硼替佐米對胰腺癌細胞BxPC3、SW1990生長抑制作用的體外研究

黎美琳 周春華 王少峰

蛋白酶體抑制劑硼替佐米(萬珂，velcade)是一種新型抗腫瘤制劑，由于其對血源性惡性腫瘤的突出效應，已被美國食品藥品管理局(FDA)批準用于反復性或頑固性的多發性骨髓瘤治療[1]。近年來的研究發現，硼替佐米對大部分腫瘤具有抗癌活性，包括小細胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌等。硼替佐米與化療藥物聯用治療實體腫瘤的Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗也取得初步進展[2]。體內和體外實驗研究結果均顯示硼替佐米單藥或聯合其他化療藥物可殺傷胰腺癌細胞，抑制腫瘤的生長[3-4]，但不同癌細胞對硼替佐米的敏感性差異甚大[5]，且與治療敏感性相關的分子機制研究鮮有報道。本研究應用硼替佐米干預胰腺癌細胞BxPC3、SW1990，觀察其對癌細胞增殖、凋亡的影響，探討硼替佐米殺傷癌細胞及其敏感性的可能機制。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌細胞株BxPC3、SW1990購自上海生命科學院細胞庫；硼替佐米由西安楊森公司提供；四甲基偶氮唑鹽(MTT)為Sigma公司產品；Trizol RNA提取試劑、凋亡檢測試劑盒購自Introvinent公司；cDNA逆轉錄試劑盒為Fermentas公司產品，SYBR Green Mix for Q-PCR 為ABI公司產品；兔抗人survivin、caspase、cleaved-caspase、Bcl-2的IgG及鼠抗人GAPDH IgG，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔及羊抗鼠IgG均購自Cell Singaling Technology公司。

二、方法

1．細胞增殖檢測：采用MTT法檢測細胞增殖。取對數生長期細胞，胰酶消化后制備成單個細胞懸液，調整細胞密度至5×104/ml，取100 μl接種于96孔板培養過夜，分別加入1、10、50、100、500 nmol/L及1、10 μmol/L的硼替佐米，以不加硼替佐米為對照組，不加細胞為空白組，分別孵育24、48、72 h，加入10 μl MTT(5 mg/L)避光孵育4 h，棄上清，每孔加150 μl DMSO，振蕩搖勻，置酶標儀測各孔490 nm的吸光度值(A490值)。每組設3個平行孔。細胞存活率(%)=(實驗組A490值-空白組A490值/對照組A490值-空白組A490值)×100%。

2．細胞凋亡檢測：采用Annexin V/PI雙染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡。細胞以5×105個/孔的密度接種于6孔板，孵育過夜，分別加入10、50、100 nmol/L的硼替佐米孵育48 h，以不加硼替佐米為對照組。孵育后收集細胞，PBS洗滌2次，用1× binding buffer 1 ml重懸細胞，取100 μl細胞懸液加入5 μl Annexin V-FLTC和1 μl PI(100 μg/ml)，室溫避光放置15 min，再加入400 μl 1× binding buffer，混勻后上流式細胞儀檢測。

3．凋亡相關基因Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、survivin mRNA表達檢測：采用RT-PCR法檢測mRNA的表達。取10、100 nmol/L硼替佐米干預48 h的細胞及未經硼替佐米干預的對照組細胞，用Trizol提取細胞總RNA。引物序列：Bax上游5′-GGGGACGAACTGGACAGTAA-3′，下游5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′，產物122 bp；Bak上游5′-GCTATGACTCAGAGTTCCAGACCA-3′，下游5′-CAATTGATGCCACTCTCAAACAG-3′，產物111 bp；Bcl-2上游5′-TTTGAGTTCGGTGGGGTCAT -3′，下游5′-TTCAGAGACAGCCAGGAGAAAT-3′，產物203 bp；Bcl-xl上游5′-GTAAACTGGGGTCGCATTGT-3′，下游5′-TGCTGCATTGTTCCCATAGA-3′，產物197 bp；survivin上游5′-AGGACCACCGCATCTCTACAT-3′，下游5′-AAGTCTGGCTCGTTCTCAGTG-3′，產物118 bp；內參GAPDH上游5′-GTGGTCTCCTCTGACTTCAAC-3′，下游5′-TCTCTTCCTCTTGTGCTCTTG-3′，產物212 bp。引物序列由上海生工生物技術有限公司設計合成。先按照Fermentas試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，然后行PCR擴增。PCR條件：95℃ 5 min，50℃(Bax)或52℃(Bcl-xl)或55℃(Bak、Survivin、GAPDH)或56℃(Bcl-2) 30 s、72℃ 60 s，30個循環，最后72℃延伸10 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，圖像分析儀掃描，以目的條帶與內參條帶灰度值比表示mRNA的相對表達量。

