殼聚糖酶產生菌的選育及產酶能力研究

溫鋼　劉海燕　楊梅

摘要：從某水產市場附近土壤中分離篩選出4株具殼聚糖酶能力的微生物菌株，其中菌株S03具有較高的產酶能力，經鑒定屬于毛霉屬（Mmucor sp.）。試驗條件下該菌株培養3 d時，發酵液中殼聚糖酶活性最高。并進一步證明該菌株所產殼聚糖酶屬于誘導型殼聚糖酶，適量添加葡萄糖有助于殼聚糖酶的產生。

關鍵詞：殼聚糖酶；酶活力；鑒定

中圖分類號： Q939.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0347-02

收稿日期：2013-05-07

作者簡介：溫鋼（1976—），男，吉林四平人，碩士，講師，研究方向為應用微生物。E-mail：315554062@qq.com。殼聚糖（chitosan）別稱甲殼胺，是甲殼質脫去部分乙酰基的產物，是一類由2-氨基-2-脫氧-葡萄糖和2-乙酰氨基-2-脫氧-葡萄糖（<40%）單體通過β-1，4糖苷鍵連接而成的直鏈多糖[1]。殼聚糖是自然界中唯一的天然陽離子高聚物，其特殊的化學結構決定了這種高聚物有著獨特的生物活性。殼聚糖具有提高人體免疫力、促進傷口愈合、降血脂、降血壓等保健作用，是一種有廣泛應用前景的醫療保健材料[2]。另外，殼聚糖還有很好的殺菌、抑菌作用。但是由于殼聚糖分子量大，不溶于水，不易被人體吸收，從而限制了這種物質作為醫療保健品的應用。利用殼聚糖降解得到殼低聚糖，不但容易被人體吸收，而且某些殼寡聚糖還有許多新穎的生物活性，在治療癌癥和提高人體免疫力方面有很好的試驗效果[3]。目前降解殼聚糖的方法主要有化學降解法和酶降解法，其中酶降解法以降解過程容易控制、反應條件溫和以及對環境沒有污染等優點成為殼聚糖降解的首選途徑[4]，因此進一步選育殼聚糖酶產生菌株就顯得尤為重要。本研究選育出具有一定產殼聚糖酶能力的菌株，并初步考察了其產酶能力，以期為后續殼聚糖酶發酵生產及應用研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

殼聚糖和氨基葡萄糖購于國藥集團化學試劑有限公司。其他試劑均為國產分析純。

膠體殼聚糖：取5 g殼聚糖加入100 mL 0.4 mol/L HCl溶液中，50 ℃攪拌至殼聚糖完全溶解，加入1 mol/L NaOH溶液調節pH值至5.0，得5%膠體殼聚糖。

1.2培養基

膠體殼聚糖液體培養基：A液：1%膠體殼聚糖；B液：04% K2HPO4·3H2O，0.2% KH2PO4，0.14% MgSO4·7H2O，0.1% NaCl，0.1% KCl，0.02% CaCl2，0.1%酵母粉，3%瓊脂，pH值7.2；將A液、B液分別滅菌后等體積混合。

殼聚糖粉末培養基：1%殼聚糖粉末，0.07% K2HPO4·3H2O，0.03% KH2PO4，0.05% MgSO4·7H2O，0.03%蛋白胨，0.03%酵母粉，pH值7.2。

1.3方法

1.3.1菌株初篩將采集土樣加入適量蒸餾水搖勻，梯度稀釋后，涂布于膠體殼聚糖固體培養基平板上，30 ℃培養3～5 d，逐一挑取平板上生長狀況良好且能夠形成水解圈的菌株，再次接種于膠體殼聚糖固體培養基平板，測定菌落直徑和透明圈直徑，進一步比較菌株利用殼聚糖的能力。將分離所得菌株分別編號，進一步參考相關文獻[5]進行菌種鑒定。

