不同劑量N-亞硝基雙-2-氧丙基誘導倉鼠胰腺癌的成模效果及對相關基因表達的影響

曹維 周國雄 張海峰 丁曉凌 潘嶸嶸 瞿利帥 張弘 徐正府

自1974年Pour等采用N-亞硝基雙-2-氧丙基(N-nitrosobis-2-oxopropylamin, BOP)成功誘導黃金倉鼠胰腺癌模型以來，各國學者已構建了多種胰腺癌動物模型，它們有其各自的優劣性，在臨床科研應用中有不同用途[1-4]。由于倉鼠胰腺癌發病機制中K-ras基因點突變和5′CpG異常甲基化引起的p16滅活與人胰腺癌的發病機制相似，因此采用BOP制備的倉鼠胰腺癌模型是一個理想的動物模型。但研究發現，BOP誘導倉鼠腫瘤模型因誘導劑量和時間的差異而出現不同的結果[5]。為此，本研究采用不同時間、不同劑量BOP誘導倉鼠，觀察其造模效果及對相關基因GAL-1、GAL-3、COX-2、5-LOX、MHC表達的影響。

材料與方法

一、實驗動物和材料

敘利亞黃金倉鼠，6～8周齡，雌性，體質量80 g左右，由南通大學實驗動物中心提供。人胰腺癌細胞株PANC1購自中國科學院上海生命科學研究院。BOP購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，Trazol購自invitrogen公司，實時PCR試劑盒購自fermentas公司，抗COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗體均購自美國Santa Cruz公司。

二、倉鼠胰腺癌模型的構建

取72只倉鼠，按完全隨機法分為A、B、C 組，每組24只。A組采用小劑量、長周期BOP造模，即皮下注射BOP 10 mg/kg體質量，每周1次，連續8周，36周成模后處死；B組采用大劑量、短周期BOP造模，即首次皮下注射BOP 70 mg/kg體質量，1周后皮下注射BOP 20 mg/kg體質量,每周1次，連續3周，20周成模后處死；C組為未注射BOP的對照組，飼養36周處死。取胰腺組織及肝臟組織行病理組織學檢查。

三、COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ mRNA表達檢測

采用實時PCR方法檢測mRNA的表達。根據GeneBank數據庫各基因全長cDNA序列，采用Primer 5.0軟件設計引物，再經過Blast進行同源性檢索后，由上海invitrogen公司合成引物，以β-actin為內參。引物序列見表1。取新鮮胰腺癌組織，應用Trazol提取總RNA。先逆轉錄成cDNA,再行PCR擴增。實時PCR反應條件：95℃ 3 min，95℃ 40 s、54℃ 40 s、72℃ 40 s，40個循環。由儀器自帶軟件獲取Ct值，通過公式2-ΔΔCt計算mRNA表達量，以對照組的mRNA表達量為1計算表達的倍數。

表1 COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHCⅠ、MHCⅡ以及β-actin的引物序列

四、5-LOX、COX-2、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表達的檢測

采用蛋白質印跡法檢測蛋白表達量。取新鮮胰腺癌組織制備組織勻漿，蛋白定量后取50 μg蛋白常規行蛋白質印跡法，以β-actin為內參。最后ECL發光，X片曝光、顯影。采用美國Biorad公司Quantity One 4.0圖像分析軟件進行掃描分析，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

另外，采用免疫組織熒光法檢測5-LOX、COX-2、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白的表達。新鮮胰腺癌組織行冷凍切片，4℃丙酮固定10 min，PBS洗滌后用3%過氧化氫孵育5～10 min，PBS再次洗滌后用5%～10%正常山羊血清室溫封閉10 min，傾去血清，滴加適當比例稀釋的一抗，37℃孵育1～2 h或4℃過夜,PBS沖洗后滴加適當比例稀釋的TRITC標記二抗37℃孵育10～30 min，熒光顯微鏡下觀察。

五、統計學處理

結 果

一、倉鼠造模效果

A組24只倉鼠中19只肉眼發現胰腺頭部有暗紅色硬結節樣瘤體形成，質地堅硬，部分表面凹凸不平，可見營養血管。光鏡下見胰腺癌細胞呈實性團塊或巢狀、條索狀排列，間隔以少量間質，可見腫瘤血管；細胞明顯異型，核大深染，核分裂象多見，可見明顯核仁，部分可見變性壞死現象(圖1)。誘導胰腺癌的成功率達79.2%。其他臟器未見異常。

圖1 對照組(a)、A組(b)倉鼠胰腺組織病理改變 (HE ×400)

B組24只倉鼠胰腺均未見異常，但18只倉鼠見肝臟表面有大小不等，高低不平的灰色結節，色澤灰暗，質地堅韌。光鏡下見肝內膽管癌細胞呈實性團塊或巢狀、條索狀排列，間隔以少量間質，可見腫瘤血管；細胞明顯異型，核大深染，核分裂象多見，可見明顯核仁，部分可見變性壞死現象(圖2)。誘導肝內膽管癌的成功率達75.0%。其他臟器未見異常。

圖2 對照組(a)、B組(b)倉鼠肝組織病理改變 (HE ×400)

