高糖條件下心臟成纖維細胞對心肌細胞肥大的影響

趙龍，劉玲玲，李曉麗，周艷芳，王好，張贏予，孔彪，沈冬麗，張國輝

（江蘇大學附屬人民醫院心內科，江蘇鎮江212002）

高糖條件下心臟成纖維細胞對心肌細胞肥大的影響

趙龍，劉玲玲，李曉麗，周艷芳，王好，張贏予，孔彪，沈冬麗，張國輝

（江蘇大學附屬人民醫院心內科，江蘇鎮江212002）

目的：研究高糖條件下心臟成纖維細胞對心肌細胞肥大的影響。方法：將體外分離培養的SD乳鼠心肌細胞、心臟成纖維細胞隨機分為心肌細胞低糖組（A組），心肌細胞高糖組（B組），心肌細胞、心臟成纖維細胞共培養高糖組（C組），心肌細胞、心臟成纖維細胞共培養加轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）中和抗體高糖組（D組），心臟成纖維細胞低糖組（E組），心臟成纖維細胞高糖組（F組）。培養0，6，12，24，48，72 h后，倒置顯微鏡觀察細胞形態、拍照并計算心肌細胞表面積，RT-PCR檢測心肌細胞肥大標志物心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）mRNA表達水平，ELISA檢測各組培養液中TGF-β1表達量。結果：培養48 h時，B組心肌細胞表面積比A組顯著增加（P＜0.05），而C組在培養24 h時心肌細胞表面積已顯著高于A組（P＜0.05）。RT-PCR顯示B組和D組細胞在培養12 h時，ANP、β-MHCmRNA顯著升高（P＜0.05），培養24 h時達高峰；而C組在培養6 h時ANP、β-MHCmRNA即顯著升高（P＜0.05），培養12 h時達高峰。ELISA檢測結果顯示，培養12 h起B組、D組TGF-β1的表達均顯著高于A組（P＜0.05），而在培養6 h時C組TGF-β1的表達即已顯著高于A組（P＜0.05）。F組各時間點成纖維細胞TGF-β1的表達均高于E組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：心臟成纖維細胞在高糖條件下可能通過旁分泌TGF-β1促進心肌細胞的肥大。

高糖；心臟成纖維細胞；心肌細胞；轉化生長因子β1；心肌肥大

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）病理表現為心肌肥大、細胞外基質沉積和心肌纖維化等，有關心肌細胞肥大的發病機制尚不確切，但高血糖能直接作用于心肌細胞致其肥大已被廣泛證實［1－3］。最新研究表明心臟成纖維細胞能夠介導心肌細胞的肥大［4］，但其機制尚未完全闡明。本實驗通過觀察高糖條件下心臟成纖維細胞對心肌細胞肥大的作用，以探討高糖條件下心臟成纖維細胞對DCM心肌細胞肥大的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑健康的0～3日齡SD乳鼠（江蘇大學動物實驗中心提供），DMEM、胰蛋白酶、5溴脫氧尿嘧啶核苷（美國Sigma公司），標準胎牛血清（美國Hyclone公司），Millicell插入式培養皿（美國Mlilipore公司），轉化生長因子β1（TGF-β1）中和抗體（美國R＆D公司），倒置相差顯微鏡（日本尼康公司），Trizol（上海生工生物工程公司），大鼠TGF-β1ELISA試劑盒（上海奇康生物科技公司），RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司），其余生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 SD乳鼠心肌細胞、心臟成纖維細胞的分離、培養 取0～3 d健康SD乳鼠，超凈工作臺無菌條件下取出心臟，置于4℃預冷的PBS液中吹洗3次，將心臟剪成1 mm3的組織塊用0.08%的胰蛋白酶37℃水浴箱中振蕩消化8 min，吸棄前2次消化液，以后收集每次消化后的上清置于含等體積20%胎牛血清的DMEM中中和。重復上述消化過程3～5次，將收集的細胞懸液離心、重懸、過濾、接種，接種細胞加入到含10%胎牛血清的DMEM中37℃、5% CO2孵育箱中差速培養1.5 h，心肌細胞和心臟成纖維細胞得以分離并分別培養。心肌細胞的培養基中加入0.1 mmol／mL的5溴脫氧尿嘧啶核苷來抑制心臟成纖維細胞的生長，得到高純度的心肌細胞，按用途以不同密度接種于6孔板中，置于37℃、5% CO2孵育箱中培養待用。