1.3.2菌株降解能力考察將菌株接種于殼聚糖液體培養基中，接種后于150 r/min、30 ℃振蕩培養，定時取樣，12 000 r/min 離心10 min后得粗酶液，采用DNS法測定殼聚糖酶活性[6]。具體方法為：在0.5 mL粗酶液中加入磷酸緩沖液（pH值7.2）1.0 mL和1%膠體殼聚糖0.5 mL，混勻后于46 ℃保溫30 min，沸水浴10 min。4 000 r/min離心5 min后，取2 mL上清液與1 mL DNS試劑混合，沸水浴中反應5 min后冷卻至室溫，加入4 mL去離子水，混勻后于540 nm處測定吸光度，并根據氨基葡萄糖標準曲線計算殼聚糖酶活性。

酶活性單位的定義：pH值 7.2、溫度46 ℃時，1 mL樣品1 min催化生成1 μmol氨基葡萄糖的還原糖量所需的酶量為1個酶活單位（U/mL）。

1.3.3菌株生長曲線的測定將菌株接入液體培養基中培養，定時取樣，測定菌體干重和發酵液酶活性，考察菌株生長曲線和酶活性隨時間變化的規律。

1.3.4其他影響菌株產酶能力因素的考察

1.3.4.1不同碳源對產酶誘導的影響在液體培養基中，分別以1%殼聚糖粉末、1%膠體殼聚糖、1%甲殼質、1%可溶性淀粉、1%葡萄糖、1%蔗糖、1%殼聚糖粉末+0.1%葡萄糖、2%殼聚糖粉末+0.1%葡萄糖、5%殼聚糖粉末+0.1%葡萄糖、1%殼聚糖粉末+1%葡萄糖作為碳源，接入菌種后150 r/min、30 ℃振蕩培養72 h，測定殼聚糖酶活性，考察碳源對菌株產酶能力的影響。

1.3.4.2培養溫度對產酶的影響將菌株接入裝有100 mL殼聚糖粉末液體培養基的250 mL三角瓶中，分別在25、28、30、35、37 ℃下150 r/min振蕩培養3 d后，測定發酵液酶活性，考察培養溫度對菌株產酶的影響。

1.3.4.3培養基起始pH值對產酶的影響將菌株接入裝有100 mL殼聚糖粉末液體培養基的250 mL三角瓶中，將培養基起始pH值分別調至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，150 r/min振蕩培養72 h后，測定發酵液酶活性，考察培養基起始pH值對菌株產酶的影響。

2結果與分析

2.1菌株初篩

經富集培養、反復劃線分離與純化，得到4株能在膠體殼聚糖固體培養基上生長并形成水解圈的菌株，分別編號為S01、S02、 S03、S04。挑取純化菌株接種于PHBV膠體殼聚糖固體平板培養基，30 ℃培養72 h后測量菌落直徑（d）、水解圈直徑（D），結果見表1。endprint

2.2菌株S03的分類鑒定

菌株S03的菌落形態不定型，培養初期菌絲呈白色，后轉為灰白色至黑色，菌絲在培養基內外能廣泛蔓延，無假根或匍匐菌絲。菌絲無隔、多核、分枝狀，成熟菌絲體上直接生出單生、總狀分枝或假軸狀分枝的孢囊梗。各分枝頂端著生球形孢子囊，孢囊孢子呈球形。這些性質與毛霉屬（Mucor）微生物菌株的基本性質一致，依據Ainsworth分類系統初步鑒定菌株S03屬于毛霉屬。

2.3菌株S03生長曲線及培養時間對其產酶能力的影響

在微生物液體發酵過程中，為了高度積累目的產物，常須要掌握發酵代謝和酶活性的最旺盛時期，該時期也是高效積累產物的時期。微生物各生長階段對目的產物都有重要影響，因此必須根據不同微生物生長特點，把其控制在有利于增加目的產物的最適條件下培養。由圖1可知，從菌株S03的生長曲線和產酶時程來看，在培養1～6 d時菌株穩定生長，產酶高峰出現在培養3 d，此時殼聚糖酶活性達到1.37 U/mL。

