皮膚衰老過程中TGF-β1，2，3的表達(dá)差異

王露萍 陳煒 余丕軍 石瀟

皮膚老化過程復(fù)雜，受許多細(xì)胞因子影響，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)可能在其中起著重要的作用。TGF-β是一類多功能細(xì)胞因子，其3種異構(gòu)體的生物學(xué)功能不盡相同。與TGF-β2、3相比，TGF-β1與創(chuàng)傷修復(fù)的關(guān)系更為密切，對(duì)成纖維細(xì)胞及其他間葉組織來源細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生、增殖和分化過程起著重要作用[1]；TGF-β2能夠誘導(dǎo)胚胎發(fā)育過程中中胚層的形成，促進(jìn)毛囊等皮膚輔助結(jié)構(gòu)的形成[2]；TGF-β3對(duì)角質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖具有強(qiáng)烈的抑制作用[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討TGF-β1，2，3在不同年齡SD大鼠皮膚組織中表達(dá)的變化，及其可能的生物學(xué)意義，深入揭示TGF-β與皮膚衰老過程的關(guān)系和內(nèi)在規(guī)律，為進(jìn)一步研究人類皮膚衰老機(jī)制提供相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

采用清潔級(jí)成年雌性SD大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)12只。其中，2月齡6只(青年組)，18月齡6只(老年組)，取頸背部4 cm×4 cm大小皮膚組織，備用。

TGF-β1抗體SC-146、TGF-β2抗體SC-90、TGF-β3抗體SC-82(Santa Cruz公司，美國)；hrp標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Jackson Immunology公司，美國)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用Western blot檢測兩組大鼠皮膚樣本中TGF-β1，2，3的蛋白表達(dá)情況。

組織塊勻漿后PBS沖洗，重懸洗滌離心，收獲細(xì)胞。細(xì)胞沉淀加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑混合液(100∶1)裂解1 h，12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液，加入上樣緩沖液，95℃水浴10 min，-80℃保存。比色法測定蛋白濃度，定量上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳1.5～2.0 h。轉(zhuǎn)膜后加一抗稀釋液(TGF-β1抗體SC-146，TGF-β2抗體SC-90，TGF-β3抗體SC-82)，稀釋濃度1∶5 000，4℃過夜。第2天PBS-T洗膜后加入稀釋的二抗，hrp標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶10 000)，37℃孵育1 h，PBS-T洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測顯影。底片通過凝膠灰度分析軟件Image J進(jìn)行灰度值定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差齊性和正態(tài)分布檢驗(yàn)，并通過單因素ANOVA分析比較均值。結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

TGF-β1在青年組大鼠皮膚中呈強(qiáng)陽性表達(dá)(Western blot灰度值相對(duì)定量1.91±0.67)，而在衰老組大鼠的皮膚組織呈陰性表達(dá)(Western blot灰度值相對(duì)定量0.14±0.09)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0001)，說明TGF-β1在皮膚衰老過程中的表達(dá)存在顯著差異。

TGF-β2在青年組Western blot灰度值相對(duì)定量為0.16±0.07，衰老組該值為0.1±0.04，均呈陰性表達(dá)(P=0.17)。

TGF-β3在青年組Western blot灰度值相對(duì)定量為0.95±0.20，衰老組該值為0.80±0.26，均呈陽性表達(dá)(P=0.26)(圖1-4)。

