一種簡易觀察管花肉蓯蓉寄生過程的方法

張金霞　王華磊　郭玉?！〉灾鞠?/p>

摘要：木箱-玻璃板法可以在不傷害肉蓯蓉種子和檉柳根系的情況下，直觀地觀察到管花肉蓯蓉寄生的整個過程，建立一種可視的管花肉蓯蓉寄生的觀察方法，為進一步明確管花肉蓯蓉寄生過程和寄生機理提供一種研究模型。

關鍵詞：管花肉蓯蓉；木箱-玻璃法；檉柳；寄生過程；寄生機理

中圖分類號： Q944.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0211-02

收稿日期：2013-06-04

基金項目：科技部農業科技成果轉化資金（編號：2011GB23600014）；貴州省科技計劃[編號：黔科合院所創能（2010）4002]。

作者簡介：張金霞（1978—），女，河北邢臺人，碩士，助理研究員，從事中草藥栽培研究。E-mail：jx9801@126.com。

通信作者：郭玉海，教授，博士生導師，從事中草藥栽培研究。E-mail：yhguo@cau.edu.cn。管花肉蓯蓉[Cistanche tubulosa （Schenk）R.Wight]為列當科的寄生植物，性甘、咸、溫，具有補腎陽、益精血、潤腸通便的功效[1]。管花肉蓯蓉具有根寄生特性，其寄生過程在土壤中進行，因此難以觀察它的生長過程。目前，國內外的研究多側重于利用列當愈傷組織離體侵染寄主體系的建立[2-3]，研究多集中于列當屬植物侵染草本植物，由于管花肉蓯蓉的寄主檉柳是木本植物，侵染較困難，所以關于這方面的研究相對較少，其寄生關系也有待于進一步深入研究。李天然等采用盆栽法收集了與梭梭根接種的、處于不同時期的種子萌發體[4]，最早研究了肉蓯蓉種子的萌發與寄主梭梭的關系。王華磊通過田間連續大量取樣，觀察了管花肉蓯蓉種子萌發、寄生于檉柳根、長出幼苗寄生過程的形態學變化[5]。馬東明采用無菌培養法建立了檉柳刺激管花肉蓯蓉種子萌發的技術[6]，在無菌狀態下研究管花肉蓯蓉接種檉柳的過程，由于培養基和土壤環境存在較大差異，因此采取田間采樣觀察管花肉蓯蓉萌發和寄生過程，對接種的管花肉蓯蓉進行不定期采挖。由于采挖過程容易對管花肉蓯蓉和檉柳根系造成傷害，且僅限于用肉眼觀察，另外，管花肉蓯蓉種子非常小，采挖和觀察比較困難，所以管花肉蓯蓉寄生及生長所需適宜生態條件尚未研究清楚，難以對田間栽培進行科學指導。生產中主要存在種源浪費嚴重、接種率低、接種周期長等問題，本研究針對這些問題，建立了一種可視化觀察管花肉蓯蓉接種試驗體系，突破了肉眼的限制，借助體視顯微鏡進行觀察，在不傷害管花肉蓯蓉生長的情況下觀察管花肉蓯蓉的寄生過程。

1材料與方法

1.1供試材料

管花肉蓯蓉種子來源于新疆于田種植場。

1.2儀器

奧林巴斯 SZH-10型體視顯微鏡；20 cm×20 cm的木板2塊；20 cm×15 cm的木板3塊；有機透明玻璃板；白紗布。

1.3方法

1.3.1檉柳實生苗的培養取成熟的檉柳種子，將其均勻撒播在裝有濕潤沙土的花盆中，在花盆口覆蓋1層透明的塑料膜，在光照強度為1 600 lx、溫度為25 ℃下培養，待檉柳長出沙土2～3 cm將塑料膜揭去，待檉柳長至15～20 cm時備用。

1.3.2管花肉蓯蓉種子的前處理方法經過初步分級的05～0.8 mm管花肉蓯蓉種子放置于2～5 ℃下低溫層積6個月，完成生理后熟。

1.3.3木箱-玻璃板法將木箱訂成簸箕狀，其中3個側面為長方形木板（20 cm×15 cm），2個正方形寬面（20 cm×20 cm ）中的一面安裝木板，另一面安裝可以開啟的玻璃門，將木箱開口和裝玻璃的一面斜向上放置，填入濕沙土至木箱的窄木板一半厚度，取株高達15～20 cm的檉柳實生苗2棵，剪掉一部分枝干，將檉柳根平鋪在濕沙中，此時檉柳放置方向與玻璃板保持一致。然后繼續用濕沙覆蓋住檉柳根部，將沙土表面壓實壓平整，在濕沙上鋪2層白紗布，以便檉柳根能穿過紗布生長，將透明玻璃板壓緊在紗布上。用黑布將玻璃板完全包裹起來，玻璃板朝向背光的一面，將箱體與水平夾角呈60° 傾斜向陽放置，這樣既能保證檉柳枝葉進行光合作用，又能保證檉柳根部受重力作用垂直長出紗布，待檉柳根約穿透紗布面積的 1/2 時，將經過6個月層積的管花肉蓯蓉種子放在檉柳根周圍的0～5 cm處，每棵檉柳根上放置60粒，置于光照強度為 1 600 lx、溫度為（25±2） ℃的條件下培養，10棵檉柳為1個處理，每個處理重復3次。定期用奧林巴斯 SZH-10型體視顯微鏡觀察種子萌發和接種于寄主根的情況，記錄并拍照。

