siRNA抑制FANCF基因增加肺癌細胞對順鉑的敏感性

陳玉嬌，李堅，姜賀果，陳永昌

（1.江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

siRNA抑制FANCF基因增加肺癌細胞對順鉑的敏感性

陳玉嬌1，李堅1，姜賀果1，陳永昌2

（1.江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：研究抑制FA／BRCA途徑中的范可尼貧血相關(guān)蛋白F（FANCF）基因在增加人肺腺癌CALU-1細胞株對順鉑敏感性中的作用。方法：設(shè)計靶向于FANCF基因的3條siRNAs（FANCF-siRNAs），用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將其分別轉(zhuǎn)染于CALU-1肺癌細胞株，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后24 h FANCFmRNA的變化；篩選轉(zhuǎn)染效率最高的siRNA片段。蛋白質(zhì)印跡法檢測經(jīng)順鉑處理的CALU-1細胞株轉(zhuǎn)染siRNA前后FANCF蛋白表達及FANCD2蛋白單泛素化水平；免疫熒光法測定胞核中FANCD2蛋白核聚小體的形成；CCK-8法測定轉(zhuǎn)染siRNA前后的細胞增殖率變化。結(jié)果：與轉(zhuǎn)染前比較，CALU-1肺癌細胞株轉(zhuǎn)染FANCF-siRNA后FANCF蛋白表達明顯下降，F(xiàn)ANCD2蛋白單泛素化水平和核聚小體形成降低，細胞增殖率顯著下降。結(jié)論：應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默F(xiàn)ANCF基因可明顯增加肺癌細胞對順鉑的敏感性，提示在肺癌靶向治療策略中，F(xiàn)A／BRCA途徑中的FANCF基因很可能是一個潛在的分子靶標。

范可尼貧血相關(guān)蛋白F；FA／BRCA途徑；siRNA；順鉑；敏感性

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率呈逐年增長的趨勢。其中，非小細胞肺癌約占80%，主要為肺腺癌與肺鱗癌。順鉑（DDP）作為肺癌治療方案中的基本化療藥物，屬于廣譜細胞周期非特異性抗癌藥物，但其日益增強的腫瘤耐藥性限制了臨床應(yīng)用。研究表明，DNA損傷修復能力是腫瘤細胞對DDP耐藥的重要分子基礎(chǔ)，通過沉默與DDP耐藥相關(guān)的基因進而抑制腫瘤細胞的DNA損傷修復能力，可增加腫瘤細胞對DDP的敏感性，逆轉(zhuǎn)耐藥狀態(tài)，從而提高肺癌化療效果，改善患者預后［1］。

近來的研究顯示，范可尼貧血癥（Fanconi anemia，F(xiàn)A）途徑在DNA交聯(lián)損傷的修復中發(fā)揮重要作用［2］。FA途徑受損可導致細胞染色體不穩(wěn)定及對DNA損傷劑高度敏感。研究表明FA／BRCA途徑是細胞對DNA交聯(lián)劑引起的DNA交聯(lián)性損傷發(fā)生修復反應(yīng)所必需的。FA途徑的核心蛋白是范可尼貧血相關(guān)蛋白D2（Fanconi anemia complementation group D2，F(xiàn)ANCD2），上游是FA核心復合體，后者主要功能是單泛素化FANCD2，這一過程是BRCA1依賴性的，因此該途徑被稱為FA／BRCA途徑［3－4］。FANCD2在正常人體細胞中表現(xiàn)為兩個亞型：FANCD2-S和FANCD2-L。DNA交聯(lián)劑類化療藥物、紫外線和電離輻射可以激活FANCD2蛋白從相對分子質(zhì)量為155 000的小片段（FANCD2-S）修飾為162 000的大片段（FANCD2-L），二者之比（L／S）反映FANCD2蛋白單泛素化水平［3］。FA／BRCA途徑的信號傳導中最關(guān)鍵事件是FANCD2的單泛素化，而范可尼貧血相關(guān)蛋白F（FANCF）是FA核心復合體的主要組成成分，在FANCD2的單泛素化過程中發(fā)揮著重要作用。FANCF蛋白低表達或功能缺陷會干擾FA／BRCA途徑的正常功能，進而參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及對交聯(lián)劑類化療藥耐藥性的形成。對卵巢癌、宮頸癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究發(fā)現(xiàn)，部分腫瘤細胞FANCF基因啟動子甲基化所致的FANCF蛋白低表達可引起FANCD2單泛素化水平降低、FA／BRCA途徑功能被抑制，表現(xiàn)為腫瘤細胞對交聯(lián)劑類化療藥的敏感性增加［5－7］。抑制FANCF基因表達是否可增加肺癌細胞對DDP的敏感性，尚未見相關(guān)報道。

