通心絡聯合阿托伐他汀、阿司匹林對ApoE－/－小鼠動脈粥樣硬化病變的影響

王 磊，王宏濤，魏 聰，張軍芳，唐思文，肖維剛

(1.河北以嶺醫藥研究院，河北石家莊 050035;2.河北醫科大學附屬以嶺醫院(國家中醫藥管理局中醫絡病學重點學科)，河北石家莊 050091;3.河北省絡病重點實驗室，4.國家中醫藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)，河北石家莊 050035)

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎，脂質代謝異常和炎癥反應在AS病變的發生和斑塊的形成中起著重要作用［1］。降脂類他汀藥和抗血小板聚集藥阿司匹林均具有一定的抑制AS炎癥反應的作用［2－3］，是目前 AS患者使用最廣泛的兩種藥物。通心絡是近年來臨床上廣泛用于防治心腦血管病的中成藥，具有內皮保護和穩定易損斑塊的作用，可通過調脂、抗炎、抗氧化等多重作用機制發揮抗AS的作用［4］，且可以有效改善阿司匹林抵抗［5］，增強他汀降脂效果，療效互補［6］。上述3種藥物在心腦血管疾病的防治中各有特長，作用互補。近年來有人提出固定劑量的聯合用藥即polypill的策略［7］，長期預防用藥，可以達到防治疾病的效果。基于上述研究，有學者提出阿司匹林(A)、通心絡(T)、他汀(S)聯合應用防治心腦血管疾病的“金三角”方案(ATS)，并取得明顯的臨床療效［8］。但是該方案對ApoE－/－小鼠AS病變的影響研究國內報道甚少。因此本研究著重從脂質代謝和炎性反應角度探討該方案抑制AS的作用，揭示3種藥物聯合應用時的療效優勢。

1 材料與方法

1.1 動物 ApoE－/－小鼠140只，8周齡，♂，體質量20～22 g，北京大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(京)2006-0008。同遺傳背景C57BL/6J小鼠20只，8周齡，♂，體質量20～22 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號:SCXK(京)2006-0009。飼養在河北以嶺醫藥研究院藥理屏障實驗室，光照 12 h·d－1，溫度20℃ ～23℃，相對濕度40%～60%。

1.2 藥物 通心絡超微粉(Tongxinluo):由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、冰片等組成，1.46 g生藥/g超微粉，石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號20101016);阿托伐他汀(立普妥):20 mg/片，7片裝，大連瑞輝制藥有限公司，批號:031711k;腸溶阿司匹林片:100 mg/片，100片裝，拜耳醫藥保健公司提供，批號:018110303。

1.3 主要試劑與儀器 TC、TG、HDL、LDL試劑盒，(北京九強生物);高敏C-反應蛋白(hs-CRP)試劑盒(南京建成);兔抗鼠胞間黏附分子(ICAM-1)、血管細胞黏附分子(VCAM-1)及單核細胞趨化因子-1(MCP-1)多克隆抗體(Santa Cruz);7080型全自動生化分析儀(日本日立);WellscanMK3型全自動酶標儀(芬蘭Lab Systems Dragon);凝膠成像分析儀(美國Biorad)

