小鼠血管平滑肌細胞原代培養及體外鈣化模型的制備

徐麗華，嚴金川，伍超，逯朝陽，王中群，袁偉

（江蘇大學附屬醫院心內科，江蘇鎮江212001）

小鼠血管平滑肌細胞原代培養及體外鈣化模型的制備

徐麗華，嚴金川，伍超，逯朝陽，王中群，袁偉

（江蘇大學附屬醫院心內科，江蘇鎮江212001）

目的：建立一種簡單、高效的小鼠主動脈血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）原代培養方法及體外鈣化模型。方法：采用改良的組織貼塊法培養小鼠VSMCs，經免疫熒光染色法鑒定后，將細胞隨機分為對照組和鈣化組。采用von kossa染色及比色法檢測兩組細胞內鈣含量。結果：培養3～5 d時，可見細胞從組織塊邊緣爬出，7～10 d后細胞融合成片；免疫熒光染色顯示胞質表達特異性α-肌動蛋白；VSMCs培養至第2代細胞純度達95%；與對照組相比，鈣化組細胞的鈣含量、堿性磷酸酶（ALP）活性明顯增加（P均＜0.05）。結論：改良的組織貼塊法可獲得高純度的小鼠VSMCs；β-甘油磷酸鈉在體外可有效誘導其鈣化。

血管平滑肌細胞；原代培養；鈣化

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是血管壁的重要組成部分，通過協調血管收縮和舒張，控制血管壓力和流速。VSMCs的異常分化、遷移和增殖是損傷后血管重構的基本環節［1］。此外，VSMCs還是參與血管鈣化致動脈粥樣硬化的關鍵細胞，在特定條件下，可向成骨細胞樣表型轉化進而產生鈣化［2］。

VSMCs的體外培養和細胞株的建立是研究其生物學行為，探討相關疾病發病機制及防治的重要基礎。因此，熟練掌握VSMCs培養技術對相關疾病的研究具有重要意義。目前，主要采用組織貼塊法、胰蛋白酶消化法等傳統方法進行VSMCs的原代及傳代培養。我們對傳統組織貼塊方法進行改良，采用機械剝離與組織貼塊法相結合的方法，短期內成功獲得大量高純度、生長狀態良好的VSMCs，并在高磷環境下快速建立體外VSMCs鈣化模型。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL／6小鼠2只，雌雄不限，4～6周齡，體質量15～20 g，購于江蘇大學實驗動物中心，動物合格證號為SCXK（蘇2009-0002）。DMEM／F12高糖培養基、胎牛血清、胰酶均購自美國Gibco公司，β-甘油磷酸鈉、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、4，6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）購于Sigma公司，von kossa染色液購于上海舜百生物科技有限公司，堿性磷酸酶（ALP）測試盒、鈣測試盒、總蛋白定量試劑盒購于南京建成生物工程研究所，小鼠α-肌動蛋白抗體購自美國Santa Cruz公司，大鼠抗小鼠IgG Cy3標記二抗購于北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 取材及機械剝離 頸椎脫臼法處死小鼠，置于75%的乙醇中浸泡5 min，固定后依次剪開胸腹部皮膚、肌肉層及胸骨，充分顯露胸腔，取出胸主動脈，避免牽拉，縱向剖開血管，內膜朝上，用眼科鑷從左側位向右推移至中膜層翹起，直至中膜層完全剝離，PBS反復沖洗，備用。

1.2.2 組織貼塊 將中膜剪成1～2 mm3組織塊，均勻貼放于25 cm2培養瓶底，加入含20%胎牛血清的DMEM／F12培養液5 mL，側放，37℃，5%CO2培養箱中靜置1 h，緩慢反轉培養瓶，使組織塊浸沒于培養液中，繼續培養，待組織塊周圍細胞相互融合后剔除組織塊，細胞生長至70%時原瓶傳代。

1.2.3 細胞傳代及純化 棄培養液，PBS清洗，加入0.25%胰蛋白酶，待細胞回縮、間隙增大時終止消化，輕輕吹打細胞，離心，棄上清，重懸細胞，計數后傳代培養；每隔2天換液1次，待細胞融合成致密單層后即可再次傳代。