本實驗采用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)觀察FANCF基因沉默對肺癌CALU-1細胞部分生物學特性的影響。通過比較siRNA轉(zhuǎn)染前后CALU-1細胞的FANCD2單泛素化水平和FANCD2核聚小體形成狀態(tài)，以及細胞增殖率變化，探討通過沉默F(xiàn)ANCF基因而下調(diào)FA／BRCA途徑功能，以增加肺癌CALU-1細胞株對DDP敏感性的可行性及效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

非小細胞肺癌細胞株（CALU-1）購自中國科學院上海生命科學研究院；DDP購自江蘇豪森制藥有限公司；胎牛血清、高糖DMEM購自美國Gibco公司；siRNA套裝購自廣州銳博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒，Trizol購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；二甲基亞砜，Triton X-100購自美國Sigma公司；β-肌動蛋白，F(xiàn)ANCF蛋白抗體，F(xiàn)ANCD2蛋白抗體購自美國Santa Cruz公司；低聚甲醛，羊抗小鼠二抗，CY3熒光標記羊抗鼠二抗購自北京康為世紀公司；ECL發(fā)光劑購自美國Millipore公司；PVDF膜，牛血清白蛋白（BSA）購自瑞士Roche公司；DAPI購自美國Beyotime公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司；熒光定量試劑盒購自日本Toyobo公司。

靶向于FANCF基因的3條siRNAs序列（FANCF-siRNAs）由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計合成。siRNA-1序列：上游，5′-GGUCAACGUUUGCACUAUGDTDT-3′，下游，5′-CAUAGUGCAAACGUUGACCTDTD-3′；siRNA-2序列：上游，5′-GUACCUGGUCUUAGCAUCUDTDT-3′，下游，5′-AGAUGCUAAGACCAGGUACTDTD-3′；siRNA-3序列，上游，5′-CUUCGUAGUG GUGCAUUUADTDT-3′，下游，5′-UAAA UGCACCACUACGAAGTDTD-3′。

引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成。GAPDH引物序列：上游，5-TCCAAAATCAAGTGGGGCGA-3′，下游，5′-TGATGACCCTTTTGGCTCC-3′；FANCF基因引物序列：上游，5′-TGCTAACAGACTGGGGTCAAC-3′，下游，5′-TACAGGTCTCCAGGGCAGTTA-3′。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) CALU-1細胞株置于含10%熱滅活胎牛血清、青霉素（100 U／mL）、鏈霉素（100 μg／mL）的DMEM中，于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 篩選轉(zhuǎn)染效率最高的siRNA片段 將對數(shù)生長期的CALU-1細胞接種于6孔板，1×106／孔。培養(yǎng)12 h后換用無血清培養(yǎng)基饑餓12 h。實驗分6組，分別為空白對照組、陰性對照siRNA組、陽性對照siRNA組（GAPDH-siRNA），以及3個實驗組（分別為siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組）。siRNA轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol／L。按照siRNA試劑盒說明書，將LipofectamineTM2000與FANCF-siRNA儲存液各5 μL分別溶于250μL不含抗生素的無血清DMEM中，室溫孵育5 min。輕搖混勻LipofectamineTM2000與siRNA儲存液，室溫孵育20 min后，加入培養(yǎng)板中，培養(yǎng)基終體積為2 mL。轉(zhuǎn)染6 h后，換用含10%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后行RT-PCR檢測各組細胞FANCF mRNA水平，實驗重復3次。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測肺癌細胞FANCF和FANCD2蛋白表達 在3個實驗組中選擇轉(zhuǎn)染效率最高的siRNA-2片段轉(zhuǎn)染肺癌CALU-1細胞株，取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染成功前、后的CALU-1細胞接種于6孔板，2.5×106／孔，培養(yǎng)24 h。經(jīng)含DDP質(zhì)量濃度分別為0、2.5、5、10、20μg／mL的2 mL培養(yǎng)基處理24 h，棄培養(yǎng)基，預冷PBS洗2次，加入煮沸的2× SDS上樣緩沖液100μL，收集細胞總裂解物，100℃煮沸5 min，超聲破碎1 min，12 000×g，4℃離心5 min。將蛋白樣品行8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。一抗鼠抗人FANCF單克隆抗體（1∶100）、鼠抗人FANCD2單克隆抗體（1∶200）4℃孵育過夜。二抗羊抗鼠IgG（1∶2 000）室溫孵育1 h，β-肌動蛋白（1∶10 000）室溫孵育1 h。ECL發(fā)光劑顯色，Typhoon分子成像系統(tǒng)分析灰度，以FANCF／β-肌動蛋白、FANCD2／β-肌動蛋白比值表示FANCD2蛋白的相對含量，L／S比值反映FANCD2蛋白單泛素化水平，實驗重復3次。

