對蝦白斑綜合征病毒結構蛋白基因vp 95表達時序分析及其抗體的制備

高美玲，徐麗美，李 鈁，楊 豐＊

（1.廈門大學海洋與地球學院，福建 廈門361102；2.國家海洋局第三海洋研究所，海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門361005）

對蝦白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是引起對蝦爆發流行病的病原體［1］，該病發病快、傳播速度快、致病能力強.感染該病毒的養殖場3～10d內達到100%死亡率［1－4］，給蝦類養殖業帶來巨大的經濟損失，目前已成為蝦養殖產業中危害最大的病原.WSSV是線形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒屬（Whispovirus）的唯一成員.病毒粒子形態呈桿狀型，大小約（250～380）nm×（70～150）nm，最外層是由2層單位膜組成的囊膜，緊接囊膜向內的是核衣殼.該病毒的基因組為雙鏈環狀DNA，大小約300kb，目前共測序完成3株病毒的全基因組序列［5－7］.

在WSSV基因組測序的基礎上，利用蛋白質質譜技術對WSSV病毒粒子的結構蛋白進行分析鑒定，共鑒定42個結構蛋白［8－9］.經鑒定蛋白VP95不僅存在于膜蛋白，核衣殼蛋白中也有它的分布［8］，Tsai等［10］提出病毒粒子除了有核衣殼和囊膜外，在核衣殼和囊膜之間還有第3種結構稱為外被（tegument），因此一些蛋白就被歸類為外被蛋白，其中就包括蛋白VP95.這些研究結果表明，VP95是一種很重要的結構蛋白，可能對于病毒的包裝起著極其重要的作用.為了深入研究蛋白VP95的功能，以及它在病毒粒子中的定位，本研究通過逆轉錄PCR的方法確定基因vp95的轉錄時間，確定其為晚期基因.其次嘗試制備能夠用于VP95蛋白檢測，蛋白質定位等研究的專一性抗體，為該結構蛋白后續研究奠定基礎.

1 材料和方法

1.1 材 料

本實驗所用淡水克氏原螯蝦（Procambarus clakia）購于廈門市第八市場；TRL REAGENT為Mrcgene公司產品；逆轉錄試劑盒為Roch公司產品；菌株大腸桿菌（Escherichiacoli）XL1－Blue和BL－21（DE3）由本實驗室保存；質粒pMD18－T Vector、T4 DNA ligase、限 制 性 內 切 酶、RNase－free DNase I、RNase inhibitor、Oligo（dT）引物均為TaKaRa公司產品；pET－His購于美國基因動力實驗室有限公司；Ni2＋－NTA agaros購于Qiagen公司；20×TBST緩沖液購自上海生工生物工程有限公司；HiTrap NHS－activated HP親和層析純化柱子為GE Healthcare公司產品；抗生素氨芐青霉素為山東魯抗醫藥股份有限公司產品；蛋白胨、酵母膏、瓊脂為英國Oxoid公司產品；小量提取質粒試劑盒購于OMEGA公司；引物合成由上海生工生物工程技術有限公司完成；測序由上海英濰捷基貿易有限公司完成；多克隆抗體由廈門大學醫學院陳福課題組制備；鼠抗組氨酸IgG購自SIGMA公司；堿性磷酸酶偶聯的羊抗鼠IgG購自Promega公司；其余試劑均為國產分析純試劑.

1.2 方 法

1.2.1 WSSV病毒粒子的純化及基因組的提取

WSSV病毒粒子的純化和基因組的提取參考本實驗室已發表的方法［5，11］.取100μL純化的病毒粒子懸液，加入終質量濃度0.05mg／mL的 Triton X－100，10 000g離心10min，得到的沉淀樣品為病毒核衣殼蛋白（nucleocapsid protein），上清樣品為病毒囊膜蛋白（envelope protein）.

