基質細胞衍生因子-1α對間充質干細胞遷移的影響

謝桂琴，徐曉靜，張煥相

（蘇州大學基礎醫學與生物科學學院細胞生物學系，江蘇蘇州215123）

基質細胞衍生因子-1α對間充質干細胞遷移的影響

謝桂琴，徐曉靜，張煥相

（蘇州大學基礎醫學與生物科學學院細胞生物學系，江蘇蘇州215123）

目的：研究基質細胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）對間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）遷移的影響及可能的機制。方法：采用全骨髓法體外分離培養并擴增大鼠骨髓來源的MSCs，應用Boyden趨化小室實驗觀察不同質量濃度（0，5，25，50和100 ng／mL）的SDF-1α對MSCs定向遷移的影響，通過蛋白質印跡法和Boyden趨化小室實驗觀察細胞內PI3K／Akt和MAPKs信號通路在MSCs向SDF-1α遷移過程中的變化。結果：不同質量濃度的SDF-1α通過調節PI3K／Akt和MAPKs信號通路，不同程度上影響MSCs的趨化性遷移，低質量濃度的SDF-1α促進細胞遷移，而高質量濃度對細胞遷移起到抑制作用；阻斷MSCs中基底水平PI3K／Akt和MAPKs信號通路在不同程度上抑制了MSCs趨向SDF-1α遷移作用。結論：MSCs向SDF-1α遷移能力隨著PI3K／Akt信號的強弱而增減；JNK／SAPK信號的減弱顯著抑制了SDF-1α誘導的MSCs定向遷移；SDF-1α可以促進細胞內ERK1／2和p38MAPK兩條信號通路，而ERK1／2和p38MAPK信號對SDF-1α促進的細胞遷移影響并不顯著。

間充質干細胞；基質細胞衍生因子-1α；細胞遷移；PI3K／Akt和MAPKs信號通路

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因來源廣泛，體外培養增殖快，生長穩定，無免疫排斥及多向分化潛能，在細胞治療及組織工程學中成為了一種頗具前景的種子細胞［1－2］，廣泛應用于臨床治療。在細胞介導的治療中，需誘導足夠數量的自體或外源移植的MSCs到所需部位［3］，要求這些細胞能夠正常生存及更新，并可遷移至特定部位。大量研究發現移植的MSCs對于機體的病灶部位會產生明顯的趨化遷移效應，該趨化性遷移是由受損部位所分泌的如肝細胞生長因子（HGF）、血管內皮生長因子（VEGF）等生長因子及炎癥信號分子所誘導引起的［4－5］。

基質細胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）是由骨髓基質細胞及其他相關的間質細胞和上皮細胞分泌的一種趨化蛋白，可以誘導多種類型細胞遷移［6－8］。CXC族趨化因子受體-4（CXCR4）是目前已知SDF-1α的唯一受體，SDF-1α的趨化作用由其受體CXCR4介導，兩者結合并通過相互作用啟動下游信號通路。PI3K／Akt和MAPKs信號通路參與調節細胞增殖、分化、凋亡、遷移等多種細胞行為，尤其在趨化因子誘導的細胞定向遷移中起著至關重要的作用［9－11］。大量研究表明，抑制PI3K／Akt或MAPKs信號通路影響多種類型細胞遷移［12－13］。在本實驗中，我們主要利用Boyden趨化小室實驗和蛋白質印跡技術觀察PI3K／Akt和MAPKs信號通路對SDF-1α誘導的MSCs定向遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 100～150 g Sprague Dawley（SD）大鼠，由蘇州大學實驗動物中心提供。動物實驗依照《中華人民共和國實驗動物管理條例》和《蘇州大學實驗動物管理辦法》實施。

1.1.2 主要試劑 L-DMEM培養基（Gibco公司）、胎牛血清（Gibco公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、EDTA（Bio Basic公司）、SDF-1α（PeproTech公司）。羊抗兔p-Akt（Ser473）、Akt、p-JNK／SAPK（Thr183／Tyr185）、JNK／SAPK、p-ERK1／2（Thr202／Tyr204）、ERK1／2、p-p38MAPK（Thr180／Tyr182）、p38MAPK抗體（Santa Cruz公司），羊抗鼠β-肌動蛋白（Cell Signaling Technology公司），HRP-山羊抗兔、山羊抗鼠二抗（PTGLAB公司）。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離與培養