1.2.2 實驗分組 將體外分離的心肌細胞、心臟成纖維細胞隨機分為心肌細胞低糖組（A組），心肌細胞高糖組（B組），心肌細胞、心臟成纖維細胞共培養高糖組（C組），心肌細胞、心臟成纖維細胞共培養加TGF-β1中和抗體高糖組（D組），心臟成纖維細胞低糖組（E組），心臟成纖維細胞高糖組（F組）。低糖組葡萄糖濃度為5.6 mmol／L，高糖組葡萄糖濃度為25 mmol／L。用于形態學觀察時6孔板中每孔接種心肌細胞密度為（10～20）×104／mL，用于mRNA測定時6孔板中每孔接種心肌細胞密度為（50～60）×104／mL。

1.2.3 共培養體系的建立 C組和D組取第2代成纖維細胞，以心臟成纖維細胞比心肌細胞為1∶4的比例加入到共培養插件Millicell裝置中，預培養12 h后將Millicell插件插入到預先培養心肌細胞的6孔板中，建立心肌細胞和心臟成纖維細胞非直接接觸的共培養體系。

1.2.4 心肌細胞形態學觀察及心肌細胞表面積的計算 倒置相差顯微鏡下觀察心肌細胞形態學變化及搏動情況，并于相應處理后0，24，48，72 h拍照，拍照后每組隨機取5個視野，每個視野隨機取6個細胞，共30個細胞，使用NIS-Elements軟件（Nikon倒置相差顯微鏡自帶軟件）計算心肌細胞表面積。

1.2.5 RT-PCR檢測心房鈉尿肽（ANP）、β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）mRNA的表達 以Trizol法提取細胞總RNA，以β-肌動蛋白為內參。引物由上海生工生物工程公司合成，ANP上游引物：5′-GGGTAGGATTGACAGGATTGG-3′，下游引物：5′-CGTGATAGATGAAGACAGGAAGC-3′，產物長度199 bp；β-MHC上游引物：5′-AGGAACAGGCCAACACCAAC-3′，下游引物：5′-CAAAGGCTCCAGGTCTCAGG-3′，產物長度209 bp；β-肌動蛋白上游引物：5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物：5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′，產物長度207 bp。按試劑盒說明反轉錄合成cDNA，然后以cDNA為模板進行目的片段的PCR擴增。反應條件：95℃30 s，然后95℃5 s，60℃34 s，共40個循環。PCR產物的特異性通過熔解曲線分析確認。反應結束后，數據以2－ΔΔCT法表達。

1.2.6 ELISA法檢測各組細胞培養上清中TGF-β1含量 各培養組在處理前更換為無血清培養基進行培養，分別抽取低、高糖處理0，6，12，24，48，72 h培養液離心后留取上清，按ELISA試劑盒操作，酶標儀（450 nm）檢測各孔光密度值，根據標準曲線計算各組細胞培養上清中TGF-β1濃度。

1.3 統計學處理

應用SPSS 19.0統計軟件進行數據處理和分析，所有數據以均數±標準差（ˉx±s）表示，多組數據比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌細胞形態學觀察及細胞表面積計算結果

剛分離接種后的心肌細胞呈圓形，培養4 h后細胞開始貼壁生長，逐漸由圓形變為梭形，偶見單個細胞開始搏動；24 h后細胞開始伸開，伸出偽足，部分變為棒狀、三角形、多邊形及不規則形態，90%以上細胞開始搏動，頻率75～150次／min，3 d后細胞偽足交織成網，形成細胞單層或細胞簇，其搏動呈現同步化。

心肌細胞貼壁48 h換液做相應處理后，于0，24，48，72 h在倒置相差顯微鏡下拍照（圖1）。根據細胞照片統計心肌細胞表面積，結果顯示，24 h時B組心肌細胞表面積和A組間差異無統計學意義（P＞0.05），C、D組心肌細胞表面積顯著高于A組，且C組顯著高于B組、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；48 h、72 h時B、C、D組心肌細胞表面積均顯著高于A組，且C組心肌細胞表面積均顯著高于B組、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 培養不同時間后的心肌細胞形態（倒置顯微鏡×200）

