糖尿病大鼠的胰腺組織損傷及其氧化應(yīng)激的變化

安增梅 董興剛 過源 周佳亮 秦濤

糖尿病是一種常見病及多發(fā)病。糖尿病的主要并發(fā)癥之一是糖尿病腎病，也是糖尿病患者病死的主要原因[1]。糖尿病腎病的發(fā)病及其進(jìn)展與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[2]，但是與胰腺損傷的關(guān)系研究較少。因此，本研究檢測糖尿病大鼠胰腺的氧化應(yīng)激反應(yīng)，探討糖尿病大鼠胰腺的損傷機(jī)制。

一、材料與方法

1．動(dòng)物分組和模型制作：雄性SD清潔級(jí)健康大鼠20只，8周齡左右，體質(zhì)量(200±30)g，由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物學(xué)部提供。飼養(yǎng)環(huán)境為每籠5只，溫度(22±2)℃，相對濕度(55±2)%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將20只大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為糖尿病組和對照組，各10只。采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)一次性腹腔注射60 mg/kg體質(zhì)量的方法制備糖尿病模型。STZ購自美國Sigma公司，臨用前用新配制的0.1 mmol/L的枸櫞酸緩沖液(pH4.5)配成1%濃度的STZ溶液。對照組腹腔注射等容積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后，糖尿病組大鼠經(jīng)尾靜脈采血，用血糖儀及血糖試紙測定大鼠血糖，以其血糖≥16.7 mmol/L，大鼠出現(xiàn)明顯的多食、多飲、多尿癥狀確認(rèn)模型成功。在12周末用摘眼球取血采樣后斷頸椎方法處死大鼠，取部分胰腺、腎臟組織置10%甲醛液固定，部分胰腺組織經(jīng)液氮速凍后置-80℃冰箱保存。

2．尿蛋白、血糖、血胱抑素C(CytC)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平檢測：采用雙縮脲法測定24 h尿蛋白定量，采用羅式血糖測定儀測定血糖，免疫比濁法檢測血清CytC水平，采用淀粉酶測定試劑盒(速率法)測定淀粉酶活性，采用比色法檢測大鼠血清SOD水平，采用ELISA法檢測血清MDA水平。

3．胰腺及腎臟病理學(xué)檢查：取固定的胰腺和腎臟組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色、PAS染色、Masson染色，顯微鏡下觀察胰腺和腎臟的病理變化。

4．大鼠胰腺組織中硝基化酪氨酸(NT)蛋白檢測：采用免疫組化法檢測胰腺組織NT蛋白的表達(dá)。小鼠抗大鼠NT單抗試劑盒購自英國abcam公司，工作濃度1∶200，以PBS緩沖液替代一抗作陰性對照。

二、結(jié)果

1．一般情況：對照組大鼠在實(shí)驗(yàn)12周期間無明顯癥狀，精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，皮毛有光澤，體重正常增長，無死亡。糖尿病組1只大鼠制模未成功，未納入實(shí)驗(yàn)，1只于第42天死亡，8只實(shí)驗(yàn)持續(xù)12周。所有糖尿病組大鼠倦怠，豎毛，皮毛萎枯，反應(yīng)遲鈍，體形消瘦，均出現(xiàn)多食、多尿、多飲癥狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對照組大鼠的體質(zhì)量為(490±40)g，糖尿病組體質(zhì)量為(330±35)g，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2．大鼠血糖、血CytC水平、24 h尿蛋白排泄量及血淀粉酶活性的變化：對照組大鼠血糖、血CytC水平、24 h尿蛋白排泄量及血淀粉酶活性分別為(6.7±1.3)mmol/L、(3.94±0.35)mg/L、(3.9±2.3)mg/d、(2 124±235)U/L；糖尿病大鼠為(21.7±5.2)mmol/L、(5.23±0.54)mg/L、(29.2±13.4)mg/d、(2 129±209)U/L，糖尿病組的血糖、血CytC水平、24 h尿蛋白排泄量均較對照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)，兩組的血淀粉酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3．大鼠血SOD、MDA水平的變化：對照組大鼠血SOD、MDA水平分別為(155.3±61.9)U/L、(5.13±0.91)nmol/L；糖尿病大鼠為(98.6±29.8)U/L、(7.75±0.94)nmol/L，糖尿病組血SOD水平較對照組顯著降低，而MDA水平較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

