NDRG1、P21及VEGF在肺腺癌組織中的表達及臨床意義

焦霞，朱曉蔚*，蔣小芹，趙國軍，詹樹東，劉福興，戴桂紅，肖蔚，姜家寶，于鴻

（泰州市人民醫院1.病理科，2.普外科，江蘇泰州225300）

NDRG1、P21及VEGF在肺腺癌組織中的表達及臨床意義

焦霞1，朱曉蔚1*，蔣小芹1，趙國軍1，詹樹東1，劉福興1，戴桂紅1，肖蔚1，姜家寶2，于鴻1

（泰州市人民醫院1.病理科，2.普外科，江蘇泰州225300）

目的：觀察N-myc下游調節基因1（N-myc downstream regulated gene1，NDRG1）、P21及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因在肺腺癌中的表達及在肺腺癌發生、發展中的作用及意義。方法：應用免疫組織化學法檢測20例正常肺組織和94例肺腺癌組織中NDRG1、P21及VEGF蛋白的表達情況，并分析三者表達與臨床病理參數及患者預后的相關性。結果：在正常肺組織及肺腺癌組織中，NDRG1陽性率分別為90.0%（18／20）和52.1%（49／94），P21陽性率分別為80.0%（16／20）和33.0%（31／94），VEGF陽性率分別為20.0%（4／20）和53.2%（50／94），3種蛋白陽性率比較差異均具有統計學意義（P均＜0.05）。肺腺癌組織中NDRG1、P21及VEGF的表達與肺腺癌患者年齡、性別、組織分化程度及TNM分期均無相關性（P均＞0.05），而與淋巴結轉移明顯相關（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析顯示，NDRG1、P21和VEGF表達與生存明顯相關（P均＜0.01）。結論：肺腺癌組織中NDRG1和P21表達下調，而VEGF表達上調，聯合檢測三者的表達可能對判斷預后具有重要價值。

肺腺癌；N-myc下游調節基因1；P21；血管內皮生長因子

N-myc下游調節基因1（N-myc downstream regulated gene1，NDRG1）是Stanton等［1］在N-myc敲除的小鼠胚胎組織中發現的，與細胞增殖及分化密切相關，可被多種生理或病理因素誘導和調控，與多種惡性腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移及預后密切相關。近來研究發現，NDRG1在宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中表達降低或缺失，有望成為一個新的候選抑癌基因，已引起越來越多研究者的重視［2］。然而，迄今對于NDRG1在肺腺癌發生發展中的作用機制及臨床意義尚不十分明確。為此，本研究應用免疫組織化學法觀察肺腺癌組織和正常肺組織中NDRG1、P21及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，分析三者陽性表達的相關性及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2005年1月至2009年12月泰州市人民醫院胸外科手術切除肺腺癌蠟塊標本94例，男56例，女38例，年齡34～86歲，平均56歲，其中＜55歲30例，≥55歲64例；所有病例均經病理學檢查證實為腺癌，高分化16例，中分化51例，低分化27例。根據2009年國際抗癌協會制定的TNM臨床分期標準進行分期，Ⅰ期40例，Ⅱ期36例，Ⅲ期18例。伴有淋巴結轉移44例，無淋巴結轉移50例。所有病例術前均未經放療、化療。收集20例正常肺組織作為對照。

1.2 方法

免疫組織化學染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化酶復合物法（S-P法）。羊抗人NDRG1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，鼠抗人P21單克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體購自丹麥Dako公司，具體操作流程按說明書進行，以PBS替代一抗作為陰性對照。結果判斷：NDRG1蛋白陽性信號定位于細胞質或細胞膜，棕黃色顆粒為陽性表達；VEGF以細胞質內見均勻棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達；P21陽性信號定位于胞核，棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達。根據陽性細胞數和著色強度用半定量積分法判斷結果，每張切片陽性細胞數＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；著色強度：細胞不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者積分相乘，0～4分為陰性，5～12分為陽性［3－4］。

1.3 統計學處理

應用SPSS 17.0軟件進行統計分析，采用χ2檢驗分析肺腺癌組織與正常肺組織中NDRG1、P21和VEGF的表達及肺腺癌組織中三者表達與臨床病理特征之間的關系。采用Spearman相關系數計算肺腺癌組織中三者陽性率的相關性。生存分析采用Kaplan-Meier方法，Log-rank檢驗法分析生存率差異。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌組織中NDRG1、P21及VEGF的表達

正常肺組織肺泡上皮中NDRG1蛋白陽性表達率為90.0%（18／20），肺腺癌組織中NDRG1蛋白陽性表達率為52.1%（49／94）。與正常肺組織相比，肺腺癌組織中NDRG1蛋白表達明顯下調（χ2＝9.762，P＝0.002）。正常肺組織中肺泡上皮P21陽性表達率為80.0%（16／20），肺腺癌組織中P21陽性表達率為33.0%（31／94）。與正常肺組織相比，肺腺癌組織中P21表達明顯下調（χ2＝13.170，P＝0.001）。正常肺組織中VEGF陽性表達率為20.0%（4／20），肺腺癌組織中VEGF陽性表達率為53.2%（50／94）。與正常肺組織相比，肺腺癌組織中VEGF表達明顯上調（χ2＝6.017，P＝0.014）。見圖1。