1.2.4 免疫熒光染色 取第2代對數生長期細胞，以每孔2×105個細胞接種于24孔板中，24 h后待細胞自然貼壁、生長良好時，棄培養基，PBS清洗，4%低聚甲醛固定，0.3%Triton-X 100透膜，BSA封閉，加入小鼠α-肌動蛋白一抗4℃孵育過夜，Cy3標記大鼠抗小鼠二抗37℃避光孵育1 h，DAPI復染核，鏡下觀察。

1.2.5 VSMCs體外鈣化模型的制備 取第5 8代細胞，以每孔5×105個細胞接種于6孔板中，分為對照組（含10%胎牛血清的DMEM／F12培養液）和鈣化組（含10%胎牛血清、10 mmol／Lβ-甘油磷酸鈉、10 mmol／L丙酮酸鈉、10－7mol／L胰島素、50μg／mL維生素C的DMEM／F12培養液）［3］，只有β-甘油磷酸鈉用于誘導VSMCs鈣化。每隔2天換液1次。分別培養3，7，10，14 d，收集相應細胞用于鈣定性、定量檢測和ALP活性測定。

1.2.6 von kossa染色 收集各組正常細胞及鈣化細胞，4%低聚甲醛固定，蒸餾水沖洗，加入5%硝酸銀溶液，日光照射40 min，至棕褐色絮狀物出現，5%硫代硫酸鈉反應5 min，中性紅復染1～3 min，鏡下觀察VSMCs鈣鹽沉積情況。

1.2.7 鈣定量測試 取鈣化3，7，10，14 d的細胞，棄培養液，PBS清洗2遍，每孔加入0.6%鹽酸脫鈣24 h，收集上清液，按照鈣測試盒（甲基百里香酚藍比色法）操作步驟檢測各組細胞鈣含量。脫鈣后的細胞用冷PBS清洗，加入RIPA／PMSF（100∶1）裂解細胞，收集蛋白，細胞蛋白含量采用BCA法檢測，以蛋白含量標化鈣含量，即測得的鈣含量除以蛋白含量（μmol／g）。

1.2.8 ALP測試 收集各組沉淀細胞，加入1% Triton X-100裂解，離心后取上清，按照ALP測試盒操作步驟檢測各組細胞ALP活性，BCA法檢測蛋白含量，并以蛋白含量標化ALP活性（U／g）。

1.2.9 MTT測定細胞增殖 取第5～8代細胞，以每孔2×104個細胞接種于96孔板中，分為對照組和鈣化組，方法同“1.2.5”，分別培養24，48，72 h，于490 nm波長測定D值，計算鈣化組與對照組D值的比值，繪制細胞生長曲線。

1.3 統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞培養及鑒定

組織塊接種培養3～5 d時，可見細胞從組織塊邊緣爬出，培養7～10 d后細胞生長迅速，細胞面積增大，融合成片，剔除組織塊，可見“峰 谷”狀生長，2 d后原瓶傳代。培養第2代細胞行特異性α-肌動蛋白免疫熒光染色，可見胞質呈紅色，內有大量與細胞長軸平行的纖維細絲，即肌動蛋白，細胞計數法計 算VSMC陽性率達95%。見圖1。

圖1 組織貼塊法培養的血管平滑肌細胞

2.2 體外培養的小鼠VSMC鈣化參數

von kossa染色結果顯示，對照組未見明顯鈣沉積，鈣化組3 d即可見少量棕黑色顆粒狀鈣沉積，7 d后鈣化顯著，多聚集在細胞周圍（圖2）。鈣化組細胞內鈣含量、ALP活性較對照組均明顯升高，且呈時間依賴性（P均＜0.05）。見表1。

圖2 小鼠血管平滑肌細胞von kossa染色（×200）

表1 2組血管平滑肌細胞鈣化指數 ±s

表1 2組血管平滑肌細胞鈣化指數 ±s

指標 組別 3 d 7 d 10 d 14 d F值 P值對照組 27.625±1.360 27.364±0.501 28.944±0.078 31.Ca2＋含量（μmol／g）355±1.916 4.602 0.087鈣化組 122.718±6.822 231.459±20.260 359.304±26.986 587.701±13.698 232.798 0.000 t值 －19.329 －14.242 －17.312 －56.884 P值0.003 0.005 0.003 0.000對照組 2.016±0.038 2.049±0.038 2.057±0.045 2.166± ALP活性（U／g）0.061 3.824 0.114鈣化組 3.702±0.003 5.021±0.100 6.260±0.060 7.060±0.056 1 017.040 0.000 t值 －35.485 －39.028 －78.776 －82.501 P值0.018 0.001 0.000 0.000