SD大鼠乙醚麻醉后頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡消毒5 min，取出股骨、脛骨，放置在預冷的75%乙醇中。移入超凈臺在無菌環境中操作，剔除肌肉組織，剪斷股骨、脛骨兩端，用2mL注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM完全培養基，吹打骨髓腔至發白，細胞懸液吹打均勻，計數，細胞以2× 106／mL的密度接種于60mm培養皿中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的細胞培養箱中培養。24 h后細胞第1次換液，之后每3 d換液。2周左右，細胞匯合度達80%～90%，吸出培養皿中的培養基，加入2 mL PBS以清洗死細胞及殘留培養基。加入1 mL預熱的0.25%的胰酶消化，顯微鏡下觀察細胞回縮成圓形時，棄去胰酶。加入2 mL完全培養基終止消化，利用移液槍輕柔吹打皿底，使所有細胞完全懸浮，按1∶2比例傳代接種細胞。實驗所用的MSCs均是第3－10代細胞。

1.2.2 Boyden趨化小室實驗 待MSCs匯合度達到80%時，用無血清的L-DMEM預處理細胞，30 min后棄去處理液，0.25%胰酶消化，收集細胞并計數，調整細胞密度為8×105／mL待用。Boyden小室裝置的下室每孔加入30μL不同質量濃度的SDF-1α（0，5，25，50和100 ng／mL），每組9個重復，用不含聚乙烯吡咯的聚碳酸酯膜（左上角剪一缺口）蓋住下室48孔，分別蓋上軟塑片和硬塑片，擰緊螺帽。上室每孔加入L-DMEM懸液的MSCs 50μL（含4× 104個細胞／室）。將Boyden小室置于一潔凈的濕盒中，37℃細胞培養箱內靜置4 h。取出小室，松開螺帽，取出膜。夾子夾住膜的兩端，刀片刮去上室膜面細胞，于PBS中輕洗。將下室膜面細胞置于4%低聚甲醛中固定30min，再置于5%結晶紫中染色10min，自來水漂洗，倒置相差顯微鏡拍照。各實驗組隨機抽取4～6個視野，使用Image J軟件計數通過微孔遷移至膜下方的細胞。每組實驗重復3次。

研究PI3K／Akt、MAPKs信號通路對MSCs向SDF-1α遷移影響的實驗中，分別采用特異性小分子化學抑制劑30μmol／L的LY294002、50μmol／L的PD98059、30μmol／L的SB203580、10μmol／L的SP600125預處理細胞，L-DMEM預處理作為對照組，30 min后消化收集細胞。Boyden小室裝置的下室加入25 ng／mL SDF-1α30μL，上、下室分別含有相對應的L-DMEM或抑制劑進行細胞遷移檢測。

1.2.3 蛋白質免疫印跡 待MSCs匯合度達到80%左右，用無血清的L-DMEM預處理細胞30 min，棄去培養基，分別加入不同質量濃度的SDF-1α（0，5，25，50和100 ng／mL）30 min或加入25 ng／mL SDF-1α不同時間（0，5，15，30和60 min）后，用預冷的PBS清洗1遍，將細胞置于冰上，向培養皿中加入200μL含磷酸酶和蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，用細胞刮將貼壁細胞刮下，2 mL注射器反復抽吸，直至黏稠液體變得清亮。12 000×g，4℃離心10 min。取上清，記錄上清體積。利用BCA試劑盒測定蛋白的濃度。向上清液中按比例加入4×上樣緩沖液，95℃煮10 min，冰上快速冷卻，分裝每管20 μL，－20℃保存。用SDS-PAGE 80 V恒壓電泳，半干法恒流轉膜。取出NC膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，室溫孵育一抗1.5 h或4℃過夜，室溫孵育二抗1 h。ECL反應，檢測MSCs中Akt、JNK／SAPK、ERK1／2及p38MAPK蛋白的磷酸化變化情況。

1.3 統計學處理

采用SPSS 16.0統計學軟件對實驗數據進行統計處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSCs的形態特征

體外培養的間充質干細胞，待細胞匯合度達到80%～90%，倒置顯微鏡下呈現兩種不同的形態：長梭形和纖維樣（圖1）。實驗室前期檢驗證明該種方法分離、培養的MSCs，表達間充質干細胞表面標志CD29、CD90和CD106，而造血干細胞表面標志CD34和CD45并不表達。

