶頸。分離純化得到1個單藻種，往往需花費數月時間甚至更長，尤其篩選出1個優良的、有應用價值的微藻藻種就更加困難，因此成功的保種方法是微藻培養和進一步開發應用的基礎和關鍵環節。

目前海洋微藻在科研和實踐生產中常采用的保種方法有繼代培養法、固定化保存、超低溫保存法。這些方法在實際應用中存在諸多弊端，如繼代培養在長時間培養、多次接種下，易導致藻種污染或者遺傳漂變，生命力減退等失去良種的價值。固定化培養程序較復雜，需要細心操作，而且大多數微藻在培養后期常會從膠珠中溢出，有的膠珠還會融解，導致保種失敗。雖然大量試驗結果表明，超低溫凍存法將存活率提高到30%以上，但同樣存在一些缺陷，需要復雜的預冷凍程序，費用較高，耗時長且不可避免凍融過程中晶體的形成，對保存材料造成損傷。因此研究者在超低溫貯存技術基礎上進行了新的探索，發展起來包埋-脫水法和玻璃化法2種新的冷凍保存技術。包埋-脫水法操作簡單，但存活率較低，僅為15%[4]，而玻璃化凍存法不僅可以克服前幾種保存技術中費時、費力、易污染等弊病，而且超低溫還可能殺滅有害致病菌，達到實現種質長期保存的目的[5]。經過玻璃化凍存的藻種相當于進行了一次優勝劣汰的復壯作用，復蘇后存活下來的藻細胞一般會比未凍存的長得更好、更高產和抗凍性更強[6]。因此將玻璃化法用于海洋微藻種質的凍存將會有廣闊的應用前景。

1海洋微藻的玻璃化凍存技術應用現狀

自1985年Rall等[7]首次應用玻璃化冷凍技術成功保存小鼠胚胎至今，已成功凍存了小鼠、兔、牛、豬、山羊等多種哺乳動物胚胎。目前玻璃化凍存技術的研究和應用多見于動物胚胎和高等植物種質的保存[8-10]，對于藻類的研究較少，但已有成功報道。如項黎新等[11]對衣藻細胞玻璃化凍存，獲得31.45%的存活率，恢復培養后其生長規律和未凍存的衣藻一致；Day采用該法保存小球藻配子體時，存活率高達100%[12]。劉麗娜等[13]也采用了此方法對湛江等地鞭金藻進行保存，存活率高達54%。這表明玻璃化法在藻類種質的超低溫保存中具有較大的應用潛力。

“玻璃化”是一個物理學上的概念，指當水或溶液快速降溫達到或低于-100～-110 ℃的溫度范圍時，形成一種具有高粘度的介于液態和固態之間非晶體態、雜亂無章、透明的玻璃狀態[14]。其物理性能與晶體態不同，是一種可以減輕或避免冷凍細胞及組織的損傷，達到長期保存的良好方法。玻璃化冷凍技術與常規的保存方法（如繼代培養，低溫凍存）相比，具有以下優勢[15]：（1）簡化了冷凍操作步驟，無需貴重的程序降溫儀，整個操作就短短幾分鐘。（2）能夠有效避免胞內冰晶的形成，從而降低細胞因形成冰晶而導致各種物理及化學的損傷。（3）玻璃化凍存有效抑制細胞的代謝活動，長期保持生物遺傳穩定性。玻璃化凍存簡單、高效的特點，近年來備受關注，是今后微藻冷凍保存技術的發展方向。不過玻璃化冷凍保存對保護劑組合、濃度及降溫升溫速率有特殊的要求。保護劑組合的總濃度一般要高達5.0～7.0 mol/L 才能實現玻璃化凍存，而高濃度的保護劑對保存材料產生嚴重毒性，因此在保存細胞或組織時，減少保護劑的毒性至關重要。