4．大鼠胰腺及腎臟組織的病理變化：對照組大鼠胰腺腺泡和胰島正常；糖尿病組大鼠胰腺腺泡明顯減少，外分泌腺與胰島之間周界模糊，胰島體積縮小，外形不規(guī)則，胰島細(xì)胞胞質(zhì)減少，細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)間膠原物質(zhì)增多(圖1)。對照組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)無明顯變化；糖尿病大鼠近曲腎小管上皮細(xì)胞有空泡變性，腎小球結(jié)構(gòu)模糊(圖2)。

5．大鼠胰腺組織NT的表達(dá)：胰腺NT的表達(dá)定位于胰腺腺泡腔和胰島細(xì)胞的胞質(zhì)。對照組大鼠胰腺有較弱的NT表達(dá)；糖尿病組大鼠的胰腺腺泡腔和胰島細(xì)胞的胞質(zhì)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，并伴有細(xì)胞的變性(圖3)。

討論STZ介導(dǎo)的糖尿病大鼠模型是一個(gè)病理、生理改變都接近于人類糖尿病的動(dòng)物模型[3-4]。因?yàn)镾TZ對大鼠的胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用，能誘發(fā)產(chǎn)生糖尿病，有報(bào)道選用雄性大鼠制作模型的成模率明顯高于雌性大鼠，因此本研究全部采用雄性大鼠。

圖1 對照組(左)、糖尿病組(右)大鼠胰腺組織的病理改變[PAS染色(上)，Masson染色(下) ×400]

圖2 對照組(左)、糖尿病組(右)大鼠腎臟組織的病理改變(HE ×400)

圖3 對照組(左)、糖尿病組(右)大鼠胰腺NT的表達(dá)(免疫組化 ×400)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠血清抗氧化標(biāo)志物SOD的水平顯著降低，而氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA含量顯著升高，表明糖尿病存在氧化應(yīng)激反應(yīng)異常，與文獻(xiàn)[5]的研究基本一致。

已有研究證實(shí)[5-7]，在糖尿病的發(fā)病過程中，人體在高血糖和高脂肪酸的刺激下產(chǎn)生大量氧自由基，氧自由基引起氧化應(yīng)激，是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能損傷的主要原因。高濃度葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使活性氧簇產(chǎn)生增多，促發(fā)氧化應(yīng)激，啟動(dòng)核轉(zhuǎn)錄因子-кB途徑，增加誘生型一氧化氮合酶的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，使一氧化氮生成增加，過量的一氧化氮可與超氧陰離子迅速結(jié)合生成氧化作用更強(qiáng)的過氧亞硝基陰離子，雖然在體內(nèi)過氧亞硝基陰離子很易降解，但是它具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，引起DNA氧化斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。

過氧亞硝基陰離子很不穩(wěn)定，不易檢測。但因其可使蛋白質(zhì)酪氨酸殘基或游離酪氨酸發(fā)生硝基化反應(yīng)，形成最終產(chǎn)物NT，因此，可通過檢測NT的生成量間接反映過氧亞硝基陰離子的產(chǎn)生水平[9-11]。

大量的基礎(chǔ)和臨床研究表明，糖尿病存在氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起腎病，但是對胰腺損傷的研究較少。本研究結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠胰腺腺泡上皮細(xì)胞和胰島結(jié)構(gòu)受損變性，說明糖尿病大鼠存在胰腺損傷。但糖尿病大鼠血清淀粉酶并不升高，這可能是糖尿病大鼠胰腺損傷的特點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠胰腺NT的表達(dá)顯著增加，表明胰腺氧化和抗氧化平衡嚴(yán)重失調(diào)，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。氧化應(yīng)激機(jī)制參與了糖尿病大鼠的胰腺損傷。

參 考 文 獻(xiàn)

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