參麥注射液對急性胰腺炎大鼠的治療作用及其機制研究

岑峰 嚴強 張國雷 倪俊 袁文斌 魏云海

急性胰腺炎(AP)早期存在微循環障礙，這些微循環的變化與胰腺病變的嚴重程度及血液中胰酶升高的水平呈正相關[1-2]。參麥注射液具有抑制內皮素-1的表達與釋放、抑制血小板聚集、抑制血栓素合成、促進前列環素產生等作用，因此具有改善局部微循環，增加血管通透性及抗氧化等藥理作用。本研究應用參麥注射液治療急性水腫性胰腺炎(acute edematous pancreatitis, AEP)大鼠，觀察AEP大鼠微循環及炎癥反應的變化，探討其相關機制，為臨床應用參麥注射液提供實驗依據。

材料與方法

一、實驗動物及分組

健康成年雄性SD大鼠(由浙江省醫學科學院提供)60只，日齡80～90 d，體質量(200±50)g。按完全隨機法分為參麥治療組(參麥組)和AEP組，每組30只。實驗前禁食12 h，自由飲水，稱重后采用雨蛙素50 μg·kg-1·h-1連續7次腹腔內注射、每次間隔1 h的方法建立大鼠AEP模型。造模后1 h給予5%水合氯醛0.35 g/kg體質量腹腔注射誘導麻醉，繼以0.1 g·kg-1·h-1維持麻醉。參麥組從尾靜脈內緩慢滴注參麥注射液(5 ml·kg-1·d-1)進行治療；AEP組給予等容積生理鹽水緩慢滴注。造模前1 d和造模后1 h及1、3、5、7 d眼內眥交替采血，每次2 ml。7 d時處死兩組大鼠各15只，14 d處死剩余大鼠，留取胰腺組織樣本備用。另選取正常大鼠3只，留取胰腺組織備用。

二、方法

1．血清淀粉酶、血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)測定：采用ELISA法檢測血清淀粉酶、PAF、VEGF的含量，試劑盒購自上海勁馬生物科技有限公司，按說明書操作。

2．胰腺組織NF-κB mRNA及蛋白表達檢測：應用總RNA快速提取試劑盒(Generay公司)抽提胰腺組織總RNA。采用實時RT-PCR方法檢測NF-κB mRNA表達量。NF-κB引物正義序列為ACGGGGAAGGTCTGAATGC，反義序列為GGTGTCGTCCCATCGTAGGT，產物223 bp；內參GAPDH正義序列為AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，反義序列為AGGGGCCATCCACAGTCTTC，產物258 bp。引物的設計和合成由上海英駿生物有限公司完成。逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司；qPCR試劑IQ SYBR Green Supermix購自Bio-Rad公司。mRNA相對表達量采用2-△△Ct公式計算。

取新鮮胰腺組織，裂解制備組織勻漿，離心取上清。蛋白定量后行常規蛋白質印跡法檢測NF-κB蛋白表達量，以β-actin為內參。兔抗鼠NF-κB、β-actin一抗， 山羊抗兔IgG二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。以目的條帶與內參條帶的灰度比值表示目的蛋白的相對表達量。

3．胰腺組織微血管密度(micro vessel density, MVD) 計數：胰腺組織固定后，常規石蠟包埋、切片，采用SP法檢測CD31的陽性表達。參照Weidner等[3]方法量化計算MVD。每張切片先在低倍鏡下尋找血管高密度集中的區域，然后在高倍鏡(×250)下選取5個視野計數MVD。任何一個與周圍其他組織有明顯界限、胞質呈棕染的單個內皮細胞或內皮細胞簇，無論有無管腔、無論管腔內有無紅細胞均定義為一個微血管；凡管腔直徑>8個紅細胞或管壁有明顯肌層及纖維硬化、炎癥及壞死的微血管均不計入總數。取5個視野的平均值作為該標本的MVD。

三、統計學處理

結 果

一、兩組大鼠死亡率

大鼠造模后7 d內均無死亡，7～14 dAEP組死亡4只，參麥組死亡3只，死亡率分別為13.3%和10.0%，兩組差異無統計學意義(χ2=0.000，P>0.05)。

二、血清淀粉酶、PAF、VEGF含量的變化

兩組大鼠造模后1 h血清淀粉酶活性及PAF、VEGF含量即升高，較術前的差異均有統計學意義(t值分別為178.258、158.258、11.258，P值均<0.01)。造模后3、5、7 d參麥組血淀粉酶活性及PAF含量逐漸下降，且較AEP組下降顯著，兩組的差異均有統計學意義(t值分別為37.195、9.916、8.276、4.106、7.570、10.780，P<0.05或<0.01)；血清VEGF含量逐漸升高，且較AEP組升高顯著，兩組的差異均有統計學意義(t值分別為2.356、3.357、11.241，P<0.05或<0.01，表1)。