1.2.4 免疫熒光法檢測FANCD2核聚小體表達在3個實驗組中選擇轉(zhuǎn)染效率最高的siRNA-2片段轉(zhuǎn)染肺癌CALU-1細胞株，取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染成功前、后的CALU-1細胞接種于24孔板，5×105／孔。設(shè)空白培養(yǎng)組，每組3個復孔，培養(yǎng)24 h，5μg／mL DDP處理24 h，PBS洗2次；每孔200μL 4%低聚甲醛固定細胞20 min，PBS洗30 min；300μL 0.3% Triton X-100透膜作用40 min，PBS洗30 min；500 μL 3%BSA室溫孵育1 h，PBS洗30 min；200μL FANCD2一抗4℃過夜，PBS洗15 min；熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS避光洗15 min；DAPI染核10 min，PBS暗處洗15 min；熒光顯微鏡下觀察熒光強度，實驗重復3次。

1.2.5 CCK-8法測定細胞增殖率 在3個實驗組中選擇轉(zhuǎn)染效率最高的siRNA-2片段轉(zhuǎn)染CALU-1細胞株，取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染成功前后的CALU-1細胞接種于96孔板中，2.0×103／孔，培養(yǎng)24 h，將一系列含DDP質(zhì)量濃度分別為0、1.25、2.5、5、10、20 μg／mL的培養(yǎng)基100μL分別加入對應(yīng)的孔，其中0 μg／mL為陰性對照組，同時設(shè)立空白孔（只含培養(yǎng)基）進行校正，每組樣本6個復孔。分別培養(yǎng)24、48 h后，于對應(yīng)孔加入CCK-8試劑10μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。酶標儀450 nm波長下檢測各孔的光密度（D）值。細胞增殖率＝［（D實驗組－D空白孔）／（D陰性對照組－D空白孔）×100%，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 篩選沉默效率最高的siRNA片段

空白對照組、陰性對照siRNA組、陽性對照siRNA組、siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組的FANCF mRNA表達水平分別為1.09±0.04、1.15±0.07、2.67±0.19、0.98±0.06、0.54±0.04和1.02± 0.05，結(jié)果顯示干擾效率最高的為實驗組中siRNA-2序列（F＝58.248，P＜0.05），其siRNA轉(zhuǎn)染后的細胞基因沉默率約達50.5%。見圖1。選擇轉(zhuǎn)染效率最高的siRNA-2進行下一步實驗。

圖1 siRNAs轉(zhuǎn)染CALU-1細胞后電泳結(jié)果

2.2 FANCF-siRNA轉(zhuǎn)染前后肺癌細胞FANCF蛋白表達及FANCD2單泛素化水平

經(jīng)FANCF-siRNA轉(zhuǎn)染后CALU-1細胞的FANCF蛋白較陰性對照組及空白對照組明顯減少（t分別為－5.487，－6.251，P均＜0.05），而陰性對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t＝ 0.081，P＞0.05），表明FANCF-siRNA轉(zhuǎn)染有效。見圖2。

經(jīng)FANCF-siRNA轉(zhuǎn)染的CALU-1細胞，除20 μg／mL DDP處理24 h后的L／S比值與轉(zhuǎn)染前差異無統(tǒng)計學意義外，其余各質(zhì)量濃度處理24 h后的FANCD2蛋白總量及L／S比值均較轉(zhuǎn)染前明顯降低（P均＜0.05），表明FANCD2單泛素化水平顯著降低。見圖3。

2.3 FANCF-siRNA轉(zhuǎn)染前后肺癌細胞FANCD2核聚小體表達

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，CALU-1細胞經(jīng)5μg／mL DDP處理24 h和48 h后，胞核內(nèi)FANCD2核聚小體表達增強（核聚小體形成）；CALU-1細胞轉(zhuǎn)染FANCD2-siRNA后，經(jīng)5μg／mL DDP處理24 h后胞核內(nèi)FANCD2核聚小體表達降低。見圖4。