二、倉鼠胰腺癌組織中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的mRNA表達

A組倉鼠胰腺組織COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ mRNA的表達量分別為8.78±0.25、8.51±0.20、25.28±0.61、13.10±0.68、12.40±0.46和5.08±0.20，對照組胰腺組織分別為17.45±0.81、16.74±0.26、39.73±0.51、76.53±0.97、43.88±0.31和4.50±0.46，A組的表達量分別是對照組的1.93、2.03、1.57、5.55、3.54和0.92倍，除MHC-ⅡmRNA外，其余5個基因的mRNA表達量與對照組的差異均具有統計學意義(t值分別為9.53、27.31、19.30、23.64、25.66，P值均<0.05)。

三、倉鼠胰腺癌組織中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白的表達

A組倉鼠胰腺癌組織COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白的表達量分別為2.47±0.22、0.56±0.05、1.23±0.05、1.55±0.13、2.02±0.01和0.19±0.01，對照組倉鼠正常胰腺組織的表達量分別為0.80±0.08、0.39±0.01、0.60±0.01、0.53±0.03、0.40±0.02和0.20±0.01，胰腺癌組織COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ蛋白的表達較正常胰腺組織顯著增強(圖3)，差異有統計學意義(t值分別為 19.44、4.85、16.53、12.13、39.68，P值均<0.05)。胰腺癌組織MHC-Ⅱ蛋白表達與正常胰腺組織的表達差異無統計學意義。免疫組織熒光測定的結果與蛋白質印跡法的結果一致(圖4)。

圖3 對照組、A組倉鼠胰腺組織的蛋白表達

討 論

亞硝基復合物是對嚙齒類動物最有效的致癌劑，誘導胰腺癌的成功率高，為研究胰腺癌的發生發展過程，評估藥物及其他治療對胰腺癌的預防及療效提供了理想的模型。但缺點是造模周期長，且亞硝基復合物缺乏對胰腺的特異性，在誘導胰腺癌的同時容易造成其他臟器的腫瘤。

有關BOP誘導造模的實驗方法大致可分為小劑量長周期倉鼠皮下注射以及大劑量短周期倉鼠皮下注射兩種。吳澤珊等[5]報道，BOP小劑量長周期皮下注射能成功誘導倉鼠胰腺癌模型，且成功率較高，但BOP大劑量短周期皮下注射未能誘導胰腺癌，卻誘導出肝內膽管癌。本研究采用上述兩種方法造模，結果同文獻報道一致。倉鼠皮下注射BOP能誘導出不同的腫瘤模型，其具體機制有待進一步研究。

近年來的文獻報道，GAL-1和GAL-3在多種腫瘤細胞中過表達，如肝癌、胃癌、甲狀腺癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌，胰腺癌等，其在腫瘤的發生和發展過程中所起的作用正日益受到關注[6-10]。本課題組前期實驗[11]結果顯示，胰腺癌細胞株SW1990、PANC1和AsPC-1均有GAL-1、GAL-3 mRNA和蛋白的表達。胰腺癌組織亦均有GAL-1、GAL-3基因的表達，且GAL-1在胰腺癌組織中的表達和胰腺癌的分化程度相關，在胰腺癌的侵襲轉移中起重要作用[11]。而正常胰腺組織無GAL-1、GAL-3基因的表達。本研究結果顯示，倉鼠胰腺癌組織的GAL-1、GAL-3 mRNA和蛋白表達增強。因此，倉鼠胰腺癌模型的建立為今后研究GAL-1和GAL-3在人胰腺癌發生、發展過程中的作用機制提供了實驗基礎。

圖4 對照組(左)和胰腺癌組(右)胰腺組織COX-2(a)、5-LOX(b)、GAL-1(c)、GAL-3(d)、MHC-Ⅰ(e)、MHC-Ⅱ(f)的表達(免疫熒光 ×400)

近年來大量研究證實，脂氧合酶和環氧合酶中的5-LOX和COX-2除了在炎癥中發揮重要作用外，還參與腫瘤的發生、發展和轉移，因此，5-LOX和COX-2在腫瘤的發生、發展過程中所起的作用正日益受到關注[12-15]。研究表明,5-LOX在多種胰腺癌細胞株中均有表達，而在正常人胰腺細胞中無表達，抑制5-LOX的表達可能有助于胰腺癌的治療[16-17]。本研究結果顯示，倉鼠胰腺癌組織COX-2、5-LOX的表達增強，提示倉鼠胰腺癌的發生發展與花生四烯酸的代謝也有著密切關系。因此構建倉鼠胰腺癌模型對進一步研究通過抑制兩條代謝途徑靶向治療胰腺癌提供了很好的動物實驗基礎。

本研究前期結果顯示，胰腺癌細胞株PANC1低表達MHC-Ⅱ類分子以及共刺激分子是免疫逃逸的重要機制之一。CIITA因子表達陰性是胰腺癌細胞株PANC1不能表達MHC-Ⅱ類分子基因的關鍵原因。采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑和甲基化轉移酶抑制劑表觀遺傳處理后，CIITA基因Ⅳ型啟動子區CpG位點甲基化程度降低，CIITA蛋白重新表達，上調MHC-Ⅰ類、Ⅱ類分子和免疫共刺激因子CD40、CD80的表達。本研究結果顯示，倉鼠胰腺癌組織MHC-Ⅰ表達增強，而MHC-Ⅱ表達無明顯變化，提示倉鼠胰腺癌與人胰腺癌類似，同樣存在免疫逃逸現象，對研究其抗胰腺癌的免疫治療有較好的臨床應用價值。

參 考 文 獻

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