表1 各組心肌細胞培養不同時間表面積 μm3，±s，n＝30

表1 各組心肌細胞培養不同時間表面積 μm3，±s，n＝30

a：P＜0.05，與A組比較；b：P＜0.05，與B、D組比較

組別0 h 24 h 48 h 72 h A組 562.26±84.43 667.31±126.42 734.89±120.75 843.38±142.96 B組 569.87±121.98 717.31±134.67 1 107.90±207.41a 1 473.50±306.97a C組 544.32±155.21 1 102.72±239.44a，b 1 458.35±310.42a，b 1 804.10±400.23a，b D組 546.22±55.78 796.40±79.67a 1 137.24±151.56a 1 594.06±64.96a F值＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 1.03 46.64 57.21 62.02 P值

2.2 各組心肌細胞ANP、β-MHCmRNA的表達

RT-PCR顯示B組和D組細胞在培養12 h時，ANP、β-MHCmRNA顯著升高（P＜0.05），培養24 h時達高峰；而C組在培養6 h時ANP、β-MHCmRNA即顯著升高（P＜0.05），培養12 h時達高峰；D組培養24 h時ANP、β-MHC mRNA的表達較B組顯著增高（P＜0.05），且以后都高于B組，但低于C組。見圖2。

2.3 各組細胞培養液中TGF-β1的表達

ELISA法檢測結果顯示，B、D組細胞在培養12 h以后各時間段TGF-β1的表達均高于A組相應時間（P＜0.05），而C組在培養6 h時TGF-β1的表達即已顯著顯高于A組（P＜0.05），C組在培養12，24，48，72 h各時間點TGF-β1的表達均顯著高于B組、D組相應時間（P＜0.05）（表2）。F組各時間段TGF-β1的表達都明顯高于E組相應時間（P＜0.05）（表3）。

圖2 各組心肌細胞不同培養時間ANP、β-MHC mRNA的表達

表2 各組心肌細胞不同培養時間上清中TGF-β1的含量 pg／m L，±s，n＝3

表2 各組心肌細胞不同培養時間上清中TGF-β1的含量 pg／m L，±s，n＝3

a：P＜0.05，與A組比較；b：P＜0.05，與B組、D組比較

組別6 h 12 h 24 h 48 h 72 h A組 1 251.98±2.57 1 261.69±16.69 1 272.37±10.08 1293.72±13.18 1 344.40±14.81 B組 1 255.41±14.54 1 302.81±8.35a 1 530.79±25.06a 1 683.82±5.27a 1 696.69±6.37a C組 1 270.45±8.13a 1 365.42±7.96a，b 1 756.16±13.12a，b 1 827.37±27.85a，b 1 850.15±22.05a，b D組 1 267.17±6.65 1 294.25±9.30a 1 532.1±24.09a 1 704.87±6.65a 1 705.61±8.97a F值2.37 45.32 313.26 629.43 671.41 P值 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表3 心臟成纖維細胞培養上清中TGF-β1的含量 pg／m L，±s，n＝3

表3 心臟成纖維細胞培養上清中TGF-β1的含量 pg／m L，±s，n＝3

組別6 h 12 h 24 h 48 h 72 h E組 1 276.28±12.26 1 331.25±8.81 1 530.91±21.84 1 5.27 7.76 8.70 12.62 16.93 P值550.88±15.09 1 581.16±8.71 F組 1 300.88±5.76 1 468.03±32.34 1 610.43±21.63 1 680.35±5.64 1 780.41±16.17 t值＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

DCM是一種特異性心肌病，其發病不依賴于高血壓、冠心病、心臟瓣膜病、先天性心臟病和其他已知心臟疾病。其發病機制尚不確切，但根本上是由于高血糖、胰島素缺乏或胰島素抵抗與高胰島素血癥所引起的一系列級聯反應所致，各因素間相互影響，共同促進疾病的進展。作為糖尿病所致心力衰竭的重要原因之一，DCM受到了廣泛的關注。

持續的高血糖被認為是DCM的重要發病機制，心肌肥大和繼發的心力衰竭是DCM顯著的臨床表現。研究發現，高糖條件下能夠誘導離體大鼠心肌細胞發生肥大，但其機制未明確闡述［1－3］。本實驗在高糖條件下對心肌細胞進行單獨培養也誘導出了心肌肥大，與上述研究一致。除高血糖能引起心肌細胞肥大外，在成人心臟中成纖維細胞能夠調節心肌細胞的肥大［4－5］。心臟成纖維細胞是維持心臟正常功能的主要組成部分，對應激和損傷具有重要作用，其與周圍的心肌細胞存在旁分泌作用以及直接的細胞—細胞相互作用。心臟成纖維細胞和心肌細胞通過旁分泌向周圍微環境釋放蛋白質來調節周圍的細胞，心臟成纖維細胞可能通過激素的旁分泌途徑調節心肌細胞的表型，心肌細胞也可能通過相同的形式調節心臟成纖維細胞的表型［2］。