圖2 FANCF-siRNA轉(zhuǎn)染前后CALU-1細胞株FANCF蛋白表達

圖3 FANCF-siRNA轉(zhuǎn)染前后CALU-1細胞株FANCD2單泛素化水平（L／S比值）

圖4 FANCD2核聚小體（箭頭示）表達情況

2.4 轉(zhuǎn)染FANCF-siRNA后順鉑對CALU-1細胞株增殖的抑制作用

CALU-1細胞株轉(zhuǎn)染FANCF-siRNA 24 h和48 h后，IC50較轉(zhuǎn)染前均顯著降低（P均＜0.05）。見表1。

轉(zhuǎn)染FANCF-siRNA前后的CALU-1株細胞增殖率均隨DDP質(zhì)量濃度的增高而降低，呈劑量依賴性，每個時間點不同濃度組之間增殖率差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。FANCF-siRNA轉(zhuǎn)染后，CALU-1株細胞增殖率在順鉑處理24 h和48 h時間點低于其siRNA轉(zhuǎn)染前（P均＜0.05）。見圖5。

表1 siRNA轉(zhuǎn)染前后CALU-1肺癌細胞經(jīng)順鉑處理后的IC50 μg／m L

3 討論

FA／BRCA途徑主要在細胞周期的S期被激活，在交聯(lián)劑類化療藥物（如DDP）引起細胞DNA損傷的修復過程中發(fā)揮重要作用。激活初始是FA／BRCA途徑上游蛋白（如FANCA、FANCB、FANCC、FANCE、FANCF等）形成FA核心復合體，然后FANCD2與FANCDI在FA核心復合體及泛素化結(jié)合酶（E2）等蛋白的作用下發(fā)生單泛素化，形成復合物ID，并與BRCA1，BRCA2，RAD51及ATR等相互作用，在DNA損傷部位共定位形成核聚小體，進而激活FA／BRCA途徑下游蛋白，與其他DNA修復途徑（如同源重組修復途徑、核苷酸切除修復途徑）相互作用，從而啟動對細胞DNA交聯(lián)性損傷的修復并對DDP等交聯(lián)劑產(chǎn)生抵抗［8－11］。研究發(fā)現(xiàn)，在頭頸部癌細胞中，DDP敏感細胞株FANCD2單泛素化水平明顯降低，而DDP耐藥細胞株FANCD2泛素化水平正常，抑制FA／BRCA途徑上游蛋白從而下調(diào)FANCD2單泛素化水平可顯著增強頭頸部癌細胞對DDP、奧沙利鉑的敏感性［12－13］。應(yīng)用選擇性FA／BRCA途徑抑制劑（如姜黃素等）在體外分別處理宮頸癌細胞、卵巢癌細胞、乳腺癌細胞和骨髓瘤細胞，可明顯增強其對DNA交聯(lián)劑類抗癌藥物的敏感性［14－16］，說明完整的FA／BRCA途徑功能狀態(tài)在腫瘤細胞對DNA交聯(lián)劑類抗癌藥物的耐藥機制中起重要作用，損害或抑制FA／BRCA途徑功能可增強腫瘤細胞對DNA交聯(lián)劑類抗癌藥物的敏感性。

圖5 FANCF-siRNA轉(zhuǎn)染CALU-1細胞增殖率的劑量 效應(yīng)曲線與時間 效應(yīng)曲線

FANCF作為FA／BRCA途徑的重要調(diào)控蛋白，位于該途徑上游，通過N端與FANCC／FANCE亞單位相互作用，通過C端與FANCF／FANCG亞單位相互作用，發(fā)揮穩(wěn)定FA復合體的作用。FANCD2在 FA復合體的作用下發(fā)生單泛素化，這是FA／BRCA途徑信號傳導過程中最關(guān)鍵的事件，而FANCF是激活FANCD2單泛素化的關(guān)鍵因子，因此，F(xiàn)ANCF是FA／BRCA途徑生物學功能所必需的重要蛋白。FANCF基因表達下降或缺失會導致FA／BRCA信號轉(zhuǎn)導途徑缺陷、細胞染色體不穩(wěn)定以及對DNA交聯(lián)性損傷劑高度敏感［17－19］。He等［6］研究顯示，采用siRNA技術(shù)沉默卵巢癌OVCAR3細胞的FANCF基因可降低FANCF、FANCD2蛋白的表達和FANCD2單泛素化水平，增加OVCAR3細胞對阿霉素的敏感性，表明沉默F(xiàn)ANCF基因能抑制卵巢癌OVCAR3細胞的FA／BRCA途徑功能從而逆轉(zhuǎn)細胞對阿霉素的耐藥性。Li等［7］研究也顯示沉默乳腺癌MCF-7細胞的FANCF基因可降低FANCD2單泛素化水平，抑制乳腺癌MCF-7細胞的FA／BRCA途徑功能從而增加其對米托蒽醌（mitoxantrone）的敏感性。