2海洋微藻玻璃化凍存的程序及研究進展

海洋微藻自身是否有抗凍性對存活率產生重大的影響，對于冷敏感的微藻應選用繼代培養保存法。因為藻類細胞含水量及液泡化程度高，在液氮保存中，0 ℃以下至低共熔點的溫度范圍內，都處于危險狀態，因此冷敏感的藻種不利于低溫貯存。同時對于具有抗凍性的藻種在低溫貯存中，從冷凍保護劑預處理、常溫到低溫、低溫儲存以及從低溫恢復到常溫和保護劑的去除等都至關重要，稍有操作失誤都會使細胞致死。因此根據藻種的差異性選擇合適的保存方法，對于超低溫凍存的藻種，應盡可能選擇毒性小，抗凍效果好的保護劑及優化凍存程序。液氮貯存相對其他貯存方法，是長久保持種質遺傳穩定性較有效的方法，且凍存技術相對成熟。

2.1海洋微藻材料的選擇

1976年，Morris就對多種不同的種、株小球藻進行冷凍試驗，結果表明抗凍性存在極大差異。低溫凍存的存活率跟藻種細胞的生長時期有關，有研究報道有些藻種處于靜止期時細胞抗凍性較好，存活率高于指數期細胞。如王起華等[16]對牟氏角刺藻和新月菱形藻進行了試驗，結果表明靜止期細胞的存活率顯著高于指數期。但也有研究報道某些藻種的指數生長期的抗凍性高于靜止期[17]。然而Ben-Amotz等[18]對12種海藻的冷凍保存研究發現抗凍性與藻細胞的生長時期無關。對此尚未見到有關細胞生長時期對凍存存活率影響的深入研究，因此不同生長時期細胞的抗凍性可能與藻種有關，對于不同的藻種應選用抗凍性較好的那個生長階段的細胞進行凍存。

2.2冷凍保存前的預培養及低溫馴化

2.2.1預培養預培養是對培養條件做適宜的改變，以提高藻類的抗凍性。如對某些營養鹽進行限制，營養方式、培養條件（光照，溫度）的改變誘導出較大的抗凍性。Mortaint-Bertrand[19]等通過限制培養基中碳酸氫鈉和磷酸鹽的含量，明顯提高了杜氏鹽藻冰凍保存的存活率。項黎新等[11]取對數生長期的衣藻細胞離心濃縮，于不同的蔗糖濃度中光照預培養2 d再進行玻璃化凍存，存活率達31.45%，且恢復培養后生長規律與未凍存的一致。

2.2.2低溫馴化 低溫馴化是一種常用的預處理方式，通過低溫馴化，細胞會發生保護性脫水，避免引起細胞內大量結冰從而引起細胞死亡，這對低溫敏感藻種的玻璃化凍存極其重要[20]。Halmaggi等[21]在待凍存的藻液中加入一定濃度的葡萄糖或蔗糖，于4～15 ℃黑暗下馴化16～72 h，研究發現抗凍性明顯提高。王起華等將牟氏角剌藻和新月菱形藻進行低溫黑暗馴化再凍存，結果發現藻種的抗寒性明顯提高，存活率提高10%左右[16]。

2.3玻璃化抗凍劑組合的篩選

抗凍保護劑具有較強的親水性，在水結冰過程中干擾水分子的晶格排列，抑制冰晶的形成，在一定程度上對凍存材料起保護作用。保護劑有滲透性和非滲透性兩大類，滲透性保護劑主要有甘油、二甲基亞砜、乙二醇、丙二醇等，可迅速滲入細胞內，使胞內溶質增加，降低細胞膜對水的通透性，同時充分脫水，避免凍存時冰晶形成造成傷害。但是滲透性保護劑具有一定毒性，因此保存材料在玻璃化液中暴露的時間盡可能短，溫度盡量低。非滲透性保護劑一般情況下不能自由擴散透過細胞膜，主要有葡萄糖、蔗糖和海藻糖等低分子糖類。非滲透性保護劑可為細胞提供一個高滲環境限制水分過快進入細胞，避免解凍時發生滲透性休克，起特異性保護作用。

在冷凍過程中，常將這兩類保護劑聯合使用，因為有些保護劑如甘油，乙二醇等，滲透作用強、化學毒性小，但玻璃化能力稍差，而有些保護劑如二甲基亞砜，玻璃化狀態效果好，但滲透性較差，毒性大。并且要形成較好的玻璃化狀態，保護劑組合的濃度需高達5～7 mol/L，因此將這些保護劑配合使用后能功能互補，既保證了抗凍劑的滲透性，較好的玻璃化能力又降低了使用單一保護劑高濃度的毒性。

