生存素和Caspase-3蛋白在食管癌前病變及癌組織中的表達及意義

周正斌，周瑞，黃震，曹鵬，成宏偉

（泰興市人民醫院1.消化內科，2.病理科，江蘇泰興225400）

生存素和Caspase-3蛋白在食管癌前病變及癌組織中的表達及意義

周正斌1，周瑞1，黃震1，曹鵬2，成宏偉1

（泰興市人民醫院1.消化內科，2.病理科，江蘇泰興225400）

目的：探討食管癌前病變及癌組織中生存素和Caspase-3蛋白的表達及其意義。方法：用免疫組織化學法檢測63例食管癌（食管癌組）、86例食管鱗狀上皮不典型增生（包含輕度、中度、重度）患者（不典型增生組）和40例正常食管黏膜（正常黏膜組）組織中生存素和Caspase-3蛋白的表達，并計算陽性表達率。分析這兩類蛋白表達與食管癌臨床分期的關系。結果：在正常黏膜組、不典型增生組和食管癌組中生存素的陽性表達率逐漸升高（rs＝0.732，P＜0.01），而Caspase-3蛋白的陽性表達率則逐漸減弱（rs＝－0.687，P＜0.05）。在食管癌組，生存素表達與淋巴結是否轉移及臨床分期（Ⅰ＋Ⅱ期／Ⅲ＋Ⅳ期）相關（P＜0.01）；Caspase-3表達與食管癌分化程度相關（P＜0.01）；生存素的陽性表達率與Caspase-3蛋白的陽性表達率呈負相關（r＝－0.897，P＜0.01）。結論：生存素和Caspase-3蛋白的異常表達可能與食管癌的發生、發展密切相關，可作為食管癌早期診斷及判斷預后的腫瘤標志物。

食管癌；癌前病變；生存素；Caspase-3；不典型增生

食管癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，在我國其發病率和病死率居世界首位。由于發病和進展機制尚未完全闡明，故眾多學者仍致力于尋找食管腫瘤發生、發展的原因，以求找到治療的靶標。分子生物學的發展顯示，食管癌的發生、發展過程涉及多個基因的改變，是多個基因協同作用的結果。細胞凋亡存在于腫瘤的發生、發展過程中，而且與腫瘤的血管生成、轉移等有密切關系，影響腫瘤預后。生存素是凋亡抑制蛋白家族成員，是迄今發現的最強凋亡抑制因子。Caspase-3是引發細胞凋亡蛋白酶級聯反應中的核心蛋白酶。為此，我們采用免疫組織化學法檢測食管癌前病變及癌組織中生存素、Caspase-3蛋白的表達，并探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集我院2011年4月至2013年4月，86例胃鏡病理診斷為食管黏膜不典型增生的患者相應組織標本（不典型增生組），其中，男58例，女28例，年齡32～79歲，平均（39.7±2.3）歲；輕度不典型增生29例，中度31例，重度26例。63例食管癌病例（食管癌組）中，男41例，女22例，年齡35～77歲，平均（40.3±3.1）歲；結合超聲、CT、全身骨放射性核素掃描、PET-CT及術后病理等，按腫瘤分化程度分類：低分化36例，中＋高分化27例；按TNM分期標準：T1＋T215例，T3＋T448例；臨床分期：Ⅰ＋Ⅱ期38例，Ⅲ＋Ⅳ期25例；淋巴轉移39例，無淋巴轉移24例。取同期正常食管黏膜組織40例（正常黏膜組），其中，男27例，女13例，年齡33～76歲，平均（36.9±2.9）歲。3組性別及年齡間的差異無統計學意義。所有標本取材前患者均未經放療或化療，均經10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 mm厚連續切片。

1.2 試劑

生存素和Caspase-3 IgG多抗為Newmarker公司產品，免疫組化SP檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 生存素和Caspase-3的檢測

免疫組織化學染色采用鏈菌素親生物素-過氧化物酶（SP）法。將組織切片置60℃恒溫箱烘烤30 min后37℃過夜，分別進行免疫組織化學及蘇木素-伊紅（HE）染色。HE染色按常規進行，光鏡下觀察結果，進行病理分級、分期診斷，并與免疫組織化學結果對照觀察。SP法按試劑盒說明書進行。將已知的陽性片作為陽性對照，用PBS液代替一抗作陰性對照。

1.4 免疫組化結果判定標準

免疫組織化學結果采用二級記分法。隨機選擇5個高倍（400×）視野，根據染色陽性細胞比例和染色強度分別評分。陽性細胞比例≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。染色強度分為4級：無染色為0分，淡黃色（弱陽性）為1分，棕黃色（中等陽性）為2分，棕褐色（強陽性）為3分。根據兩者積分乘積判斷：0分為無表達（－），l～3分為可疑表達（±），4～6分為表達（＋），7～12分為強表達（＋＋）。最終統計時將0～3分合并定為近乎無表達。結果判定由2位病理科醫師獨立完成，取2人的平均值作為最終結果。