1.4 方法

1.4.1 造模與分組給藥方法 140只 ApoE－/－小鼠隨機分為模型組(AS)、阿托伐他汀組(ATO)、阿司匹林組(ASP)、通心絡組(TXL)、ATO聯合ASP組(A+A)、3藥聯用低劑量組(ATS-L)及高劑量組(ATS-H)，每組 20 只，均連續給予高脂飼料［9］(熱量組成:碳水化合物20.1%，脂肪59.8%，蛋白質20.1%)。同時選取同遺傳背景C57BL/6J小鼠20只，作為正常對照組(CON)。其中ATO組以6.0 mg·kg－1·d－1灌胃(擬臨床人用量 40 mg·d－1);ASP 組以 25 mg·kg－1·d－1灌胃(擬臨床人用量150 mg·d－1);TXL 組以 1.5 g超微粉·kg－1·d－1灌胃(擬臨床人用劑量4.56 g生藥/d);A+A組以ATO 6.0 mg·kg－1·d－1加 ASP 25 mg·kg－1·d－1灌胃;ATS-L 組以 ATO 3.0 mg·kg－1·d－1加 TXL 1.5 g·kg－1·d－1加 ASP 12.5 mg·kg－1·d－1灌胃;ATS-H 組以 ATO 6.0 mg·kg－1·d－1加 TXL 1.5 g·kg－1·d－1加 ASP 25 mg·kg－1·d－1灌胃;CON組和AS組以等體積的生理鹽水灌胃，12周后，禁食，常規處死，進行檢測。

1.4.2 主動脈病理形態觀察 實驗末，處死小鼠，左心室灌流PBS，心耳下方切開小鼠心臟，分離主動脈根，10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色觀察血管病理形態變化。

1.4.3 血清脂質成分測定 實驗末，禁食12 h，1%戊巴比妥腹腔麻醉小鼠，眼眶后取血，4℃，3 000 r·min－1，離心10 min，取上清分裝，酶比色法測定血清TC、TG、LDL、HDL 水平。

1.4.4 血清hs-CRP測定 取分裝血清，雙抗夾心ELISA法測定hs-CRP水平，操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.4.5 Western blot主動脈 ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的表達 實驗末，麻醉取血處死小鼠，左心室灌流PBS，自主動脈起始部仔細解離主動脈至腹主動脈的髂動脈分叉處，液氮保存。取血管約0.1 g，提取總蛋白后，Nanodrop2000分光光度計蛋白定量，SDSPAGE分離蛋白質，半干轉膜后，含5%脫脂奶粉的TTBS封閉2 h，加入TTBS稀釋(1∶500)的一抗溶液/β-actin(1∶1 000)4℃，過夜。脫色搖床上用TTBS室溫洗膜3次，每次10 min。加入 TTBS 1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h。TTBS洗膜同上，化學發光法檢測蛋白條帶。照相保存，用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用LSD法檢驗。

2 結果

2.1 各組小鼠主動脈病理改變比較 CON組:動脈內膜光滑完整，壁薄，管腔未見狹窄及脂紋斑塊。AS組模型組內皮脫落，呈不連續缺失，內皮下及中膜大量泡沫細胞堆積，管腔狹窄及斑塊形成明顯;各用藥組上述病理損傷均可見不同程度的減輕，其中ATS-H組病損明顯減輕，泡沫細胞數量明顯減少，斑塊明顯消退，優于模型組及其他用藥組(Fig 1)。

2.2 各組小鼠血脂水平比較 與CON比較，AS組血清TC、TG、LDL均明顯升高(P＜0.01)，HDL明顯降低(P＜0.01);與AS組比較，除ASP組外，其余各用藥組TC、TG、LDL均明顯降低(P＜0.01)，HDL-C均明顯升高(P＜0.01)，其中TXL降低TC、TG、LDL，升高HDL水平與ATO、A+A作用相當(P＞0.05)，ATS-L、ATS-H 組在降低TC、TG、LDL，升高HDL方面能力明顯優于單用ATO、TXL及A+A組(P ＜0.05，P ＜0.01)，而 AST-H 在降低 TC、LDL，升高HDL方面優于ATS-L組(P＜0.05)(Tab 1)。

2.3 各組小鼠血清hs-CRP水平比較 與CON組比較，AS組血清hs-CRP水平明顯升高(P＜0.01);與AS組比較，各用藥組均能不同程度的降低hs-CRP水平(P＜0.05或 P＜0.01)，其中 ATO、ASP、TXL 3組間hs-CRP水平無明顯差異(P＞0.05)，A+A及 ATS-L組 hs-CRP水平均明顯低于 ATO、ASP、TXL 3組 (P＜0.05)，但均高于ATS-H組(P＜0.05)，見 Fig 2。