研究發現參與成纖維細胞和心肌細胞之間旁分泌的細胞因子有TGF-β1、FGF2、IL-6家族，以及最近發現的IL-33因子。TGF-β1是一種多功能的細胞間信號蛋白，調節多種靶基因的轉錄和表達，具有多種生物學效應。TGF-β1在心肌細胞和心臟成纖維細胞都有表達，而且高糖能夠刺激心臟成纖維細胞高表達TGF-β1［6］。我們的實驗也證明了這一結果。研究表明TGF-β1參與心肌肥大的過程［7］，其致心肌肥大作用與TGF-β1結合其受體并激活Smad通路有關［8］，該過程或許參與了人類肥厚性心肌病的發病機制。

本實驗通過建立心肌細胞、心臟成纖維細胞共培養模型，觀察高糖條件下心臟成纖維細胞對心肌細胞肥大的作用及可能途徑。結果表明，高糖誘導了體外培養心肌細胞的肥大，高糖共培養條件下心臟成纖維細胞明顯促進了心肌細胞的肥大，表現在肥大時間的提前和肥大程度的加劇。高糖共培養下應用TGF-β1中和抗體后心肌細胞肥大程度與高糖共培養組相比有所抑制，但仍比高糖組心肌細胞肥大明顯。這表明TGF-β1參與了高糖條件下心臟成纖維細胞影響心肌細胞肥大的過程，但不是唯一途徑。

綜上，高糖條件下心臟成纖維細胞促進了心肌細胞的肥大，心臟成纖維細胞旁分泌的TGF-β1可能參與了這一過程，但具體機制還不明確，有待于進一步的研究。針對心臟成纖維細胞對心肌細胞肥大機制的研究，可能為臨床上對DCM及其他心肌病的防治提供新的治療思路和方法。

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Effect of cardiac fibroblasts on cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose

ZHAO Long，LIU Ling-ling，LI Xiao-li，ZHOU Yan-fang，WANG Hao，ZHANG Ying-yu，KONG Biao，SHEN Dong-li，ZHANGGuo-hui
（Department of Cardiology，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To investigate the effect of cardiac fibroblast on cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose.M ethods：Neonatal CFs and CMs isolated from 0-to 3-day-old Sprague-Dawley rats were cultured in vitro，then random ly divided into six groups：CM low glucose group（group A），CM high glucose group（group B），CM and CF co-culture high glucose group（group C），CM-CF co-culture＋TGF-β1neutralizing antibody high glucose group（group D），CF low glucose group（group E），CF high glucose group（group F）.After cultured different times（0，6，12，24，48，72），cellularmorphologies were observed under the inverted phase contrastmicroscope，the mRNA levels of cardiomyocyte hypertrophy markers ANP、β-MHC were determinated by RT-PCR，the expression of TGF-β1evaluated by ELISA.Results：Compared with group A，cell surface area of group B cultured for 48 h increased significantly（P＜0.05），group C cultured for 24 h increased significantly（P＜0.05）respectively.RT-PCR showed that compared with group A，the expression of ANP、β-MHCmRNA of group B and D cultured for 12 h increased significantly（P＜0.05），cultured for 24 h increased atmost，group C cultured for 6 h increased significantly（P＜0.05），cultured for 12 h increased atmost respectively.ELISA showed that compared with group A，the expression of TGF-β1of group B cultured for 12 h increased significantly（P＜0.05），group C cultured for 6 h increased significantly（P＜0.05）respectively；compared with group E，6 h later group F increased sig-nificantly（P＜0.05）respectively.Conclusion：Cardiac fibroblastsmay via paracrine transforming growth factor-β1promote cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose.

high glucose；cardiac fibroblast；cardiomyocyte；transforming growth factor-β1；cardiomyocyte hypertrophy

R541.75

A

1671－7783（2014）03－0216－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y 130274

趙龍（1985—），男，碩士研究生；張國輝（通訊作者），博士，主任醫師，碩士生導師，E-mail：13338812776＠189.cn

2014－03－10 ［編輯］ 何承志