2結果與分析

2.1管花肉蓯蓉種子的萌發

采用木箱-玻璃板法，用濕沙土作介質，將層積6個月的管花肉蓯蓉種子播種到檉柳根附近0～5 mm范圍內，20 d左右開始萌發。李天然等發現，肉蓯蓉種子在鉆入種皮內的寄主根的誘發下萌發，其種胚細胞伸長形成管狀突起[4]。本試驗還發現管花肉蓯蓉有另外一種萌發方式，即在未觸及管花肉蓯蓉種子時，檉柳根附近的管花肉蓯蓉種子就開始萌發，且越靠近檉柳根區0～5 mm范圍內的管花肉蓯蓉種子萌發越多，管花肉蓯蓉的芽管狀器官比較粗壯，說明檉柳的新生毛細根尖會釋放出某種化學物質，刺激管花肉蓯蓉種子種胚細胞分裂，進而促進其萌發。隨后芽管狀器官逐漸發育出具乳頭狀突起的初生吸器，膨大的初生吸器表皮有許多褶皺，其前端呈現出淡黃色或乳白色透明狀，芽管狀器官發育出乳突狀物。管花肉蓯蓉的萌發過程經歷了由初生吸器逐漸發育出次生吸器階段，吸器的發生是寄主植物能否建立寄生關系的關鍵。

2.2管花肉蓯蓉入侵檉柳根的形態變化

管花肉蓯蓉種子從萌發到侵入檉柳根木質部約需10 d，在體視顯微鏡下觀察，發現管花肉蓯蓉膨大的乳頭狀突起（圖1）頭部出現了淡黃色的分泌物，此現象在小列當和大麻列當愈傷組織上曾經報道過[7]。但其化學成分有待于進一步鑒定，初步推測為一些水解酶類物質，能促使檉柳根細胞壁溶解，以便于管花肉蓯蓉侵入寄主根部。多數管花肉蓯蓉種子芽管狀器官一旦接觸到寄主根，芽管狀器官即停止伸長，其頭部形成膨大的具乳突狀物器官，芽管狀器官端分泌一些酶類物質侵入寄主皮層。一旦管花肉蓯蓉吸器的導管和檉柳根系的導管相連接（圖2），管花肉蓯蓉就可以從寄主木質部攝取水分和無機鹽，滿足自身生長需求。

2.3管花肉蓯蓉寄生檉柳根部形態解剖結構

在顯微鏡下對管花肉蓯蓉、檉柳接合處的石蠟切片進行觀察（圖3），結果顯示，管花肉蓯蓉莖的結構為草本雙子葉植物莖結構，由表皮、皮層、維管組織組成。管花肉蓯蓉的吸器均由大量長方形薄壁細胞和螺紋導管組成。吸器與寄主檉柳木質部接觸處為多數體積小、細胞質濃的薄壁細胞和螺紋導管，細胞核小而多，吸器的導管與檉柳根的導管相連接，由這些細胞從寄主木質部攝取水分和無機鹽，再由吸器薄壁組織轉運到吸器導管輸送到莖和葉，形成一個輸送水溶液的通道。

3小結

關于管花肉蓯蓉種子萌發與寄生生理方面的研究還很薄弱，很多問題尚待研究。采用木箱-玻璃板法研究管花肉蓯蓉與檉柳的接種過程，能明確管花肉蓯蓉種子從萌發到寄生的整個生長階段，對每個生長階段的管花肉蓯蓉和檉柳進行形態學和解剖學觀察，以明確管花肉蓯蓉吸器的生長發育、寄生時間、寄生距離和寄生的主動性等問題，從而提高肉蓯蓉田間接種率和接種同步性，避免了只有通過人工采挖才能確定管花肉蓯蓉寄生過程的盲目性。該方法操作簡單，在室內即可進行，條件可控，適用于工廠化生產管花肉蓯蓉-檉柳復合苗，對管花肉蓯蓉高效接種技術的形成具有重要意義，對進一步探索寄生植物寄生過程與寄生機理具有一定的理論和實踐價值。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會. 中國藥典：一部[S]. 北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[2]Baird W V，Riopel J L. Experimental studies of the attanchment of the parasitic angiosperm Agalinis purpurea to a host[J]. Protoplasma，1983，118：206.

[3]Lane J A，Bailey J A，Terry P J. In-vitro growth system for studying the parasitism of cowpea（Vigna unguiculata）by striga gesnerioides[J]. Weed Research，1991，31（4）：211-217.

[4]李天然，許月英，戈建新，等. 肉蓯蓉（Cistanche deserticola Ma）種子的萌發及與寄主梭梭（Halaxylon ammodenron Bunge）的關系[J]. 內蒙古大學學報：自然科學版，1989，20（3）：395-400.

[5]王華磊，楊太新，楊重軍，等. 管花肉蓯蓉種子萌發和寄生過程的形態學研究[J]. 中國中藥雜志，2005，30（23）：1812-1814.

[6]馬東明，楊太新，陳慶亮，等. 管花肉蓯蓉與檉柳試管苗離體接種的研究[J]. 植物學通報，2005，22（6）：687-691.

[7]Zhou W J，Yoneyama K，Takeuchi Y，et al. In vitro infection of host roots by differentiated calli of the parasitic plant Orobanche[J]. Journal of Experimental Botany，2004，55（398）：899-907.成明超，李丹霞，王康才，等. 5個藥用菊花品種類型主要化學成分的動態累積[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：213-215.