圖1 MSCs的形態

2.2 不同質量濃度的SDF-1α對MSCs遷移的影響

如圖2A和圖2B所示，不同質量濃度的SDF-1α對MSCs遷移的影響不同。低質量濃度的SDF-1α促進MSCs定向遷移，而高質量濃度的SDF-1α抑制了細胞遷移，25 ng／mL的SDF-1α誘導了最大的遷移數量。我們在上下室均加入（機動組）或不加入（對照組）25 ng／mL SDF-1α，發現兩組細胞遷移數目無明顯差異，均明顯低于僅下室加25 ng／mL SDF-1α的趨化組，這表明SDF-1α誘導的MSCs遷移是通過化學趨化性而非化學機動性引起的（圖2C）。

圖2 不同質量濃度的SDF-1α對MSCs遷移的影響

2.3 SDF-1α調節MSCs中PI3K／Akt和MAPKs信號通路

采用蛋白質印跡法檢測經不同濃度SDF-1α刺激的MSCs中Akt、ERK1／2、JNK／SAPK和p38MAPK磷酸化水平，結果表明，SDF-1α誘導的PI3K／Akt和MAPKs磷酸化呈現濃度依賴性效應。見圖3。5 ng／mL SDF-1α作用MSCs后，細胞中Akt、ERK1／2及p38MAPK磷酸化水平略有升高，25 ng／mL SDF-1α明顯地促進了細胞中這3種蛋白的磷酸化（P均＜0.05）。而不同質量濃度SDF-1α作用導致MSCs中SAPK／JNK磷酸化水平下降，但差異無統計學意義。

圖3 不同質量濃度的SDF-1α調節MSCs中MAPKs和PI3K／Ak t的磷酸化

選用25 ng／mL SDF-1α處理MSCs不同時間（0，5，15，30及60 min），蛋白質印跡檢測細胞中Akt、ERK1／2、JNK／SAPK和p38MAPK磷酸化水平變化。結果表明，MSCs中磷酸化的Akt、ERK1／2、JNK／SAPK及p38MAPK均有一個基底水平的表達。SDF-1α處理MSCs后，細胞中p-Akt水平5 min開始顯著升高，一直持續到60 min；p-ERK1／2水平5 min顯著升高，15 min時達到峰值，30 min后恢復到基底狀態；p-p38MAPK水平先上升后下降，然后再次升高，整個過程中該蛋白的磷酸化水平均高于基底水平；而p-JNK／SAPK水平并沒有發生顯著性變化。見圖4。

圖4 25 ng／m L SDF-1α刺激MSCs不同時間MAPKs和PI3K／Akt的磷酸化

2.4 抑制PI3K／Akt或MAPKs信號通路影響SDF-1α促進的MSCs遷移

抑制劑LY294002、PD98059、SP600125和SB203580預處理MSCs30 min后，應用Boyden趨化小室實驗檢測細胞向25 ng／mL SDF-1α遷移的變化。結果表明，抑制PI3K／Akt和MAPKs信號通路均在不同程度上減弱了MSCs向SDF-1α遷移。見圖5。

3 討論

大量研究表明MSCs可以遷移至受損、炎癥及腫瘤部位［14－16］，從而治療炎癥并且減弱肝、腎臟及心肌的損傷。目前認為MSCs保護損傷組織的機制并非是細胞遷移至受損部位通過分化為損傷區域的細胞進行組織修復［17－18］，而主要是通過旁分泌機制，特別是細胞因子對MSCs的趨化效應進行修復的［19－21］。SDF-1α蛋白作為一種分泌蛋白通過與細胞表面受體CXCR4結合，激活細胞內多條信號通路如PI3K／Akt和MAPKs通路，導致細胞內骨架相關蛋白的重排，進而影響細胞的定向遷移［22－23］。PI3K／Akt和MAPKs信號通路參與調節細胞增殖、分化、凋亡、遷移等多種細胞行為，尤其在趨化因子誘導的細胞定向遷移中起著至關重要的作用［9－11］。