2.4冰凍保存的操作程序

2.4.1凍存時藻細胞的預處理在藻細胞凍存前，需先對保護劑的濃度及預平衡時間進行試驗，確定較適合的保護劑濃度及預處理時間，因為高濃度的保護劑對細胞有毒害性，毒性大小與使用濃度及處理時間相關[22]。確定保護劑濃度后，將保護劑組合配制成使用體積分數的2倍，先用稀釋到使用時一半濃度的玻璃化溶液對藻細胞預平衡。預平衡時間的長短因藻種而異，處理時間過短或過長都會降低存活率，一般在 0 ℃ 或25 ℃下處理5～60 min[23]，如湛江等鞭金藻預處理 50 min[24]，小新月菱形藻預處理60 min[25]。采用逐步加入法，使細胞適度脫水，然后去除預平衡溶液，加入玻璃化溶液，迅速投入液氮中進行保存，整個操作盡可能在短時間內完成，避免細胞在保護劑中暴露時間過長受到毒副作用。

2.4.2藻細胞的解凍操作凍存材料的復蘇一般采用快速解凍法，將凍存材料迅速轉移到40 ℃水浴中，快速振蕩直至最后1粒冰晶消失。然后在冰浴中或室溫下加入培養液稀釋，離心去除保護劑，再用培養基漂洗解凍材料2～3遍，洗滌時間根據藻細胞的耐滲透壓選擇[26]。解凍洗滌以快速除去高濃度的玻璃化保護劑，避免保護劑對細胞造成傷害。值得注意的是對于細胞表面有角毛或鞭毛的藻種，不適合采用離心法去除保護劑，直接用稀釋法，因為在離心過程中易造成機械傷害而影響存活率[16]。

2.4.3解凍后的恢復培養化凍后的材料需在特定培養條件下才能更好地快速恢復生長，再培養條件如光照、溫度、營養液溶度等對存活率均有較大影響[27]。有結果表明經玻璃化凍存后的材料先暗培養1 d再過渡到光照中培養，存活率均高于直接光照培養，且能較快恢復正常生長。至于化凍后先經暗培養再光照培養可提高存活率的機理尚需進一步深入研究。

2.5存活率的測定

目前不同測定方法的可靠性差異很大，因此對細胞存活率的準確估計存在較大誤差，也是影響存活率的一個因素。近幾年應用較多的存活率測定法是分光光度法及溶液培養-細胞計數法。其中分光光度法是將恢復生長后的藻液，于分光光度計一定波長下測得吸光度，根據預先確定好的藻細胞密度（y）與吸光度（x）的直線回歸方程推算出冷凍后的細胞密度，然后與對照組進行比較，得出比值即為存活率[28-29]。溶液培養細胞計數法，是將復蘇后恢復生長到一定天數（n）的藻液用細胞計數板測定細胞密度，根據回歸方程Y=aXb（Y為培養n d后的藻細胞密度，X為藻細胞的初始密度，此方程由不同初始密度的藻液與培養n d后測得的藻細胞密度擬合所得）計算出活細胞密度，與對照組對比獲得存活率[30-31]。

除此之外，細胞存活率的測定法還有細胞運動能力測定法、光合放氧活性測定法及葉綠素含量測定法等。不同測定方法的可靠性差異極大，因此對于保存方法優劣的評估較為困難。

3海洋微藻玻璃化凍存苗的應用前景

隨著微藻種質玻璃化保存技術不斷深入研究和完善，使得海洋微藻在開發和生產實踐中發揮越來越大的作用。如建立微藻玻璃化保存種質庫，保持一些稀有的及瀕危微藻的種質資源，便于國內外學術交流中微藻種質的交換。同時通過玻璃化凍存有可能培養出抗逆性強的優良微藻新品系，為低溫生物學領域提供新的資料。過去海洋微藻的商業化開發主要用作海產養殖的食物餌料，而隨著研究工作的深入，通過微藻種質的保存、選育，養殖方式的選擇及培養條件的優化，可獲得人們期望的大量代謝產物?，F在海洋微藻的養殖及產品開發已經成為新興生物技術產業[32-33]，在食品、醫藥、化妝品、生物新能源、環境污水及廢氣的處理中顯現出廣闊的前景。