4．Pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、surviving蛋白表達檢測：收集上述各組細胞，裂解后離心，取上清，蛋白定量。取50 μl常規行蛋白質印跡法檢測pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、surviving蛋白的表達，以GAPDH為內參，最后ECL發光，壓片，曝光，圖像分析儀掃描。以目的條帶與內參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。

三、統計學處理

結 果

一、BxPC3、SW1990細胞增殖的變化

大于50 nmol/L的硼替佐米呈濃度及時間依賴性抑制胰腺癌BxPC3、SW1990細胞的增殖，其中硼替佐米對BxPC3細胞的生長抑制作用顯著大于對SW1990細胞的作用，兩者差異有統計學意義(P值均<0.05，表1)。

二、BxPC3、SW1990細胞凋亡的變化

對照組及10、50、100 nmol/L硼替佐米干預48 h的BxPC3細胞凋亡率分別為(2.15±0.47)%、(2.36±1.15)%、(10.52±1.05)%、(22.56±4.23)%；SW1990細胞凋亡率分別為(2.32±0.54)%、(2.27±1.37)%、(6.23±0.34)%、(12.71±2.23)%(圖1)。

表1 硼替佐米干預BxPC3、SW1990細胞后的細胞存活率

橫坐標為Annexin V-FLTC熒光強度；縱坐標為PI熒光強度

50、100 nmol/L硼替佐米組凋亡率均顯著高于對照組(t值分別為-12.595、-7.942和-10.535、-7.857，P值均<0.05)，且BxPC3細胞的凋亡率顯著高于SW1990細胞(t值分別為6.715、3.443,P值均<0.05)。

三、BxPC3、SW1990細胞凋亡相關基因mRNA表達水平的變化

10、100 nmol/L硼替佐米處理48 h后，兩種胰腺癌細胞Bak mRNA的表達量無顯著變化；Bax mRNA的表達量較相應對照組均顯著升高(F值分別為207.802、61.532，P值均<0.05)；Bcl-2、Bcl-xl mRNA的表達量均較相應對照組顯著下降(F值分別為194.249、116.067和48.931、145.512，P值均<0.05)；survivin在BxPC-3細胞中表達下調(F=76.877，P<0.05)，在SW1990細胞中表達上調(F=103.244，P<0.05，圖2、表2)。

四、BxPC3、SW1990細胞凋亡相關基因蛋白表達水平的變化

10、100 nmol/L硼替佐米干預后，BxPC3、SW1990細胞pro-caspase-3表達減弱(F值分別為257.098、384.099，P值均<0.05)，cleaved-caspase-3表達增強(F值分別為295.561、48.735,P值均<0.05)，Bax蛋白表達增強(F值分別為116.233、207.271，P值均<0.05)，Bcl-2蛋白表達減弱(F值分別為233.143、428.702，P值均<0.05)，組間差異均有統計學意義；survivin蛋白在BxPC3細胞表達明顯減弱(F=3512.366，P<0.05)，而在SW1990細胞中持續高表達(F=45.265，P<0.05，圖3、表2)。

圖2 0、10、100 nmol/L硼替佐米作用48 h后BxPC3和SW1990細胞相關基因mRNA表達

圖3 0、10、100 nmol/L硼替佐米作用48 h后BxPC3和SW1990細胞相關蛋白表達

表2 硼替佐米處理后兩種胰腺癌細胞凋亡相關基因mRNA和蛋白表達量

討 論

硼替佐米可誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長，其機制主要包括以下幾個方面[6-7]：(1)抑制NF-κB信號通路的激活；(2)增加細胞內抑癌基因p53、p21、p27的表達；(3)誘導線粒體內源性凋亡途徑；(4)激活死亡受體外源性凋亡信號；(5)內質網介導的凋亡信號激活。