2.4不同碳源對菌株 S03產殼聚糖酶的影響

不同碳源對菌株 S03產酶的影響見表2。殼聚糖酶包括組成型和誘導型，其中多數為誘導型。本研究中只有以殼聚糖或與其結構類似物作為碳源時才能誘導產酶，僅以蔗糖或葡萄糖為碳源菌株雖能生長良好卻不能誘導產酶[7]。添加葡萄糖促進了酶活性的增長，說明菌株 S03產生的殼聚糖酶也屬于誘導型殼聚糖酶；但葡萄糖添加過多，并不利于殼聚糖酶的產生。試驗還發現，菌株S03在以甲殼質和殼聚糖為誘導物的培養基中產酶能力差別較大，表明該菌株為較專一的產殼聚糖酶菌株。

表2不同碳源對菌株S03產酶能力的影響

碳源1酶活性（U/mL）1%粉末殼聚糖10.961%膠體殼聚糖11.391%甲殼質10.501%葡萄糖10.001%蔗糖10.001%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖11.932%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖12.175%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖12.271%粉末殼聚糖+1%葡萄糖10.40

2.5溫度、pH值等發酵條件對產酶的影響

由圖2可見，培養溫度為28～30 ℃時，菌株S03產殼聚糖酶能力較高。

由圖3可見，培養基起始pH值對產酶的影響比較明顯，當pH值為5.5～6.5時菌株S03產酶能力較高，pH值為6.0時該菌產酶能力最強，酶活性最高。

3結論

本研究通過平板劃線分離法篩選到4株產酶能力較強的菌株，在以殼聚糖為唯一碳源的培養基上均可產生明顯的水解透明圈，其中菌株 S03產酶能力較強，系統分離鑒定表明

其屬于毛霉屬。在試驗條件下菌株 S03產酶高峰出現在培養3 d時，在以粉末殼聚糖作為碳源的培養基中適量添加葡萄糖可以促進菌體增殖從而更利于產酶，說明該菌株產生的殼聚糖酶屬于誘導酶。本研究為進一步開發利用微生物殼聚糖酶資源奠定了基礎。

參考文獻：

[1]戴蕓，朱旭芬. 微生物殼聚糖酶的研究概況[J]. 浙江大學學報：農業與生命科學版，2004，30（2）：229-236.

[2]陳小娥，夏文水，余曉斌. 微生物殼聚糖酶研究進展[J]. 海洋科學，2004，28（3）：72-76.

[3]Tanaka T，Fujiwara S，Nishikori S，et al. A unique chitinase with dual active sites and triple substrate binding sites from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1[J]. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（12）：5338-5344.

[4]Sugita A，Sugii A，Sato K，et al. Cloning and characterization of a gene coding for a major extracellular chitosanase from the koji mold Aspergillus oryzae[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2012，76（1）：193-195.

[5]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海：上海科學技術出版社，1979：58-91.

[6]張龍翔，張庭芳，李令媛. 生化試驗方法和技術[M]. 2版.北京：高等教育出版社，1997：1-2.

[7]Dhillon G S，Brar S K，Valero J R，et al. Bioproduction of hydrolytic enzymes using Apple pomace waste by A. niger：applications in biocontrol formulations and hydrolysis of chitin/chitosan[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，2011，34（8）：1017-1026.張紅，沈永龍，黃金田，等. 幾種池塘養殖模式對水體葉綠素a含量周年變化的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：349-350.endprint

2.2菌株S03的分類鑒定

菌株S03的菌落形態不定型，培養初期菌絲呈白色，后轉為灰白色至黑色，菌絲在培養基內外能廣泛蔓延，無假根或匍匐菌絲。菌絲無隔、多核、分枝狀，成熟菌絲體上直接生出單生、總狀分枝或假軸狀分枝的孢囊梗。各分枝頂端著生球形孢子囊，孢囊孢子呈球形。這些性質與毛霉屬（Mucor）微生物菌株的基本性質一致，依據Ainsworth分類系統初步鑒定菌株S03屬于毛霉屬。