3.1作為營養保健品廣泛應用于食品及醫藥領域

海洋微藻富含蛋白質、色素、多糖及PUFAs，在醫藥和保健品的開發應用方面具有巨大的潛力[34]。據報道小球藻的蛋白質含量高達50%，是大豆的2倍、雞蛋的6倍、大米的10倍，而且微藻中還含有高含量的礦物質元素、人體必需氨基酸及維生素等，其中鐵質含量和維生素A分別是葡萄干的50倍、4倍，豬肝的16倍；鈣含量是牛奶的2倍；同時還含有比鵝肝更高的維生素B12[35]。目前許多國家把可食用微藻與其他保健品原料混合加工成保健食品（粉劑、片劑、膠囊劑），如餅干、營養塊和飲料等，已上市的保健食品有賜拜年小球藻粉、施普瑞螺旋藻膠囊、新大澤螺旋藻營養早餐、綠A天元甘露等產品（中國植物微藻DHA行業市場調查報告2013版）。美國夏威夷納斯達克上市公司從雨生紅球藻中提取蝦青素，生產出了BioA-stin天然蝦青素膠囊，并通過美國FDA認證，達到GMP標準，其抗氧化能力是維生素E的550倍，是β-胡蘿卜素的10倍[36]。此活性物質加入化妝品具有增加皮膚彈性，潤膚保濕，祛斑除皺紋的功效，法國最早將螺旋藻加入化妝品（如面膜、護發品、護膚霜等），備受消費者的青睞。

同時PUFAs在營養學與醫學上具有不可比擬的作用，已經成為研究的熱點。尤其是EPA和DHA，具有維護生物膜的結構和功能，防治心血管疾病、動脈硬化、糖尿病、肥胖等人類疾病，提高人類記憶力。Angerer等[37]研究發現冠狀動脈病變的程度和脂肪組織中DHA濃度呈負相關，每天讓冠心病患者攝入一定量的w-3型多不飽和脂肪酸，可減緩冠狀動脈粥樣硬化的病變速度。Robert等研究結果表明DHA對嬰兒大腦、眼的機能發育及視網膜組成，視力保護，提高記憶力和促進神經系統的發育起著重要的作用[38-39]。藻類培養不受季節和氣候限制，可全年進行生產，且從海洋微藻中提取的脂肪酸組成簡單無魚腥味，提取工藝較為簡單。美國Martek公司已篩選得到高產EPA和DHA的藻種，其EPA和DHA的最終產量分別為 0.25、1.2 g/（L·d）。2013年5月15日，我國召開的第十一次全國營養科學大會，將DHA+EPA的推薦攝入量明確寫入DRIs（中國居民膳食營養素參考攝入量）。目前，我國有不少生產嬰幼兒食品的廠家通過添加微藻油來提高產品中DHA的含量，如亨氏、貝因美、伊利、光明乳業、圣元等[40]。因此，海洋微藻油脂作為營養保健品的理想原料，目前在國內外已經進入應用階段。

3.2用于水環境污染修復

近年來隨著工業的進步和人們生活水平的提高，環境污染日趨嚴重，如廢氣過量排放，水資源的富營養化及重金屬污染等?，F階段污水處理方法主要有物理法、化學法和生物法。與傳統方法相比，利用生物法處理適用范圍廣、成本低、而且可以避免二次污染。尤其近幾年發展起來的藻類修復水環境污染的能力具有不可比擬的優勢，海洋微藻資源豐富、廉價易得、生長速度快 適應性強、吸附量大，不僅可以高效去除污水中的有機、無機以及重金屬等污染物，還可將培養微藻的污水處理同微藻餌料、生物柴油生產系統耦合，產生一定的附加值[41]。因此利用藻類進行污水處理和水環境修復具有可行性。