圖5 抑制PI3K／Akt或MAPKs信號通路對SDF-1α促進MSCs遷移的影響

本實驗以全骨髓法體外分離培養的MSCs為研究對象，觀察了SDF-1α刺激下的細胞中PI3K／Akt和MAPKs信號通路變化情況以及抑制這些信號通路對MSCs趨向SDF-1α遷移的影響。我們發現不同質量濃度的SDF-1α在不同程度上影響MSCs的趨化性遷移，低濃度的SDF-1α促進細胞遷移，而高濃度對細胞遷移起到抑制作用。研究表明，生長因子對細胞遷移的調節具有二重性作用，低濃度利于細胞遷移，而高濃度的因子不利于細胞遷移［24－25］。梁光波等［25］在研究ECV304細胞向SDF-1α遷移的過程中發現高濃度的因子導致細胞內腱糖蛋白表達減弱，增強細胞黏連，進而抑制細胞遷移。早期研究顯示［26－27］，SDF-1α通過激活細胞內PI3K／Akt和MAPKs信號通路促進細胞遷移，我們的結果顯示SDF-1α作用后，MSCs中Akt、ERK1／2及p38MAPKs磷酸化水平均顯著升高，而JNK／SAPK磷酸化程度無明顯變化。干擾PI3K／Akt或JNK／SAPK信號抑制了SDF-1α促進的MSCs遷移，而阻斷ERK1／2和P38MAPK信號對細胞遷移并未產生顯著性影響。我們的實驗結果表明SDF-1α通過激活細胞內PI3K／Akt信號促進MSCs遷移，與此同時，基底水平的JNK／SAPK信號在MSCs向SDF-1α趨化性遷移中起著不可或缺的作用。

本研究主要集中于SDF-1α對MSCs遷移的影響，以及在這個過程中PI3K／Akt和MAPKs信號對這個過程的調節。結果表明，MSCs向SDF-1α遷移能力隨著PI3K／Akt信號的強弱而增減；JNK／SAPK信號的減弱顯著抑制了SDF-1α誘導的MSCs定向遷移；SDF-1α可以促進細胞內ERK1／2和p38MAPK兩條信號通路，而ERK1／2和p38MAPK信號對SDF-1α促進的細胞遷移影響并不顯著。本研究結果為進一步研究細胞遷移提供方向，同時也為臨床應用MSCs治療組織損傷、機體創傷等提供了理論依據。

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Effect of SDF-1αon them igration ofmesenchymal stem cells

XIE Gui-qin，XU Xiao-jing，ZHANG Huan-xiang
（Department of Cell Biology，Basic Medical and Biological College of Soochow University，Suzhou Jiangsu 215123，China）

Objective：To investigate the effect of stromal cell-derived factor-1α（SDF-1α）on themigration ofmesenchymal stem cells（MSCs）and themechanism involved in cellmigration.M ethods：MSCs were isolated from rat bonemarrow in vitro.Boyden chamber was used to study the behavior of cellmigration toward SDF-1αat different concentrations（0，5，25，50，and 100 ng／mL）.Then，we detected the phosphorylation of PI3K／Akt and MAPKs by addition of SDF-1αby Western blot.Finally，pretreatment with specific chemical inhibitors to block PI3K／Akt or MAPKs signaling，we analyzed the influence of these signaling on SDF-1α-induced cellmigration by Boyden chamber.Results：SDF-1αat different concentrations influenced MSCsmigration by the regulation of PI3K／Akt and MAPKs signaling，and low concentrations of SDF-1αwere positive related to cellmigration，while high concentrations played converse effect.Interference with basal PI3K／Akt or MAPKs signaling decreased SDF-1α-induced MSCsmigration to a variable extent.Conclusion：SDF-1α-induced MSCs migration was positively regulated to the changing of PI3K／Akt signaling.Meanwhile，blocking JNK／SAPK signaling significantly decreased SDF-1α-induced directed migration of MSCs.Treatment with SDF-1αcould promote ERK1／2 and p38MAPK signaling pathways in MSCs，yet interference with the two signaling had no significant inhibition of cellmigration.

mesenchymal stem cells；SDF-1α；cellmigration；PI3K／Akt and MAPKs signaling

R393

A

1671－7783（2014）04－0277－06

10.13312／j.issn.1671-7783.y140164

國家自然科學基金資助項目（31371407，31071220）；蘇州市科技計劃項目（SYS201203）

謝桂琴（1989—），女，碩士研究生；張煥相（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：hzhang＠suda.edu.cn

2014－06－03 ［編輯］何承志