2.2 NDRG1、P21及VEGF的表達與臨床病理參數的關系

肺腺癌組織中NDRG1、P21及VEGF的表達與患者年齡、性別、組織分化程度及TNM分期均無相關性（P均＞0.05），而與淋巴結轉移明顯相關（P＜0.05）。見表1。

2.3 肺腺癌組織中NDRG1、P21和VEGF表達的相關性分析

94例肺腺癌組織中，22例NDRG1與P21同時呈陽性表達，40例同時呈陰性表達；17例NDRG1與VEGF同時呈陽性表達，16例同時呈陰性表達；10例VEGF與P21同時呈陽性表達，23例同時呈陰性表達。Spearman等級相關分析顯示，NDRG1與P21在肺腺癌中的表達呈正相關（r＝0.324，P＝0.001），NDRG1與VEGF在肺腺癌中的表達呈負相關（r＝－0.296，P＝0.002），VEGF與P21在肺腺癌 中的表達呈負相關（r＝－0.294，P＝0.002）。

圖1 免疫組織化學檢測NDRG1、P21和VEGF在肺腺癌組織和正常肺組織中的表達（SP×200）

表1 NDRG1、P21及VEGF在肺腺癌中的表達及其與臨床病理參數的關系

2.4 肺腺癌組織中NDRG1、P21和VEGF表達與腫瘤預后的關系

94例肺腺癌患者中80例獲得隨訪資料，電話隨訪5年，38例患者死亡，整體5年存活率為52.5%。總平均生存時間為43.74個月，總中位生存時間為43個月。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，肺腺癌組織中NDRG1及P21表達陽性者較陰性者生存期長，而VEGF表達陽性者較陰性者生存期縮短。見圖2。

3 討論

研究發現，NDRG1在乳腺癌、宮頸癌、肝癌等組織及人乳腺癌MCF-7細胞、人結腸癌SW62細胞內表達明顯降低［5］。Fotovati等［6］報道，乳腺癌組織內NDRG1表達明顯降低，且表達水平越低癌轉移率越高、患者生存時間越短。Li等［7］將NDRG1導入高轉移性結腸癌SW620細胞系中，觀察到其體外侵襲能力及在裸鼠體內肝臟轉移能力明顯降低，提示NDRG1是一種轉移抑制基因。本實驗結果顯示，肺腺癌組織中的NDRG1表達明顯低于正常肺組織，證實NDRG1在肺腺癌組織內表達明顯減少。本研究淋巴結轉移組的NDRG1陽性表達率明顯低于無淋巴結轉移組，提示NDRG1表達減少與肺腺癌的進展及轉移有關。

圖2 NDRG1、P21、VEGF表達與患者生存時間的關系（Kap lan-M eier生存分析）

P21蛋白是目前已知的具有廣泛激酶抑制活性的細胞周期抑制蛋白，其過表達致細胞周期阻滯于G1期、G2期或S期，從而抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。Kovacevic等［8］將NDRG1基因導入人前列腺癌PC3MM細胞株和肺癌H1299細胞株，結果顯示細胞增殖及轉移能力均降低，其機制可能與NDRG1通過非P53依賴性信號通路在轉錄和轉錄后水平調節P21的表達有關。我們前期采用脂質體介導將NDRG1基因轉染人肺腺癌A549細胞株，發現該轉基因細胞P21表達也上調，細胞增殖水平明顯降低而細胞凋亡明顯增加，其機制可能與NDRG1上調A549細胞P21的表達有關［9］。VEGF是目前已知作用最強的血管內皮生長因子，主要功能是促進血管內皮細胞增殖，誘導新生血管形成，促進腫瘤細胞生長和轉移。研究顯示，體外培養的肺癌細胞、動物模型的肺癌組織及人肺癌組織中VEGF均呈高表達［10］。Hosoi等［11］報道，上調胰腺癌與肺腺癌細胞內NDRG1基因的表達，癌細胞的增殖、侵襲及轉移能力明顯降低。本實驗結果顯示，NDRG1和P21蛋白在肺腺癌中表達下調，而VEGF表達上調，NDRG1和P21陽性表達患者的淋巴結轉移率較低，NDRG1、P21和VEGF表達與患者預后明顯相關。因此，我們認為NDRG1、P21和VEGF在肺腺癌中表達的聯合檢測對判斷肺腺癌轉移及預后具有一定意義。同時，肺腺癌組織中NDRG1、P21與VEGF的表達具有相關性，提示NDRG1可能與P21、VEGF協同作用，參與肺腺癌發生和發展。

［1］Stanton BR，Perkins AS，Tessarollo L，etal.Loss of N-myc function results in embryonic lethality and failure of the epithelial component of the embryo to develop［J］.Genes Dev，1992，6（12A）：2235－2247.