3 討論

VSMCs的異常增殖和遷移是導致動脈粥樣硬化、高血壓、血管成形術后再狹窄等多種心血管疾病的病理基礎［4－5］。

隨著對VSMC異常增殖、遷移、分泌及表型重塑等方面的認識不斷深化，體外高效培養高純度的血管平滑肌細胞成為研究的重要環節。傳統的原代VSMC體外培養方法主要有組織貼塊法、胰蛋白酶消化法和膠原酶消化法。傳統方法對血管損傷大，效率低，細胞純度不夠，特別是小鼠主動脈細小，成功率低。酶消化法時間不易掌握，對操作者要求較高。本研究對傳統組織貼塊方法進行改良，采用機械剝離與組織貼塊法相結合，血管損傷小，組織塊存活率高，細胞純度95%以上，生長狀態良好，第3代細胞即可用于實驗，縮短了實驗進程。

本實驗中，我們總結出與原代細胞培養的存活率及純度密切相關的幾個實驗注意點。①血管采集：打開小鼠胸腔后小心分離血管，血管分支用剪刀剪斷，避免牽拉及血管破損。② 機械鈍性分離：無須剔凈外膜，立體顯微鏡下采用顯微外科剪縱向剪開血管，顯微外科鑷沿血管長軸反復摩擦推移至血管外膜層與血管分離；小鼠主動脈血管內膜層較薄，無須刮除。③組織貼塊：將組織塊剪成1～2 mm2，組織塊過大細胞不易爬出，組織塊間隔2～3 mm，小心吸去組織塊周圍液體，有利于組織塊盡快貼壁，減少組織脫落。④盡量縮短整個操作流程，控制在1 h以內，時間越短，組織塊存活率越高。

血管鈣化是動脈粥樣硬化、糖尿病等病理狀態下骨特異性羥基磷灰石結晶主動沉積在血管壁的異常過程，可發生在動脈壁的內膜和中膜［6］。流行病學研究顯示，90%冠心病患者伴有血管鈣化。導致動脈粥樣硬化的危險因素如血脂異常、高血壓、糖尿病、慢性炎癥狀態等均可促進血管鈣化的形成與發展。分布于動脈粥樣硬化斑塊內微鈣化灶極易引起斑塊破裂，是造成急性心肌梗死、動脈夾層的重要原因［7－8］。本實驗采用β-甘油磷酸鈉誘導小鼠主動脈血管平滑肌細胞發生鈣化，鈣鹽主要沉積在細胞周圍，為進一步探討動脈硬化鈣化形成機制提供了理想的細胞模型。

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A modified method for primary culture and calcification of aortic vascular smooth muscle cell ofmouse

XU Li-hua，YAN Jin-chuan，WU Chao，LU Zhao-yang，WANG Zhong-qun，YUANWei
（Department of Cardiology，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To establish a simple and efficientmethod for primary culture ofmouse aortic vascular smooth muscle cells（VSMCs）and calcification model in vitro.M ethods：The primary VSMCs were harvested bymodified tissue-piece inoculation and identified by immunocytochemistry.The established VSMCswere randomly divided into control group and calcification group.Calcification of cellswas assayed by von kossa staining and colorimetrymethod.Results：VSMCsmigrated from explants ofmouse aorta tissue after 3-5 days of culture.After 7-10 days，VSMCs grew to form a fusing monolayer.Immunofluorescence staining with specificmAb againstmouseα-actin demonstrated VSMCswere positive.The cell purity of the 2ndgeneration of VSMCswas over 95%.Compared with the control group，the calcium content and ALP activity in the calcification group were increased significantly（both P＜0.05）.Conclusion：The method ofmodified explant-culture successfully established a effectivemodel for primary culture of VSMCs，of which calcification in vitro could be induced byβ-glycerophosphate.

vascular smooth muscle cell；primary culture；calcification

R543

A

1671－7783（2014）02－0110－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130262

國家自然科學基金資助項目（81170279，81370409）；江蘇省自然基金及創新團隊基金資助項目（BK2011486，LJ201116）；鎮江市心血管病重點實驗室（SS2012002）

徐麗華（1987—），女，碩士研究生；嚴金川（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：yanjinchuan＠hotmail.com

2013－11－27 ［編輯］劉星星