1.2.2 RT－PCR

克氏原螯蝦感染WSSV后（肌肉注射108病毒粒子／只），不同時間點取樣（0，2，4，6，8，12h）.步足肌肉總RNA的提取參照TRL REAGENT試劑盒說明，隨后用逆轉錄酶以及Oligo（dT）引物逆轉錄得到cDNA，以cDNA作為模板，分別用ie1、vp28、vp95或β－actin的特異性引物對（表1）進行PCR擴增.PCR產物經2%（質量分數，下同）瓊脂糖凝膠電泳，并用紫外成像儀觀察結果.

表1 RT－PCR分析引物序列Tab.1 Primer sets used for RT－PCR analysis

1.2.3vp95基因片段的克隆

基因vp95位于WSSV基因組中255 075～257 474nt，對應的ORF為 WSV442.經過生物學軟件DNAstar分析該基因所編碼蛋白的抗原性，選擇其中間200個氨基酸進行克隆表達，分布在vp95基因的1 051～1 650nt.引物序列：5′－AGCggatccGAGCATCCTCTATCCCCTTCTATT－3′ （下 劃 線 為BamH I 酶 切 位 點 ），5′－AGCaagcttTTCCAGTCTGACGACCCTGAC－3′（下劃 線為HindIII酶切位點）；以純化的 WSSV基因組作為模板，PCR程序如下：95℃變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共25個循環；72℃延伸10min.PCR產物經BamH I和HindIII雙酶切反應后，瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收，然后將其連接至帶有6個組氨酸標簽的表達載體pET－His，并測序驗證.

1.2.4 重組蛋白的表達純化

將測序正確的質粒pET－His－VP95－M200轉化至大腸桿菌BL－21（DE3），同時轉化pET－His作為對照組.挑取單菌落分別轉接至5mL含有100μg／mL氨芐青霉素的LB培養基中，37℃搖床培養6h后，按照1∶200轉接于200mL LB培養基（含100μg／mL氨芐青霉素）.培養至細菌生長對數中期（OD600值達到0.6）時，加入異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度0.1mmol／L，20℃誘導表達24h.誘導前后分別取適量菌液進行SDS－PAGE分析.收集誘導后的大腸桿菌細胞，超聲裂解細胞后，用特異性結合His標簽的Ni2＋－NTA agaros純化表達的重組蛋白.

1.2.5 多克隆抗體的制備及純化

用純化的重組蛋白His－VP95－M200免疫小鼠，免疫4周后眼球取血，去除血細胞得到血清.抗體純化根據HiTrap NHS－activated HP純化柱試劑盒的操作說明.首先，經 Ni2＋－NTA agaros純化的抗原 His－VP95－M200 用 Coupling buffer （0.2mol／L NaHCO3，0.5mol／L NaCl，pH 8.3）稀釋至終質量濃度1mg／mL，將抗原溶液注入HiTrap柱子，4℃吸附4h.分別用18mL Buffer A （0.5mol／L氨基乙醇，0.5mol／L NaCl，pH 8.3）和 18mL Buffer B（0.1 mol／L乙酸鈉，0.5mol／L NaCl，pH 4）洗滌.然后，用Binding buffer（0.5mol／L NaCl，10mmol／L Tris－HCl4，pH 7.5）稀釋多抗血清，經0.45μm的過濾器過濾后與抗原柱結合，再用5～10倍柱子體積的Binding buffer洗滌.最后，用2倍體積 Elution buffer（0.1 mol／L 甘氨酸，pH 2.5）洗脫，洗脫液立即用1mol／LTris－HCl pH 8.0調節pH至中性.

1.2.6 SDS－PAGE和 Western blot分析

重組表達的蛋白樣品和病毒組分的蛋白樣品按4∶1比例加入5×SDS樣品緩沖液，混勻后，煮沸10 min，冷卻至室溫后進行SDS－PAGE分離，經考馬斯亮藍染色、脫色后，觀察分析結果.