［2］Fang BA，Kovacˇevic＇?，Park KC，et al.Molecular functions of the iron-regulated metastasis suppressor， NDRG1，and its potential as amolecular target for cancer therapy［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1845（1）：1－19.

［3］Tayama M，Furuhata T，Inafuku Y，et al.Vascular endothelial growth factor 165b expression in stromal cells and colorectal cancer［J］.World JGastroenterol，2011，17（44）：4867－4874.

［4］Liu S，Chang Y，Ma J，et al.Prognostic impact of p16 and p21 on gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors［J］.Oncol Lett，2013，6（6）：1641－1645.

［5］Kim A，Kim MJ，Yang Y，et al.Suppression of NF-κB activity by NDRG2 expression attenuates the invasive potential of highlymalignant tumor cells［J］.Carcinogenesis，2009，30（6）：927－936.

［6］Fotovati A，Abu-Ali S，Kage M，et al.N-myc downstream-regulated gene 1（NDRG1）a differentiation marker of human breast cancer［J］.Pathol Oncol Res，2011，17（3）：525－533.

［7］Li Q，Chen H.Transcriptional silencing of N-myc downstream-regulated gene 1（NDRG1）inmetastatic colon cancer cell line SW620［J］.Clin Exp Metastasis，2011，28（2）：127－135.

［8］Kovacevic Z，Sivagurunathan S，Mangs H，et al.The metastasis suppressor，N-myc downstream regulated gene 1（NDRG1），upregulates p21 via p53-independent mechanisms［J］.Carcinogenesis，2011，32（5）：732－740.

［9］焦霞，朱曉蔚，李順龍，等.上調NDRG1基因表達對肺腺癌細胞增殖與凋亡的影響［J］.江蘇大學學報：醫學版，2013，23（5）：402－406.

［10］Goel HL，Mercurio AM.VEGF targets the tumour cell［J］.Nat Rev Cancer，2013，13（12）：871－882.

［11］Hosoi F，Izumi H，Kawahara A，et al.N-myc downstream regulated gene1／Cap43 suppresses tumor growth and angiogenesis of pancreatic cancer through attenuation of inhibitor ofκB kinaseβexpression［J］.Cancer Res，2009，69（12）：4983－4991.

Expression of NDRG1，P21 and VEGF in lung adenocarcinoma tissue and its clinical significance

JIAO Xia1，ZHU Xiao-wei1，JIANG Xiao-qin1，ZHAO Guo-jun1，ZHAN Shu-dong1，LIU Fu-xing1，DAIGui-hong1，XIAOWei1，JIANG Jia-bao2，YU Hong1
（1.Department of Pathology，2.Department of General Surgery，Taizhou People′s Hospital，Taizhou Jiangsu 225300，China）

Objective：To observe the expression of N-myc downstream regulated gene1（NDRG1），P21 and vascular endothelial growth factor（VEGF）in lung adenocarcinoma tissue，and to elucidate themechanism of lung adenocarcinoma invasion and metastasis.M ethods：The expressions of NDRG1，P21 and VEGF were detected by immunohistochemistry in 20 cases of normal lung tissue and in 94 cases of lung adenocarcinoma tissue.The correlation among NDRG1，P21 and VEGF expressions in lung adenocarcinoma tissue was investigated by Spearman rank correlation analysis.The relationship between NDRG1 expression and clinicopathological characteristics was investigated by Kaplan-Meier survival curve analysis.Results：In normal lung tissue and lung adenocarcinoma tissue，the positive immunoreactivity rate of NDRG1 was 90.0%（18／20）and 52.1%（49／94），respectively；P21 was 80.0%（16／20）and 33.0%（31／94），respectively；VEGF was 20.0%（4／20）and 53.2%（50／94），respectively.The expressions of NDRG1 and P21 was negatively correlated with lymphaticmetastasis，while the expression of VEGFwas positively correlated with lymphatic metastasis.Univariate survival analysis indicated that the expressions of NDRG1，P21 and VEGF were associated with patient survival.Conclusion：The expressions of NDRG1 and P21 in lung adenocarcinoma tissuewere down-regulated while VEGF expression was up-regulated.The joint detection of NDRG1，P21 and VEGFmight provide some guiding significance to judge the prognosis of lung adenocarcinoma.

book=347,ebook=76

lung adenocarcinoma；N-myc downstream regulated gene 1；P21；vascular endothelial growth factor

R734.2

A

1671－7783（2014）04－0346－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140102

江蘇省六大人才基金資助項目（2011-WS-023）；泰州市人民醫院重大科研資助項目（201008）

焦霞（1979—），女，江蘇泰州人，主治醫師，碩士，主要從事肺腫瘤研究；肖蔚（通訊作者），教授，主任醫師，E-mail：yuhongmiaomiao＠163.com

*：共同第一作者

2014－04－15 ［編輯］劉星星