緊密連接蛋白claudin在食管癌中的表達及相關性研究

李 巖 姬明禮 李 兵

李巖:女，碩士，講師

緊密連接是細胞連接結構中位于上皮細胞或內皮細胞最頂端的蛋白復合體，由閉鎖蛋白(occludin)、claudins 和連接黏附分子(JAMs)等膜蛋白以及緊密黏連蛋白等胞漿蛋白組成，呈連續串珠狀連接相鄰的細胞，而起主要連接作用的是前二者，尤以claudins 的功能最為重要，它是構成緊密連接的主要骨架蛋白。目前普遍認為，細胞間黏附力喪失可導致細胞連接的破壞，與腫瘤細胞的浸潤和轉移有關。近年研究報道，claudin 蛋白的異常表達與腫瘤的轉移有關［1］。食管癌是消化道常見惡性腫瘤之一，分子生物學研究表明，腫瘤的發生、發展是多階段、多基因參與、多種轉錄因子調控的過程，涉及一系列病理生理反應，包括細胞的異常增殖、黏附、運動、細胞外基質降解、血管生成等［2］。我們檢測了食管癌組織及健康食管組織中claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 的表達，以探討其對食管癌浸潤及轉移的影響。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011～2013年在某院食管癌術后病理標本共62例，男41例，女21例。年齡28～76 歲，中位年齡59 歲。均為鱗狀細胞癌。均經病理檢查確診，術前均未進行過放化療及其他生物學治療。另取20例經病理檢測為非食管癌的食管組織作為對照組。

1.2 方法 claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10兔多克隆抗體、DAB 試劑盒、免疫組化檢測試劑、其他試劑均為國產分析純。所有標本經10%的中性甲醛固定24 h，常規脫蠟后，在檸檬酸鹽緩沖液中抗原高溫修復20 min。用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min 1 次，連續3 次;3% H2O2室溫下孵育10 min，用PBS 沖洗2 min 1 次;連續3 次，然后分別加入claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 抗體4 ℃放置8 h 以上。用PBS 沖洗2 min 1 次，連續3 次，滴加pv-9000試劑(聚合物輔助劑)20 min 后，用PBS 沖洗(2 min ×3 次)，滴加pv-9000 試劑二(辣根酶標記山羊抗兔/小鼠IgG 多聚體)20 min后用PBS 沖洗2 min 1 次，連續3 次，滴加DAB 液染色5 min，蒸溜水沖洗，蘇木素復染5 min，鹽酸乙醇脫色2 s，氨水中返藍1 min，常規脫水，中性樹膠封片。

1.3 判定標準 claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 以細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性。以陽性細胞所占比例(5 個高倍視野)分級。(-)為陰性表達;(+)為陽性表達。

1.4 統計學處理 應用SPSS 13.0 統計軟件，計數資料采用兩獨立樣本的χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 兩組病理標本claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 陽性表達率比較(表1，表2)

表1 兩組病理標本claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 的陽性表達率比較例(%)

2.2 食管癌患者claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10的表達與臨床病理特征(表2)

表2 食管癌患者claudin-3、claudin-4、claudin-7、claudin-10 的表達與臨床病理特征(例)

表1，表2可以看出，claudin-3、claudin-7、claudin-10在食管癌組織中陽性率高，正常食管上皮組織陽性率低。食管癌陽性率較正常食管上皮明顯升高;且癌組織中claudin-3、claudin-7、claudin-10 的表達均與其分化程度相關，并隨分化程度升高，陽性率明顯升高。而在食管癌組織中伴有claudin-4 的表達下調，低分化組中claudin-4 的表達明顯低于中- 高分化組。同時可以分析出，食管癌組織中claudin-3、claudin-7、claudin-10 的陽性表達呈正相關;而claudin-3、claudin-7、claudin-10 的表達均與claudin-4 呈負相關。

3 討 論

正常分化組織的細胞組成是高度有序的，癌組織則通常缺乏這種特性，腫瘤細胞常常是分化變差、細胞極性消失及胞間緊密連接功能失常。緊密連接完整性的破壞可能是導致腫瘤細胞生長所需的營養因子及其他因子擴散的原因。食管鱗癌的發生通常經歷從正常食管上皮-食管炎-異型增生-食管癌的系列演變過程［2］。緊密連接是維持上皮細胞內環境穩定的重要結構，claudin 蛋白是緊密連接結構與功能的重要組成成分。癌組織形成的主要特征是緊密連接的破壞、黏附性消失、細胞獲得侵襲性和正常分化的缺失。不同的claudin成員以多種組合方式參與構成緊密連接，增加了緊密連接的結構和功能的多樣性，為不同組織類型屏障功能的多樣性提供了分子基礎。claudin 在多種上皮來源的腫瘤中表達異常，推測其在這些腫瘤的發生及發展過程中可能發揮一定的作用［1］。

本研究發現claudin-3、claudin-7、claudin-10 在食管癌中的陽性表達率為分別為90.3%、95.5%、82.3%，較正常食管組織表達顯著增強，差異有統計學意義(P ＜0.05)，提示claudin-3、claudin-7、claudin-10 蛋白過表達可能是食管癌發生的早期表現，可能與食管癌的發生有關，而且其表達程度與食管癌的分化程度呈正相關，因此又可以作為食管癌發展情況的分析指標。而claudin-4 與claudin-3、claudin-7、claudin-10 在正常組織和食管癌組織中均呈現負相關表達，差異有統計學意義(P ＜0.05)。另有研究表明隨著claudin-4的表達減低，腫瘤的侵襲性不斷增強。伴有claudin-4表達陰性患者的5年生存率明顯低于表達陽性患者［3-4］。因此可以結合以上任一兩組claudin 的表達情況，為臨床診斷提供參考。

Claudin 蛋白及其他緊密連接蛋白的表達異常目前已被認為是細胞間黏附性丟失的機制和腫瘤細胞發生及轉移的重要步驟，而這些步驟又可能在癌細胞的凝聚力降低、分化變差及侵襲性增加的過程中發揮了重要作用［5］。本研究結論提示深入開展這方面的研究有可能為食管鱗癌的抗轉移治療開辟一條新的途徑。

［1］ 徐 冬.Claudin 蛋白與腫瘤關系的研究進展［J］.實用臨床醫學，2010，11(9):130-133.

［2］ Ding L，Lu Z，Lu Q，et al.The claudin family of proteins in human malignancy:a clinical perspective［J］.Cancer Manag Res，2013(5):367-375.

［3］ Lee KW，Lee NK，Kim JH，et al.Twist1 causes the transcriptional repression of claudin-4 with prognostic significance in esophageal cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，423 (3):454-460.

［4］ Xiang RL，Su YC，Pei XQ.Progress in functions of tight junction protein claudin-4［J］.Sheng Li ke Xue Jin Zhan，2012，43(4):310-314.

［5］ Sung CO，Han SY，Kim SH.Low expression of claudin-4 is associated with poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Ann Surg Oncol，2011，18(1):273-281.