圖1 TGF-β1蛋白電泳(Western blot)Fig.1Expression of TGF-β1 by western blot

圖2 TGF-β2蛋白電泳(Western blot)Fig.2Expression of TGF-β2 by western blot

圖3 TGF-β3蛋白電泳(Western blot)Fig.3Expression of TGF-β3 by western blot

圖4 TGF-β1，2，3蛋白相對(duì)定量Fig.4Relative quantification of TGF-β1,2,3

3 討論

皮膚衰老是一個(gè)復(fù)雜的、多因素作用引起的一系列功能與美學(xué)改變的過程，與遺傳、免疫、自由基、成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子等諸多因素有關(guān)。老化皮膚的組織學(xué)改變主要表現(xiàn)為膠原蛋白減少和彈性纖維片段增加；分子學(xué)改變主要表現(xiàn)為表皮增生和分化性標(biāo)志表達(dá)異常[4]。成纖維細(xì)胞作為真皮中的主體細(xì)胞成分，在衰老的過程中發(fā)揮了核心作用[5-6]。其主要生物學(xué)功能是分泌膠原纖維、彈性纖維及各種基質(zhì)成分，如硫酸軟骨素及透明質(zhì)酸等，和各種蛋白質(zhì)的復(fù)合物，如蛋白多糖。這些共同構(gòu)成了皮膚充盈、承受拉力、保持光滑有彈性的物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。衰老皮膚的成纖維細(xì)胞數(shù)量逐漸減少、合成膠原蛋白和彈性蛋白的能力下降，且Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的比例變小，膠原纖維變粗，出現(xiàn)異常交鏈。同時(shí)分泌基質(zhì)降解蛋白酶(MMPs)增加，MMPs能特異性降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分，使膠原纖維減少、彈性纖維斷裂紊亂，皮膚出現(xiàn)皺紋[8]。

研究表明，TGF-β三種異構(gòu)體在皮膚表皮層、真皮層以及毛囊和汗腺細(xì)胞內(nèi)都有表達(dá)[10]。與TGF-β2，3相比，TGF-β1作為成纖維細(xì)胞的主要趨化因子，與創(chuàng)傷修復(fù)、皮膚老化的關(guān)系顯得尤為密切；TGF-β2隨著毛囊的發(fā)育成熟，其在毛囊細(xì)胞內(nèi)表達(dá)顯著增強(qiáng)，而TGF-β3則在角質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯。

TGF-β1對(duì)成纖維細(xì)胞及其他間葉組織來源的細(xì)胞有明顯的刺激作用，主要分布于表層基底細(xì)胞及胞外基質(zhì)中，可以通過增加基質(zhì)蛋白的合成，如膠原蛋白、糖蛋白的表達(dá)和分泌，加強(qiáng)細(xì)胞黏附蛋白受體的轉(zhuǎn)錄、翻譯和處理過程；并可減少M(fèi)MPs的合成，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生、增殖和分化過程起著重要作用，有利于胚胎發(fā)育和細(xì)胞修復(fù)、組織修復(fù)[9]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGF-β1在不同年齡的SD大鼠皮膚組織中表達(dá)有顯著差異，在青年組大鼠皮膚中TGF-β1蛋白表達(dá)強(qiáng)，而在衰老組大鼠的皮膚組織中呈陰性表達(dá)，提示皮膚的生長發(fā)育、表型和功能的維持可能存在TGF-β1介導(dǎo)的信號(hào)通路參與，并且內(nèi)源性TGF-β1可能是皮膚修復(fù)與再生的重要內(nèi)源性調(diào)控因子。

TGF-β2主要分布于汗腺細(xì)胞及毛囊細(xì)胞中，能夠誘導(dǎo)胚胎發(fā)育過程中中胚層的形成，促進(jìn)毛囊等皮膚輔助結(jié)構(gòu)的形成[10]，在本實(shí)驗(yàn)中，各年齡組大鼠的皮膚組織中TGF-β2含量極少，年齡差異不明顯，提示TGF-β2在皮膚組織中的含量極微，對(duì)皮膚的老化產(chǎn)生的影響可能較TGF-β1、3小。

有研究采用MTT比色法檢測TGF-β3對(duì)瘢痕組織成纖維細(xì)胞增殖活性的影響，并以3H-脯氨酸摻入法檢測細(xì)胞內(nèi)膠原合成及TGF-β1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果證實(shí)，TGF-β3可抑制成纖維細(xì)胞的增殖，下調(diào)TGF-β1蛋白及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)[11]。本實(shí)驗(yàn)中，TGF-β3在不同年齡的SD大鼠皮膚組織中有著相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)，年輕組表達(dá)少于TGF-β1卻明顯多于TGF-β2，而老年組表達(dá)均高于另外兩種蛋白，提示TGF-β3可能在抑制成纖維細(xì)胞增殖，下調(diào)TGF-β1蛋白及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)方面對(duì)皮膚的衰老有一定的促進(jìn)作用。

因此，我們可以認(rèn)為在三種TGF-β蛋白中，TGF-β1表達(dá)的改變可能在皮膚衰老過程中起到主要作用，而TGF-β3通過何種機(jī)制對(duì)皮膚衰老產(chǎn)生影響還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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