2.3菌株S03生長曲線及培養時間對其產酶能力的影響

在微生物液體發酵過程中，為了高度積累目的產物，常須要掌握發酵代謝和酶活性的最旺盛時期，該時期也是高效積累產物的時期。微生物各生長階段對目的產物都有重要影響，因此必須根據不同微生物生長特點，把其控制在有利于增加目的產物的最適條件下培養。由圖1可知，從菌株S03的生長曲線和產酶時程來看，在培養1～6 d時菌株穩定生長，產酶高峰出現在培養3 d，此時殼聚糖酶活性達到1.37 U/mL。

2.4不同碳源對菌株 S03產殼聚糖酶的影響

不同碳源對菌株 S03產酶的影響見表2。殼聚糖酶包括組成型和誘導型，其中多數為誘導型。本研究中只有以殼聚糖或與其結構類似物作為碳源時才能誘導產酶，僅以蔗糖或葡萄糖為碳源菌株雖能生長良好卻不能誘導產酶[7]。添加葡萄糖促進了酶活性的增長，說明菌株 S03產生的殼聚糖酶也屬于誘導型殼聚糖酶；但葡萄糖添加過多，并不利于殼聚糖酶的產生。試驗還發現，菌株S03在以甲殼質和殼聚糖為誘導物的培養基中產酶能力差別較大，表明該菌株為較專一的產殼聚糖酶菌株。

表2不同碳源對菌株S03產酶能力的影響

碳源1酶活性（U/mL）1%粉末殼聚糖10.961%膠體殼聚糖11.391%甲殼質10.501%葡萄糖10.001%蔗糖10.001%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖11.932%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖12.175%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖12.271%粉末殼聚糖+1%葡萄糖10.40

2.5溫度、pH值等發酵條件對產酶的影響

由圖2可見，培養溫度為28～30 ℃時，菌株S03產殼聚糖酶能力較高。

由圖3可見，培養基起始pH值對產酶的影響比較明顯，當pH值為5.5～6.5時菌株S03產酶能力較高，pH值為6.0時該菌產酶能力最強，酶活性最高。

3結論

本研究通過平板劃線分離法篩選到4株產酶能力較強的菌株，在以殼聚糖為唯一碳源的培養基上均可產生明顯的水解透明圈，其中菌株 S03產酶能力較強，系統分離鑒定表明

其屬于毛霉屬。在試驗條件下菌株 S03產酶高峰出現在培養3 d時，在以粉末殼聚糖作為碳源的培養基中適量添加葡萄糖可以促進菌體增殖從而更利于產酶，說明該菌株產生的殼聚糖酶屬于誘導酶。本研究為進一步開發利用微生物殼聚糖酶資源奠定了基礎。

參考文獻：

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[7]Dhillon G S，Brar S K，Valero J R，et al. Bioproduction of hydrolytic enzymes using Apple pomace waste by A. niger：applications in biocontrol formulations and hydrolysis of chitin/chitosan[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，2011，34（8）：1017-1026.張紅，沈永龍，黃金田，等. 幾種池塘養殖模式對水體葉綠素a含量周年變化的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：349-350.endprint

2.2菌株S03的分類鑒定

菌株S03的菌落形態不定型，培養初期菌絲呈白色，后轉為灰白色至黑色，菌絲在培養基內外能廣泛蔓延，無假根或匍匐菌絲。菌絲無隔、多核、分枝狀，成熟菌絲體上直接生出單生、總狀分枝或假軸狀分枝的孢囊梗。各分枝頂端著生球形孢子囊，孢囊孢子呈球形。這些性質與毛霉屬（Mucor）微生物菌株的基本性質一致，依據Ainsworth分類系統初步鑒定菌株S03屬于毛霉屬。