Bcl-2蛋白家族可分為抗凋亡成員和促凋亡成員，后者僅BH3域具有同源序列。細胞在應激狀態下，同源BH3結構域的促凋亡蛋白作為感應元件，直接抑制抗凋亡蛋白和(或)激活Bax類促凋亡蛋白，增加線粒體膜通透性，釋放細胞色素C，激活caspase-3，誘導其聯級反應致細胞凋亡[8]。Bcl-2家族的抗凋亡蛋白持續高表達在惡性腫瘤發生、發展過程中起重要作用[9]。本研究結果顯示，硼替佐米抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，Bcl-2、Bcl-xl表達減弱，Bax表達增強，caspase-3裂解激活，提示硼替佐米干預細胞后可能通過抑制抗凋亡蛋白、增強促凋亡蛋白表達，誘導線粒體途徑凋亡的發生。本研究的兩株癌細胞Bak表達無顯著變化，可能與Bak主要表達于胰腺癌組織周圍慢性炎性區域，參與此部位細胞凋亡而非腫瘤細胞本身有關[10]。

Survivin是凋亡蛋白抑制因子家族成員之一，通過與caspase-3和caspas-7結合而抑制caspase聯級反應，從而抑制細胞凋亡的發生。survivin主要表達于胚胎和發育的胎兒組織，在分化成熟的正常成人組織中幾乎不表達。多項研究表明，survivin與腫瘤的發生、發展，放、化療的抵抗性以及預后不良有關。Vaziri等[11]研究表明，硼替佐米誘導的p53+/+表型的HCT116結腸癌細胞的凋亡增加與survivin表達下調相關。但Liu等[12]報道，硼替佐米誘導的非小細胞肺癌細胞株凋亡卻伴隨survivin表達升高。最新研究報道，硼替佐米殺傷結腸癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤等腫瘤細胞的敏感性與survivin表達呈負相關。抑制survivin表達可逆轉腫瘤細胞對硼替佐米的抵抗性[5]。本研究結果顯示，對硼替佐米敏感性高的BxPC3細胞的survivin表達明顯低于對硼替佐米敏感性低的SW1990細胞，提示survivin高表達可能在硼替佐米腫瘤抵抗中起作用。

參 考 文 獻

[1] Richardson PG, Barlogie B, Berenson J, et al. A phase 2 study of bortezomib in relapsed, refractory myeloma[J]. N Engl J Med, 2003,348(26): 2609-2617.

[2] Milano A, Perri F, Caponigro F. The ubiquitin-proteasome system as a molecular target in solid tumors: an update on bortezomib[J]. Onco Targets Ther, 2009,2:171-178.

[3] Shah SA, Potter MW, McDade TP, et al. 26S Proteasome inhibition induces apoptosis and limits growth of human pancreatic cancer[J]. J Cell Biochem,2001,82(1):110-122.

[4] Fahy BN, Schlieman MG, Virudachalam S, et al. Schedule-dependent molecular effects of the proteasome inhibitor bortezomib and gemcitabine in pancreatic cancer[J]. J Surg Res, 2003,113(1):88-95.

[5] Ling X, Calinski D, Chanan-Khan AA, et al. Cancer cell sensitivity to bortezomib is associated with survivin expression and p53 status but not cancer cell types[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2010,29:8.

[6] Rastogi N, Mishra DP. Therapeutic targeting of cancer cell cycle using proteasome inhibitors[J]. Cell Div, 2012,7(1):26.

[7] Fennell DA, Chacko A, Mutti L.BCL-2 family regulation by the 20S proteasome inhibitor bortezomib[J].Oncogene, 2008,27(9):1189-1197.

[8] Brunelle JK, Letai A. Control of mitochondrial apoptosis by the Bcl-2 family[J]. J Cell Sci, 2009,122(Pt 4): 437-441.

[9] Adams JM, Cory S. The Bcl-2 apoptosis switch in cancer development and therapy[J].Oncogene,2007,26(9):1324-1337.

[10] Graber HU, Friess H, Zimmermann A, et al. Bak expression and cell death occur in peritumorous tissue but not in pancreatic cancer cells[J]. J Gastrointest Surg,1999, 3(1): 74-80.

[11] Vaziri SA, Hill J, Chikamori K, et al. Sensitization of DNA damage-induced apoptosis by the proteasome inhibitor PS-341 is p53 dependent and involves target proteins 14-3-3 Sigma and survivin[J]. Mol Cancer Ther, 2005,4(12):1880-1890.

[12] Liu X, Yue P, Chen S,et al.The proteasome inhibitor PS-341 (bortezomib) up-regulates DR5 expression leading to induction of apoptosis and enhancement of TRAIL-Induced apoptosis despite up-regulation of c-FLIP and survivin expression in human NSCLC cells[J]. Cancer Res, 2007,67(10):4981-4988.