“綠色植物中色素的提取”實驗儀器和技術的改進

曹宏梅+賴紅偉+董順福+韓麗琴+陶然

“綠色植物中色素的提取”是醫學院校多個專業學生的必修實驗，從實驗材料、實驗儀器、裝柱方法以及洗脫劑的選用四個方面對此實驗進行了改進，首先解決了實驗材料的受限性，其次節約了實驗教學的經費，再次簡化了洗脫的步驟，最后避免了有毒試劑的危害，使得色素的提取實驗取得了較好的效果。

綠色植物色素提取實驗儀器實驗技術改進一、改進的背景

有機化學實驗中的“綠色植物中色素的提取”是醫學院校臨床醫學、食品質量與安全、藥學、藥物制劑學、臨床藥學、生物技術、醫學檢驗、臨床輸血、預防醫學和市場營銷等專業學生的一個必修實驗。自2008年至2012年以來，筆者所在院校對此實驗用新鮮菠菜葉作為實驗材料，用層析柱作為柱色譜分離的儀器，用干法裝柱，用9：1石油醚-丙酮、7∶3石油醚-丙酮和3∶1∶1正丁醇-乙醇-水分別作洗脫劑。這種實驗方法，不僅色素分離的步驟繁瑣，而且所用的化學試劑總類多、用量大，存在著諸多弊端，因此很有必要對此實驗進行適當改進。

二、改進的內容

（一）改進實驗材料

此實驗用新鮮的菠菜葉作為實驗材料，由于北方菠菜的種植易受季節的限制，經過大量的實驗驗證，可用韭菜、香菜、生菜、芹菜和空心菜等四季均可種植的蔬菜來代替菠菜。改進后，解決了此實驗的材料具有局限性的弊端。

（二）改進柱色譜分離所用的實驗儀器

改進前，柱色譜分離所用的實驗儀器是層析柱。層析柱是一根下部帶有活塞的玻璃管，這種結構特點使其在使用時存在一定的弊端：首先，身為玻璃儀器存在易被損壞的風險；其次，層析柱價格貴，每根50元；最后，用層析柱進行柱色譜分離，消耗的吸附劑用量較大。

改進后，用分析化學實驗中淘汰下來的酸式滴定管代替層析柱進行柱色譜分離實驗。筆者把分析化學實驗中已破損、可利用的酸式滴定管收集起來，根據儀器實際損壞情況，一方面，可采取用酒精噴燈將酸式滴定管管口破損部位燒熔，進行鈍化處理，以避免破損部位傷人，達到再利用的目的。另一方面，對于活塞損壞的酸式滴定管，可采取將收集的可用活塞和滴定管活塞套內壁多次重新配對，以使玻璃活塞配合緊密，達到可用狀態。將損壞的酸式滴定管經相應處理后，替代層析柱用于柱色譜分離實驗，這種實驗儀器的改進不但沒有影響柱色譜分離的實驗效果，而且具有一定的優點：第一，解決了此實驗層析柱造價高的弊端，減輕了學生賠償儀器的經濟壓力。第二，降低了學校對此實驗的儀器投入成本。第三，節約了吸附劑的使用量。本實驗使用的吸附劑為中性氧化鋁，改進前進行柱色譜分離時需要中性氧化鋁80克，改進后僅消耗20克，大大減少了此實驗所用試劑的經費投入。

（三）改進柱色譜分離技術

1.改進前的操作方法

改進前，用80g中性氧化鋁在層析柱中采用干法裝柱。加樣，先用9∶1的石油醚–丙酮洗脫，當第一個橙黃色色帶流出時，換一接收瓶接收，它是β-胡蘿卜素。換用7:3的石油醚–丙酮洗脫，當第二個棕黃色色帶流出時，換一次接收瓶接收，它是葉黃素。再換用3∶1∶1的正丁醇–乙醇–水洗脫，分別接收葉綠素a（藍綠色）和葉綠素b（黃綠色）。此種色素分離方法缺點較多，如：干法裝柱極易在中性氧化鋁中形成氣泡而影響色素分離效果，若發現柱中已有氣泡存在，應該設法將其排除，若不能排掉，則應該倒出柱內物品重新裝柱。另外分離色素時所用的正丁醇刺激性強，惡臭使人難忍，屬低毒類物質，吞食有害，刺激呼吸系統和皮膚，對眼睛有嚴重傷害，其蒸汽使人頭痛、頭暈和困倦，不利于師生健康的同時還會污染環境。