本實驗室之前的研究已經(jīng)證明肺癌細胞株CALU-1對DDP的耐藥性明顯高于肺癌A549細胞［20］，故本實驗選擇對DDP耐藥性較高的CALU-1細胞，采用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默F(xiàn)ANCF基因，通過觀察FANCF基因沉默前后FANCD2單泛素化水平和FNACD2核聚小體形成狀態(tài)，以及細胞增殖率變化，探討應(yīng)用轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默F(xiàn)ANCF基因，抑制FA核心復合體形成后增加肺癌細胞株CALU-1對順鉑敏感性的可行性及效應(yīng)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染FANCF-siRNA的CALU-1細胞，經(jīng)DDP處理后，F(xiàn)ANCF蛋白表達明顯下降，證實轉(zhuǎn)染成功，F(xiàn)ANCD2單泛素化水平及FANCD2核聚小體表達均降低，反映FA／BRCA途徑上游蛋白被激活并已行使單泛素化功能，CALU-1細胞的IC50及細胞增殖率顯著降低，表明對DDP敏感性明顯增強。最終證明，應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制FA／BRCA途徑上游的FANCF基因可顯著增加腫瘤細胞對DDP的敏感性。

綜上所述，F(xiàn)ANCF基因沉默能夠抑制肺癌CALU-1細胞株FA／BRCA途徑的DNA修復功能，逆轉(zhuǎn)CALU-1細胞株對DDP的耐藥性。FANCF有可能成為肺癌分子靶向治療策略中增強肺癌細胞對交聯(lián)劑類抗癌藥物敏感性的新靶點。

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Silencing of FANCF gene by siRNA interference sensitizes lung cancer CALU-1 cells to cisplatin

CHEN Yu-jiao1，LIJian1，JIANG He-guo1，CHEN Yong-chang2
（1.Departmentof Pulmonary Medicine，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Institute of BasalMedicine Science，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To examine whether silencing of FANCF gene by siRNA interference technique could sensitize lung adenocarcinoma CALU-1 cell line to cisplatin（DDP）.M ethods：Three siRNAs targeted to FANCF（FANCF-siRNAs）were designed and synthesized.After separately transfected into CALU-1 cells，the RT-PCR was used to determine the expression of FANCF mRNA，the siRNA with the highest transfection efficiency was selected.Western Blotting was carried out to detect the expression of FANCF protein，and the levels of FANCD2 protein monoubiquitination，which was defined by the radio ofmonoubiquitination-FANCD2（L）and non-monoubiquitination-FANCD2（S），in CALU-1 cells treated with cisplatin before and after FANCF-siRNA transfection.Immunofluorescence assay was performed to determine the formation of FANCD2 nuclear foci.CCK-8 technique was used to measure the cell proliferation rate of CALU-1 cells treated with DDP pre-and post-transfection of FANCF-siRNA.Results：After transfection of FANCF-siRNA，we found that silencing of FANCF gene decreased the levels of FANCD2 monoubiquitination（L／S ratio），and nuclear foci formation of FANCD2 in CALU-1 cells.Meanwhile，silencing of FANCF gene significantly decreased the cell proliferation rate in CALU-1 cells treated with DDP（both P＜0.05）.Conclusion：Silencing of FANCF gene by FANCF-siRNA transfection could potentiate the sensitivity to cisplatin in CALU-1 cells，suggesting that FANCF genemay be a potential target in therapeutic strategies for the treatment of lung cancer.

FANCF；FA／BRCA pathway；siRNA；cisplatin；sensitivity

陳玉嬌（1987—），女，碩士研究生；李堅（通訊作者），教授，主任醫(yī)師，博士生導師，E-mail：lijian541226＠163.com

R392.28；R979.1

A

1671－7783（2014）03－0195－06

10.13312／j.issn.1671-7783.y140014

2014－01－24 ［編輯］ 劉星星