表1 參麥組和AEP組大鼠制模前后血清淀粉酶、PAF、VEGF含量的變化

三、兩組大鼠胰腺組織NF-κB表達量的變化

正常胰腺組織NF-κB mRNA表達量為0.169±0.012。造模后7、14 d AEP組胰腺組織NF-κB mRNA表達量分別為1.000±0.059、0.762±0.047，參麥組為0.834±0.031、0.438±0.024；AEP組NF-κB蛋白表達量分別為0.93±0.45、0.44±0.20，參麥組為0.49±0.24、0.21±0.11(圖1)。參麥組的表達均較AEP組顯著降低，差異具有統計學意義(t值分別為9.646、21.097、3.341、3.458，P值均<0.05)。

圖1 參麥組和AEP組大鼠胰腺組織NF-κB蛋白的表達

四、兩組大鼠胰腺組織的MVD

CD31陽性表達定位于胰腺組織血管內皮細胞胞質，呈棕黃色(圖2)。術后7、14 d參麥組大鼠胰腺組織的MVD分別為6.41±1.14、9.03±2.55，AEP組分別為3.62±0.89、3.22±1.92，參麥組顯著高于AEP組，差異具有統計學意義(t值分別為7.471、6.127，P值均<0.01)。

討 論

大量研究表明，AP發病機制與胰酶自身消化、微循環障礙、胰管屏障的破壞、氧自由基、炎癥遞質及多種細胞因子的作用相關，而胰腺炎從局部病變迅速發展為全身炎癥反應綜合征和多器官衰竭可能與細胞因子網絡和免疫功能紊亂相關[4]。隨著對AP微循環障礙認識的深入，通過改善微循環可以減輕胰腺細胞的損傷和壞死，進一步減輕胰腺炎時全身多臟器微循環障礙，同時阻止多器官功能衰竭綜合征的發生和發展[5]。

圖2 AEP組7、14 d(a、b)及參麥組7、14 d(c、d)大鼠胰腺組織CD31的表達(免疫組化染色 ×250)

PAF是一種強效生物活性磷脂，具有促進血管通透性增加、血小板活化、氧自由基大量釋放等作用，從而導致血栓形成，微循環障礙，加重組織損傷。大量實驗研究證實，PAF在AP的發病過程中起著重要作用，PAF的表達量與AP病情嚴重程度呈正相關[6-7]。VEGF是血管新生中最重要的刺激因子，能特異性地促進血管生成。

NF-κB在調節機體免疫炎癥反應中起重要作用。NF-κB的過度活化會激活、增強機體的非特異及特異性免疫反應，造成組織損傷和器官功能紊亂。Telek等[8]認為，AP早期腺泡細胞氧自由基大量形成并造成細胞損傷與NF-κB的激活密切相關。Kim等[9]應用抗氧化劑治療AP后能夠抑制腺泡細胞NF-κB的活性，減少炎性細胞因子的產生，減輕腺泡細胞損傷，表明活性氧在介導刺激物激活NF-κB的過程中起重要作用，抗氧化劑可作為NF-κB抑制劑。參麥注射液是由人參與麥冬精制而成的純中藥制劑，其有效成分為人參皂苷和人參多糖。參麥注射液可增強內皮細胞釋放血管舒張因子以擴張血管、增加血流，并促進血管生成以改善微循環，還可減少炎癥遞質的釋放，抑制炎癥因子活性，減輕炎癥反應，此外，還具有抗氧化功效，因此，本研究采用參麥注射液治療AEP大鼠，探討其治療AP的作用機制。

本研究結果顯示，AEP造模后大鼠血清PAF、VEGF含量升高，胰腺組織NF-κB基因表達及MVD增加。參麥注射液治療后大鼠血清PAF含量、胰腺組織NF-κB mRNA和蛋白表達量及MVD均較AEP組顯著下降，而VEGF含量較AEP組顯著升高，表明參麥注射液治療AEP大鼠具有改善組織微循環，促進血管新生，緩解急性炎癥反應，促進胰腺炎病程恢復的作用。

參 考 文 獻

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[9] Kim H, Seo JY, Roh KH, et al. Suppression of NF-kappa B activation and cytokine production by N-acetylcysteine in pancreatic acinar cells[J]. Free Radic Biol Med, 2000, 29(7): 674-683.