2.改進后的柱色譜分離

柱色譜分離的改進內容：一方面將裝柱方法由干法改進為濕法，另一方面將三種洗脫劑改進為只用9∶1的石油醚-丙酮一種。改進后，具體的柱色譜分離操作為：

1.先進行濕法裝柱

將酸式滴定管豎直固定在鐵架臺上，關閉活塞，加入9∶1的石油醚–丙酮至滴定管容積的1/4，用干凈的玻璃棒將少量脫脂棉推入滴定管底，擠出其中氣泡，但不可壓得太緊，否則洗脫劑9∶1的石油醚–丙酮將流出太慢或流不出來。將白沙加入滴定管中，使其在脫脂棉上均勻沉積約5mm厚。將20g中性氧化鋁用9∶1的石油醚–丙酮在燒杯浸潤并調成糊狀。打開滴定管活塞，調節流速為1滴/秒，將調好的氧化鋁在攪拌下自滴定管管口緩緩注入管中，同時用套有乳膠管的玻璃棒輕敲管身，使氧化鋁均勻沉降，形成均勻緊密的氧化鋁柱。加完氧化鋁后，在其沉積面上蓋一張直徑與管內徑相當的濾紙片。

2.后進行色素的洗脫

小心放出酸式滴定管中洗脫劑至液面下降到濾紙片處，關活塞，將樣品沿管內壁緩慢加入，不可沖動氧化鋁，否則會致使氧化鋁表面不平而影響色素分離效果。樣品加完后，開活塞，放液至液面降至濾紙片時，關活塞，在不沖動氧化鋁的情況下，用少許洗脫劑沖洗管內壁，再放出液至液面降到濾紙處，再沖洗管內壁，直至管壁和所加洗脫劑沒有顏色。始終保持氧化鋁上面有一段液柱的情況下，不斷加入9∶1的石油醚-丙酮洗脫，當第一個橙黃色色帶流出時，換一接收瓶接收，它是β-胡蘿卜素。當第二個棕黃色色帶流出時，換一次接收瓶接收，它是葉黃素。當第三個藍綠色色帶流出時，換一次接收瓶接收，它是葉綠素a。當第四個黃綠色色帶流出時，換一次接收瓶接收，它是葉綠素b。

3.經過大量的實驗證明

柱色譜分離技術的改進在絲毫未影響以上四種色素的分離效果的同時，又可以簡化不斷更換三種洗脫劑的實驗步驟；減少了實驗技術人員所配試劑的種類；減少了有毒試劑用后回收處理的工作量；減少了有毒試劑對師生身體產生的毒害以及對環境的污染程度。

三、需注意的問題

首先，進行濕法裝柱時，滴定管要垂直于實驗臺面；氧化鋁要一次加完，若分多次加入，則因其沉積為多層，且各層交接處的氧化鋁顆粒細，在分離色素時易被誤認為是一個色素層；氧化鋁的頂面要裝平，否則易使色素帶傾斜，不能接收到單一組分；在裝柱時及裝柱后，要始終保持氧化鋁上面有一段洗脫劑柱，以避免空氣進入氧化鋁，在其內部形成氣泡而影響分離效果。若發現管中已有氣泡，應設法排除，防止發生斷層和裂縫現象，若不能排除氣泡，則應重新裝柱。

其次，要避免樣品溶液在加樣時被沖稀，否則易造成色素帶過寬，各色素的界限不清晰的后果。

最后，控制洗脫劑的流速為1滴/秒。流速太快或太慢都會影響分離效果。

參考文獻：

[1]李富霞，王富余.“綠葉中色素的提取和分離”實驗步驟的改進[J].生物學通報，2010，45（1）：49-50.

[2]王晶晶.綠葉中色素的提取和分離實驗改進[J].教學儀器與實驗，2012，28（7）：30-31.

[3]黃武強.“綠葉中色素的提取和分離”實驗的改進[J].實驗教學與儀器，2010，（11）：25.

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