2.4 各組小鼠主動脈組織 ICAM-1、VCAM-1、MCP-1蛋白表達比較 與CON組比較，AS組小鼠主動脈ICAM-l、VCAM-l、MCP-1蛋白表達明顯上調(P＜0.01);與模型組比較，各用藥組上述指標的蛋白表達均有不同程度的下調(P＜0.05或 P＜0.01)，其中ATO、ASP、TXL組上述蛋白表達無明顯差異(P＞0.05)，A+A及ATS-L組上述蛋白表達均明顯低于ATO、ASP、TXL3組(P＜0.05或P＜0.01)，但均高于ATS-H組(P＜0.05)，見Tab 3，Fig 2。

Fig 1 HE staining of aorta in mice of different groups(×100)

Tab 1Changes of lipids of mice in different groups(±s，n=20，mmol·L－1)

Tab 1Changes of lipids of mice in different groups(±s，n=20，mmol·L－1)

＊＊P＜0.01 vs CON;##P ＜0.01 vs model;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs ATO;◆◆P ＜0.01 vs ASP;○P ＜0.05，○○P ＜0.01 vs TXL;●P ＜0.05，●●P ＜0.01 vs A+A;＆P ＜0.05 vs ATS-L group

Group TC TG LDL HDL CON 3.42 ±0.38 0.94 ±0.19 0.35 ±0.09 5.29 ±0.88 Model 22.76 ±1.98＊＊ 2.78 ±1.05＊＊ 8.60 ±1.37＊＊ 2.74 ±0.85＊＊ATO 19.59 ±1.81##◆◆ 2.07 ±0.63##◆◆ 6.48 ±0.93##◆◆ 3.34 ±0.64##◆◆ASP 22.30 ±1.63 2.73 ±0.66 8.44 ±1.40 2.70 ±0.99 TXL 19.82 ±1.71##◆◆ 2.09 ±0.47##◆◆ 6.52 ±0.94##◆◆ 3.50 ±0.80##◆◆A+A 19.48 ±1.77##◆◆ 2.03 ±0.59##◆◆ 6.51 ±0.86##◆◆ 3.55 ±0.68##◆◆ATS-L 18.37 ±1.76##△◆◆○● 1.64 ±0.36##△◆◆○● 5.79 ±0.96##△◆◆○● 4.19 ±0.82##△△◆◆○●ATS-H 16.63 ±2.02##△△◆◆○○●● 1.36 ±0.21##△△◆◆○○●● 4.96 ±1.03##△△◆◆○○●●＆ 4.74 ±0.85##△△◆◆○○●●＆

Fig 2 Western blot strips electropherogram of ICAM-1，VCAM-1，MCP-1 in aorta of different groups

Tab 2 Changes of hs-CRP of mice in different groups(±s)

Tab 2 Changes of hs-CRP of mice in different groups(±s)

＊＊P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs ATO;◆ P ＜0.05，◆◆ P ＜0.01 vs ASP;○P ＜0.05，○○P ＜0.01 vs TXL;●P ＜0.05 vs A+A;＆P ＜0.05 vs ATS-L

Group n hs-CRP/mg·L －1 CON 8 7.47 ±2.34 AS 8 11.89 ±1.70＊＊ATO 8 10.37 ±0.53##ASP 8 10.48 ±0.40#TXL 9 10.34 ±0.41##A+A 10 9.25 ±0.34##△◆○ATS-L 8 9.26 ±0.39##△◆○ATS-H 8 8.09 ±0.81##△△◆◆○○●＆

Tab 3 ICAM-1，VCAM-1，MCP-1 protein expressions in aorta of different groups(±s，n=6)

Tab 3 ICAM-1，VCAM-1，MCP-1 protein expressions in aorta of different groups(±s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs ATO;◆P＜0.05，◆◆P＜0.01 vs ASP;○P＜0.05，○○P＜0.01 vs TXL;●P＜0.05 vs A+A;＆P ＜0.05 vs ATS-L