對于Western blot分析，SDS－PAGE后不進行考馬斯亮藍染色，用半干式電轉移法將蛋白轉移至PVDF膜上，在含有5%（質量分數）脫脂奶粉的TBST中室溫封閉1h，加入抗目標蛋白的鼠抗抗體（1∶5 000稀釋）或者制備的抗血清，室溫溫育1h.在TBST漂洗3次后，PVDF膜與稀釋在封閉液中的堿性磷酸酶偶聯的羊抗鼠IgG（1∶10 000）溫育1h，TBST漂洗3次，在NBT／BCIP顯色液中.待出現清晰條帶后，將膜轉移至蒸餾水中終止反應即可.

2 結 果

2.1 基因vp95的表達時序分析

通過收集克氏原螯蝦感染WSSV后不同時間的腹足樣品，用RT－PCR分析vp95的轉錄時間，同時還檢測了已經被鑒定的極早期基因ie1［12］和晚期基因vp28.結果表明（圖1），從4h開始vp95開始轉錄，6 h轉錄水平有些增加，直到12h一直維持在這個水平.極早期基因ie1在2h就開始轉錄，并且之后一直保持同一轉錄水平.而vp28也是從4h開始轉錄，6h后轉錄有所增加.基因vp28和vp95都編碼病毒結構蛋白，且起始轉錄時間相同.因此，vp95也是一個晚期基因.

2.2 重組蛋白的克隆表達及純化

通過DNAstar軟件分析vp95基因所編碼的蛋白，截取vp95基因中間編碼200氨基酸的序列（1 051～1 650nt），該氨基酸片段親水性強，不含有α螺旋，抗原性較好.以WSSV基因組為模板，設計引物，通過PCR擴增得到600bp的片段，擴增結果經1.2%的瓊脂糖電泳分離，與預測600bp大小一致（圖2）.此片段依次克隆到pMD18－T Vector和pET－His載體中，經雙酶切鑒定（圖2）后測序驗證，成功構建質粒pETHis－VP95－M200.

將質粒 pET－His－VP95－M200轉化至表達宿主BL－21，加入IPTG 20 ℃ 誘 導表達 重組蛋白.SDSPAGE分析顯示，加入IPTG誘導后約在32ku的位置有明顯的融合蛋白表達帶（圖3，泳道2），而未經IPTG誘導的全菌對應位置的樣品無明顯條帶（圖3，泳道1）.誘導后的細菌經超聲波破裂后離心，用Ni2＋－NTA agaros純化，獲得純化的 His－VP95－M200融合蛋白（圖3，泳道3）.Western blot檢測得到的是帶有His標簽的融合蛋白（圖3，泳道4）.

圖1 RT－PCR對vp95的表達時序分析Fig.1 Time course analysis of vp95 transcripts by RT－PCR

2.3 抗體的特異性分析

將WSSV的EP、NP和全病毒粒子（virion，V）樣品經10%（質量分數）SDS－PAGE電泳分離（圖4（a）），考馬斯亮藍染色后出現許多病毒結構蛋白的條帶.為了測定制備的VP95抗體的專一性，將抗血清稀釋不同濃度，以囊膜蛋白、核衣殼蛋白和全病毒粒子樣品為底物，Western blot檢測蛋白 VP95（圖4（b）），發現僅VP95能呈現清晰條帶，說明制備的VP95抗體特異性強.同時，制備感染了WSSV的克氏螯蝦的造血組織（hematopoietic tissue，HT）的樣品，用制備的抗體作為一抗，檢測其中的蛋白VP95.結果顯示抗體可以專一性的檢測到組織中的VP95蛋白（圖4（b））.