許丹妮[42]初步研究了固定化小球藻對市政污水的凈化，結果表明，在人工污水pH值為7.2，水溫20 ℃的條件下對污水中的氨態氮凈化效率為65.05%；對PO43-的凈化效率達7817%。張靜霞[43]將小球藻于無氮磷的培養基中饑餓處理 24 h，后置于人工污水中培養72 h，結果發現對氮磷的去除率分別高達97%、99%。有研究發現萊茵衣藻和小球藻在凈化重金屬污水中具有明顯的優勢[44-45]，對Hg2+的吸附率可達到53. 8%。Chung 等用螺旋藻對沼氣發酵的豬糞廢水進行二次處理，結果表明，氮的同化效率高達76%，且通過小鼠試驗無毒性反應[46]。張聰利用城市污水剩余污泥的抽提液培養小球藻和螺旋藻，發現污泥抽提液可部分取代傳統微藻培養的營養液，為藻蛋白的工業化生產提供廉價的原料[47]。

Liu等認為大部分廢水特別是食品工業的廢水（如糖蜜、乳制品的廢水）都可用來培養某些藻種，將獲得的微藻用作飼料或肥料，達到消除污染和再生能源雙贏的效果[48]。這種低成本、低耗能、效益明顯的廢水凈化方式，有著巨大的開發潛力。

3.3作為可再生能源

石油和煤炭等能源儲量的日益減少，且該能源在燃燒過程中會對空氣造成污染，使得不斷增長的需求與日益嚴重的環境污染之間形成尖銳的矛盾，因此尋找新的清潔的替代能源，已成為倍受人們關注的課題。微藻油脂含量高，利用光照產油的效率遠遠超過了最好的油料作物，產生物柴油的量是最好油料作物的8～24倍[49-50]。并且海洋微藻的養殖在天然的海域即可，不與農業爭地。因此海洋微藻作為一種重要的可再生能源物質，無論從能源供給的角度還是從環境保護的角度來講，都具有科學意義。

研究發現海洋微藻的生長速度非?？?，在指數生長期，生物量倍增時間可短至3.5 h，油脂含量占細胞干質量的80%[51]。何峰等研究了不同碳源及生長條件對三角褐指藻總脂含量積累的影響，結果表明在葡萄糖濃度為20 mmol/L、溫度（25±1） ℃、光強25 μmol/（m2·s）、pH值7.5的條件下，總脂含量達到 20%（細胞干質量），證實了該藻種可用于提取生物柴油[52]。賀立靜對微藻產氫進行初步研究，結果表明緣微囊藻、假魚腥藻、束絲藻、絲藻、萊茵衣菜、顫藻和銅綠微囊藻在TAP和TAP-S培養液中均能產氫，其中萊茵衣藻在TAP-S培養液中產氫最多，培養120 h總產氫量達到 4.77 mL，產氫速率0.63 mL/（h·L）[53]。1998年美國再生能源國家實驗室通過現代生物技術，將來自小環藻的乙酞輔酶A梭化酶基因導入小環藻得到1株工程小環藻，在實驗室培養條件下該藻的總脂肪酸含量高達60%以上，戶外生產也可達到40%以上[54]。近年來采用基因工程技術構造“工程微藻”的報道層出不窮[55-57]。2010年，中國科學院青島生物能源研究所與美國波音公司共同簽署了推進藻類航空可持續生物燃料合作備忘錄，啟動微藻航空生物柴油能源技術的大規模開發。微藻與陸生作物相比，具有生物量大、生長周期短、脂質含量高等特點，已成為生物燃油原料的首選。因此大力發展微藻類生物柴油，對經濟可持續發展，推進能源替代，舒緩環境壓力，控制大氣污染具有重要的戰略意義。

4展望

玻璃化凍存法綜合了傳統方法與超低溫保存技術的優點，克服不足，使之在海洋微藻種質資源保存中獨具潛力與優勢。因此，采用玻璃化法建立海洋微藻的超低溫種質資源庫已成為該領域今后發展的一個趨勢。玻璃化法超低溫保存研究雖然取得了一些令人鼓舞的進展，但是針對這一新興領域，還有許多問題需要做進一步的探討與研究。如對于不同的藻種，未建立起與之相適應的完善的保存體系。在整個方法體系中，針對不同材料的特性，選擇與之相適應的冷凍保護劑組合及其濃度成為該技術的難點和重點；對于已保存的材料，在整個超低溫保存過程中所發生的生理生化反應并不能完全描述清楚，如細胞的抗凍機理仍不明確，所以需對玻璃化法保存微藻的生化機理進行深入研究。

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