Group ICAM-1/β-actin VCAM-1/β-actin MCP-1/β-actin CON 0.623 ±0.064 0.618±0.057 0.698±0.049 AS 0.969±0.052＊＊ 0.979±0.051＊＊ 0.963±0.041＊＊ATO 0.869 ±0.062## 0.876±0.062# 0.900±0.048#ASP 0.873 ±0.064# 0.882±0.053# 0.906±0.048#TXL 0.862 ±0.078## 0.865±0.064# 0.892±0.045##A+A 0.770±0.058##△△◆◆○○ 0.771±0.062##△◆◆○ 0.822±0.038##△◆○ATS-L 0.764±0.065##△△◆◆○○ 0.761±0.081##△△◆◆○○ 0.817±0.051##△△◆◆○○ATS-H 0.666±0.092##△△◆◆○○●＆ 0.665±0.083##△△◆◆○○●＆ 0.747±0.055##△△◆◆○○●＆

3 討論

ApoE-/－小鼠由于缺乏載脂蛋白E使低密度脂蛋白代謝障礙，易于沉積管壁，因而可自發形成AS病灶，其AS病理形態較其他動物模型更接近于人類［10］，目前已成為國內外研究AS發病機制和干預措施較理想的動物模型。本研究采用高脂誘導ApoE－/－小鼠建立AS模型，結果顯示經高脂喂飼12周后，模型組血清TC、TG、LDL水平均明顯升高，HDL水平明顯降低，HE染色顯示主動脈內皮剝脫、內皮下有大量泡沫細胞聚集、斑塊形成明顯;本研究結果顯示通心絡可明顯降低血清 TC、TG、LDL水平，升高HDL水平;與阿托伐他汀、阿司匹林聯用不僅可增強調脂療效，明顯降低AS致病因素;同時還可有效改善AS病理損傷，延緩AS斑塊的形成，起到綜合調治效應。

AS是內皮損傷后的炎癥反應及在此基礎上的損傷 － 修復過程已得到證實［11］。研究表明［12］，C反應蛋白(CRP)是AS炎癥反應中的敏感性標志物，不僅在預測心血管事件的發生和預后方面價值較高，同時也是 AS的致病因素，誘導內皮細胞VCAM-1、ICAM-1等黏附分子表達及 MCP-1的分泌［13］。MCP-1對單核細胞有趨化和激活作用，介導單核細胞向內皮下遷移［14］，VCAM-1、ICAM-1則可觸發內皮細胞與多種白細胞、單核細胞的黏附，從而啟動或加速AS的發展［15］。本實驗中模型組小鼠血清hs-CRP水平明顯升高，同時主動脈ICAM-1、VCAM-1、MCP-l蛋白表達明顯上調，提示hs-CRP啟動VCAM-1、ICAM-1及MCP-l蛋白表達在主動脈粥樣硬化過程中發揮了重要作用;本研究結果顯示通心絡、阿托伐他汀及阿司匹林干預后均能不同程度地降低血清 hs-CRP水平，下調 ICAM-1、VCAM-1、MCP-l的表達，減輕AS炎性反應，這與文獻報道基本一致［16－18］。而且與阿托伐他汀、阿司匹林聯用可以相互協同，增強抗炎療效，作用明顯優于3藥單用以及兩西藥聯用，更加佐證了ATS方案的綜合調治效應，可作為治療AS的優選藥對方案。

綜上所述，通心絡作為中醫藥復方，局部與整體結合，對血液及血管病變具有系統保護作用，與他汀類、阿司匹林聯用，既可清除血液“垃圾”，防治血管局部病理損傷，又具有相互協同，增強療效之優勢，可以有效預防AS患者發生心梗、腦梗等心血管事件，達到心腦血管疾病的1、2、3級預防作用。

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