1.5 統計學處理

所有數據使用Stata 7.0統計軟件進行分析。采用χ2檢驗、秩和檢驗，兩變量之間采用Spearman相關系數檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同食管組織中生存素和Caspase-3的表達

生存素和Caspase-3的免疫組織化學陽性產物呈黃色細顆粒狀，定位于細胞質內。生存素在正常食管黏膜內無表達；在不典型增生組中25例表達陽性（29.07%）；食管癌組織中45例表達陽性（71.43%）。Caspase-3在正常食管黏膜中33例表達陽性（82.50%）；在不典型增生組中55例表達陽性（63.95%）；食管癌組織中21例表達陽性（33.33%）。從食管正常黏膜上皮→不典型增生（輕、中、重度）→食管癌組織，生存素表達逐漸升高（rs＝0.732，P＜0.01），Caspase-3表達逐漸減弱（rs＝－0.687，P＜0.05）。見圖1和表1。

2.2 生存素和Caspase-3表達與食管癌臨床病理指標的關系

食管癌低分化組與中高分化組中生存素的陽性表達率間無明顯差異（P＞0.05）；生存素在食管癌T分期間的表達亦無明顯差異（P＞0.05）。無淋巴結轉移組生存素陽性表達率低于淋巴結轉移組（χ2＝13.405，P＜0.01）；臨床分期Ⅰ＋Ⅱ期陽性表達率低于Ⅲ＋Ⅳ期（χ2＝18.115，P＜0.01）。Caspase-3在食管癌低分化組陽性表達率低于中高分化組（χ2＝11.433，P＜0.01）；T1＋T2組與T3＋T4組（χ2＝0.127，P＞0.05）、無淋巴結轉移組與淋巴結轉移組（χ2＝0.269，P＞0.05）、臨床分期Ⅰ＋Ⅱ期與Ⅲ＋Ⅳ期（χ2＝0.119，P＞0.05）之間比較，Caspase-3陽性表達率的差異無統計學意義。見表2。

圖1 生存素和Caspase-3在各組標本中的表達（SP法×400）

表1 不同食管組織中生存素和Caspae-3的陽性表達率

表2 生存素、Caspase-3表達與食管癌臨床病理指標的關系

2.3 食管癌組織中生存素、Caspase-3表達的相關性

63例食管癌組織中，13例生存素表達“＋”，其中7例Caspase-3表達“－”、5例“＋”、1例“＋＋”；32例生存素表達“＋＋”，其中30例Caspase-3表達“－”、1例“＋”、1例“＋＋”。生存素與Caspase-3兩者表達呈負相關（r＝－0.897，P＜0.01）。

3 討論

腫瘤的發生是一個多因素、多基因、多階段的過程。上皮細胞異常增生是食管癌易患人群最早期的變化，表現為基底細胞過度增生、間變和原位癌，是食管的癌前病變。在分子水平上，癌變涉及眾多原癌基因、抑癌基因以及蛋白質的改變。直接或間接抑制細胞增殖、癌變的基因，稱為抑癌基因。各種致癌因素的共同作用導致原癌基因的啟動和抑癌基因的失活，從而導致癌癥的發生。

生存素是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis，IAP）家族中相對分子質量最小的一個，具有抑制細胞凋亡與調節細胞周期兩種功能。正常情況下生存素僅表達于胚胎及分化不成熟的組織，而在成年人終末分化組織中并無表達，病理情況下會表達于大多數惡性腫瘤［1－2］，提示生存素在腫瘤的發生中可能具有重要作用。本研究中，從食管正常黏膜上皮→不典型增生（輕、中、重度）→食管癌組織，生存素表達逐漸升高（rs＝0.732，P＜0.01）。結果表明，食管在癌變過程中生存素表達上調，可能使腫瘤細胞逃避細胞周期檢測點，逃避凋亡，細胞增殖失控，導致腫瘤的形成。生存素基因的過度表達可能是食管癌發生中較早期出現的分子異常事件，可作為判斷食管癌生物學行為的一個指標。本研究中，生存素在淋巴結轉移組中的表達率明顯高于無淋巴結轉移組，臨床分期Ⅲ＋Ⅳ期組的表達率明顯高于Ⅰ＋Ⅱ期（P＜0.01），提示生存素表達與淋巴結是否轉移及臨床分期（Ⅰ＋Ⅱ期／Ⅲ＋Ⅳ期）相關［3］。這說明生存素可使食管癌惡性程度增加，侵襲力增強，使得腫瘤的擴散、轉移更易發生［4］，因此生存素可作為食管癌預后判斷的腫瘤標志物［5］。

Caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子啟動Caspase家族引起細胞凋亡的關鍵蛋白酶，是細胞凋亡的主要執行者，也是凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路。本研究中，Caspase-3的表達有從食管正常黏膜上皮→不典型增生（輕、中、重度）→食管癌組織逐漸減弱的趨勢（rs＝－0.687，P＜0.05），提示Caspase-3表達的喪失促進了食管癌的發生。Caspase-3在食管癌低分化組中的表達明顯低于中高分化組（P＜0.01）。可見，Caspase-3表達與食管癌分化程度相關。本研究同時發現，Caspase-3表達與腫瘤T分期、淋巴結轉移與否及臨床分期無關。Caspase-3蛋白在食管癌中的低表達，以及與食管癌分化程度的關系，說明Caspase-3表達的喪失有助于食管癌的形成，并且能夠預示其惡性程度，但與食管癌的浸潤、轉移能力關系不大。

已有研究發現，生存素通過抑制Caspase-3的活性，抑制細胞凋亡。其抑制機制可能為［6］①生存素直接影響Caspase-3的抗凋亡作用。②Fas和細胞增殖信號刺激生存素轉入細胞核與周期蛋白激酶CDK4結合，加快細胞由G1向S期轉換，同時抑制proCaspase-3激活，從而發揮抗凋亡作用。③Thr34位點磷酸化的生存素與Caspases結合而發揮抗凋亡作用。④生存素可與線粒體釋放的第二個線粒體衍生的半胱天冬酶激活蛋白（SMAC）結合，保護凋亡抑制蛋白（IAPs）中的X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）等，而發揮間接抑制作用。本研究結果提示，生存素可能通過抑制Caspase-3的活性，減低Caspase-3介導的細胞凋亡作用，從而導致食管癌的發生。

綜上，生存素、Caspase-3可能協同參與了食管癌的發生、發展，進一步研究兩者表達與食管癌的關系，有助于了解食管癌的生物學行為，探索有效早期診斷的方法，判斷食管癌的預后［7］，并提供靶向治療的新途徑［8］。

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［4］Chiu CW，Nozawa H，Hanahan D.Survival benefit with proapoptoticm olecular and pathologic responses from dual targeting ofmammalian targetof rapamycin and epidermal growth factor receptor in a preclinical model of pancreatic neuroendocrine carcinogenesis［J］.JClin Oncol，2010，28（29）：4425－4433.

［5］Feng YB，Lin DC，Shi ZZ，et al.Overexpression of PLKI is associated with poor survival by inhibiting apoptosis via enhancement of survivin level in esophageal squamons cell carcinoma［J］.Int JCancer，2009，2（3）：578－588.

［6］周正斌，楊大明，沈琴，等.熊去氧膽酸誘導肝癌細胞株HepG2凋亡及對Survivin、Caspase-3表達的影響［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2006，15（5）：492－496.

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Expression and significance of survivin and Caspase-3 protein in esophageal precancerosis and cancer tissue

ZHOU Zheng-bin1，ZHOU Rui1，HUANG Zhen1，CAO Peng2，CHENG Hong-wei1
（1.Department of Gastroenterology，2.Department of Pathology，Taixing People′s Hospital，Taixing Jiangsu 225400，China）

Objective：To investigate the relationship between the expression of survivin and Caspase-3 protein and the biological behaviors of esophageal precancerosis and cancer tissue.M ethods：The expressions of survivin and Caspase-3 proteins in 63 esophageal cancer specimens，86 atypical hyperplasia specimens（include light，moderate and high grade hyperplasia），and 40 normal esophagealmucous specimens，were investigated with S-P immunohistochemical technique，and their correlation with pathologic characteristic，and clinical stages of esophageal cancerwere analyzed.Results：The positive expression rate of survivin protein showed higher trend（rs＝0.732，P＜0.01），while，that of Caspase-3 protein showed lower trend（rs＝－0.687，P＜0.05），from normal esophagealmucous，to light，moderate and high grade hyperplasia，and to esophageal cancer.In esophageal cancer tissue，the expression of survivin proteinswas positively correlated with the lymph nodemetastasis and clinical stages（P＜0.01），and that of Caspase-3 protein was positively correlated with the degree of differentiation（P＜0.01）.Moreover，therewas a negative association between the survivin and Caspase-3 protein expression（r＝－0.897，P＜0.01）.Conclusion：The expression of survivin and Caspase-3 may be significantly related to the occurrence and progression of esophageal carcinoma，and helpful in predicting the biological behavior and prognosis of esophageal cancer.

esophageal cancer；precancerosis；survivin；Caspase-3；atypical hyperplasia

R730.43

A

1671－7783（2014）04－0342－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140132

周正斌（1970—），男，江蘇泰興人，副主任醫師，主要從事消化道腫瘤的臨床診治。

2014－05－19 ［編輯］陳海林