3 討 論

對于雙鏈DNA病毒而言，其基因組的表達呈時序性，可分為極早期（immediately early）、早期（early）、晚期（late）基因.WSSV基因的轉錄活性已經在對蝦和淡水螯蝦中有廣泛的研究，許多基因的轉錄時序已經被確定，包括極早期基因19個（ie1、ie2、ie3［12］、wsv051、wsv083、wsv249［13］等），早期基因 5個（rr1、rr2、pk1、tk－tmk、dnapol）［4－17］，晚期基因6 個（vp664、vp28、vp26、vp24、vp19、vp15）［18］.本研究通過高劑量WSSV（每只含108個病毒數）感染克氏原螯蝦，提取總RNA進行RT－PCR，發現在2h時極早期基因ie1開始轉錄，而在4h時vp95基因開始轉錄，與vp28基因開始轉錄的時間相同，說明vp95也是一個晚期基因.

圖2 VP95－M200PCR產物（a）、重組質粒pMD18－T－VP95－M200（b）和pET－His－VP95－M200雙酶切（c）鑒定電泳分析Fig.2 Electrophoresis analysis of the PCR products of VP95－M200（a），identification of recombinant plasmid pMD18－T－VP95－M200（b）and pET－His－VP95－M200（c）by restriction analysis

圖3 重組蛋白的 His－VP95－M200 12%SDS－PAGE電泳及Western blot分析Fig.3 12%SDS－PAGE and Western blot analysis of the expressed product of His－VP95－M200

圖4 抗體對VP95的檢測分析Fig.4 Analysis of VP95using the prepared antiserum

結構蛋白VP95是WSSV的重要的結構蛋白之一，為了研究它的定位及其在病毒包裝過程中的作用，曾經多次嘗試克隆多個不同位置，不同片段大小的多肽，均為不溶性表達，免疫小鼠得到的多抗對于蛋白VP95的檢測效果并不好，無法滿足對自然狀態下VP95蛋白的免疫金標定位實驗，及其他該蛋白功能研究的要求.本研究首先通過生物學軟件對該蛋白的性質進行分析，選擇vp95基因的1 051～1 650nt，主要是由于這段序列編碼的多肽的親水性氨基酸較多，容易得到可溶性的表達.為獲得可溶性表達產物，嘗試不同程度的低溫誘導，發現16和20℃均為可溶性表達，最終選用20℃作為誘導條件.選用pET－His載體本身包含編碼6個His的序列，能表達出含有His融合標簽的重組蛋白，有利于后期的純化.介質Ni2＋－NTA agaros可用于純化帶有His融合標簽的重組蛋白，該介質價格低廉，純化效率高，通過調整吸附液和洗滌液中咪唑的濃度，可以得到較純的重組蛋白.提高吸附液中咪唑的濃度可以減少對大腸桿菌中蛋白的非特異性吸附，但太高濃度也可能導致重組蛋白結合效率降低.利用該介質獲得了高純度和高濃度的重組蛋白.

將純化的融合蛋白免疫小鼠，得到多抗血清.經Western blot檢測，此血清對結構蛋白VP95有很高的效價，并且有很強的專一性，能滿足多種實驗需求，如 Western bloting、免疫熒光、免疫金標等.同時，Western blot也可以檢測出感染了WSSV的組織中的VP95.但是，多抗血清中不僅含有針對抗原的抗體，同時還含有很多其他的抗體和酶類等.因此，選擇HiTrap NHS－activated HP （GE Healthcare）親和純化柱子純化多抗血清.該純化柱首先與抗原非特異性的結合，并將抗原固定在柱子上，再將血清與結合了抗原的柱子孵育，讓血清中針對該抗原的抗體與抗原結合.通過洗滌，將結合的抗體及雜質去除，最后，用洗脫緩沖液將抗體從柱子上洗脫下來，得到較純的針對VP95蛋白的抗體.經Western blot檢測，仍然有較高的效價，而且去除雜質的血清可以用于免疫金標和免疫熒光等實驗，為進一步研究VP95蛋白的功能，及其在病毒粒子的定位提供了很好的條件.

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