2.3菌株S03生長曲線及培養時間對其產酶能力的影響

在微生物液體發酵過程中，為了高度積累目的產物，常須要掌握發酵代謝和酶活性的最旺盛時期，該時期也是高效積累產物的時期。微生物各生長階段對目的產物都有重要影響，因此必須根據不同微生物生長特點，把其控制在有利于增加目的產物的最適條件下培養。由圖1可知，從菌株S03的生長曲線和產酶時程來看，在培養1～6 d時菌株穩定生長，產酶高峰出現在培養3 d，此時殼聚糖酶活性達到1.37 U/mL。

2.4不同碳源對菌株 S03產殼聚糖酶的影響

不同碳源對菌株 S03產酶的影響見表2。殼聚糖酶包括組成型和誘導型，其中多數為誘導型。本研究中只有以殼聚糖或與其結構類似物作為碳源時才能誘導產酶，僅以蔗糖或葡萄糖為碳源菌株雖能生長良好卻不能誘導產酶[7]。添加葡萄糖促進了酶活性的增長，說明菌株 S03產生的殼聚糖酶也屬于誘導型殼聚糖酶；但葡萄糖添加過多，并不利于殼聚糖酶的產生。試驗還發現，菌株S03在以甲殼質和殼聚糖為誘導物的培養基中產酶能力差別較大，表明該菌株為較專一的產殼聚糖酶菌株。

表2不同碳源對菌株S03產酶能力的影響

碳源1酶活性（U/mL）1%粉末殼聚糖10.961%膠體殼聚糖11.391%甲殼質10.501%葡萄糖10.001%蔗糖10.001%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖11.932%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖12.175%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖12.271%粉末殼聚糖+1%葡萄糖10.40

2.5溫度、pH值等發酵條件對產酶的影響

由圖2可見，培養溫度為28～30 ℃時，菌株S03產殼聚糖酶能力較高。

由圖3可見，培養基起始pH值對產酶的影響比較明顯，當pH值為5.5～6.5時菌株S03產酶能力較高，pH值為6.0時該菌產酶能力最強，酶活性最高。

3結論

本研究通過平板劃線分離法篩選到4株產酶能力較強的菌株，在以殼聚糖為唯一碳源的培養基上均可產生明顯的水解透明圈，其中菌株 S03產酶能力較強，系統分離鑒定表明

其屬于毛霉屬。在試驗條件下菌株 S03產酶高峰出現在培養3 d時，在以粉末殼聚糖作為碳源的培養基中適量添加葡萄糖可以促進菌體增殖從而更利于產酶，說明該菌株產生的殼聚糖酶屬于誘導酶。本研究為進一步開發利用微生物殼聚糖酶資源奠定了基礎。

參考文獻：

[1]戴蕓，朱旭芬. 微生物殼聚糖酶的研究概況[J]. 浙江大學學報：農業與生命科學版，2004，30（2）：229-236.

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[3]Tanaka T，Fujiwara S，Nishikori S，et al. A unique chitinase with dual active sites and triple substrate binding sites from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1[J]. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（12）：5338-5344.

[4]Sugita A，Sugii A，Sato K，et al. Cloning and characterization of a gene coding for a major extracellular chitosanase from the koji mold Aspergillus oryzae[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2012，76（1）：193-195.

[5]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海：上海科學技術出版社，1979：58-91.

[6]張龍翔，張庭芳，李令媛. 生化試驗方法和技術[M]. 2版.北京：高等教育出版社，1997：1-2.

[7]Dhillon G S，Brar S K，Valero J R，et al. Bioproduction of hydrolytic enzymes using Apple pomace waste by A. niger：applications in biocontrol formulations and hydrolysis of chitin/chitosan[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，2011，34（8）：1017-1026.張紅，沈永龍，黃金田，等. 幾種池塘養殖模式對水體葉綠素a含量周年變化的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（1）：349-350.endprint