臍帶間質干細胞來源的外切體對順鉑誘導的人腎小管上皮細胞損傷的修復作用

蔣留留，賈浩源，祝源，尹磊，李里明，葉惠慧，薛建國，許文榮，錢暉

（江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013）

臍帶間質干細胞來源的外切體對順鉑誘導的人腎小管上皮細胞損傷的修復作用

蔣留留，賈浩源，祝源，尹磊，李里明，葉惠慧，薛建國，許文榮，錢暉

（江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013）

目的：研究人臍帶間質干細胞來源的外切體（hucMSC-Ex）對順鉑誘導的人腎小管上皮HK-2細胞損傷的修復作用，并探討可能的作用機制。方法：體外建立順鉑誘導的HK-2細胞損傷模型，實驗組以16μmol／L濃度的順鉑作用HK-2細胞16 h，再加入hucMSC-Ex共培養，同時選擇人肺成纖維細胞的外切體（HFL1-Ex）為對照，8 h后采用蛋白質印跡法和FITC-Tunel技術檢測hucMSC-Ex對損傷HK-2細胞的抗凋亡和促增殖情況。未經任何處理的HK-2細胞作為正常對照組，單純順鉑損傷并加等量PBS為PBS對照組。結果：成功建立了順鉑誘導的HK-2細胞損傷體外模型，蛋白質印跡分析顯示hucMSC-Ex處理改善了順鉑對HK-2細胞的損傷，凋亡蛋白Bax表達降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達相應升高。FITC-Tunel檢測也顯示HK-2細胞的凋亡明顯減弱。而MTT分析顯示hucMSC-Ex處理后，HK-2細胞的增殖能力顯著增強。結論：HucMSC-Ex對順鉑誘導的HK-2細胞損傷有一定的修復效果，可能是通過促進HK-2細胞的增殖和抑制其凋亡來實現的。

外切體；順鉑；人腎小管上皮細胞；增殖；凋亡

外切體（exosome）是一種可由多種細胞分泌的直徑40～100 nm的膜性小囊泡，是細胞與細胞，器官與器官之間信息傳遞的重要載體［1］。近年來間質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）分泌的外切體（MSC-Ex）成為組織再生修復的新研究熱點［2］。多個研究證實MSC-Ex在腎［3］、心［4］、神經［5］、肺［6］等損傷中具有明確的修復作用。本課題組前期研究也揭示臍帶MSC來源的外切體（hucMSC-Ex）可減緩CCL4誘導的小鼠肝纖維化并促進其肝功能恢復［7］，對順鉑誘導的急性腎損傷大鼠模型也有明顯的修復效果［8］。本研究在前期工作的基礎上，構建順鉑誘導的人腎近曲小管上皮細胞HK-2損傷模型，探討hucMSC-Ex對損傷腎小管上皮細胞的修復作用，并進一步探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人近曲小管上皮細胞HK-2（美國菌種保存中心），人肺成纖維細胞HFL-1（中國科學院典藏培養物保藏委員會細胞庫）。順鉑（中國德州制藥有限公司），胎牛血清（美國Gibco公司），DMEM／F-12培養基（HyClone，美國Thermol Fisher公司）；兔抗人Bax（美國Bioworld公司），兔抗人Bcl-2（美國Bioworld公司），抗GAPDH鼠單克隆抗體（北京康為世紀公司），Tunel-FITC試劑盒（美國Vazyme公司），DAPI（瑞士Roche公司）。倒置熒光顯微鏡（Ti-S，日本Nikon公司），高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），高內涵成像系統（美國Molecular Devices公司）。CO2培養箱（美國Thermo公司），超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），全自動滅菌鍋（日本Tomy公司），超低溫冰箱（美國Forma公司），凝膠成像分析系統（ImageQuantLAS4000mini，美國GE公司），熒光酶標儀（FLX800TM，美國Bio-Tek公司）。

1.2 方法

1.2.1 外切體的分離鑒定 收集本實驗室原代培養的人臍帶間質干細胞的無血清培養上清，采用改進的超濾及梯度離心法分離并純化培養上清中的外切體。以人肺成纖維細胞HFL-1為細胞對照，同樣收集培養上清并分離外切體。分離的外切體經電鏡表面標記分析鑒定［7－8］。

1.2.2 順鉑損傷HK-2細胞模型的構建及hucMSCEx處理 HK-2細胞在含10%胎牛血清的DMEM／F-12培養基37℃5%CO2培養箱中培養，每2天換液1次，消化傳代后種于6孔培養板，每孔50 000個細胞。常規培養24 h后，進行實驗分組。①正常對照組：未經任何處理的HK-2細胞；②順鉑＋PBS組：16μmol／L順鉑作用HK-2細胞16 h，撤去藥物加入20μL PBS（作為hucMSC-Ex同體積對照）再培養8 h；③順鉑＋hucMSC-Ex組：16μmol／L順鉑處理16 h，撤去藥物再加入hucMSC-Ex（100μg／mL，20μL）共培養8 h；④順鉑＋HFL1-Ex組：順鉑處理16 h后，撤藥加入HFL1-Ex（100μg／mL，20μL）8 h。

1.2.3 蛋白質印跡法檢測Bax、Bcl-2蛋白 胰酶消化上述各組的HK-2細胞，離心收集后加入細胞組織裂解液充分裂解，然后加入1／4體積的5×SDS上樣緩沖液于蛋白裂解上清液中，沸水煮10 min。聚丙烯酰胺電泳，每孔上樣等量的總蛋白。分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）和GAPDH（1∶5 000）抗體稀釋液，4℃過夜。TBS／0.5% Tween20洗膜3次后，再加入1∶5 000抗HRP抗體稀釋液37℃孵育1 h，TBS、0.5%Tween20充分洗膜3次后，預混HRP化學發光底物（Luminata crescendo western HRP substrate）凝膠成像分析。

1.2.4 Tunel-FITC檢測細胞的凋亡率 收集對數期的HK-2細胞，調整懸液密度，每200μL營養液中含4 000個細胞，種植于96孔板上。常規培養24 h后，各組分別加入順鉑16μmol／L誘導處理16 h，撤除藥物與hucMSC-Ex共培養8 h。按照FITCTunel試劑盒說明書進行下一步實驗。最后以DAPI避光染細胞核10 min，使用高內涵成像系統進行細胞凋亡率檢測。

1.2.5 MTT法測定細胞增殖 實驗前期處理同FITC-Tunel法，每組設置5個重復孔。到達作用時間后，每孔加MTT溶液（5 mg／mL，用PBS配制，pH＝7.4）20μL。繼續避光孵育2 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加100μL DMSO，脫色搖床振蕩10 min，使結晶物質充分融解。選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔的光密度值，記錄結果。

1.3 數據處理與統計

實驗數據采用Graphpad Prism 5軟件進行統計分析，正態分布數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HK-2細胞順鉑誘導前后的形態學變化

常規培養的HK-2細胞形態為鵝卵石狀的上皮樣細胞，經順鉑誘導16 h后，鏡下觀察細胞形態由卵圓形變為梭形或不規則形，胞質內顆粒增多，并伴有較明顯的空泡形成。見圖1。

2.2 HucMSC-Ex降低了細胞凋亡蛋白的表達

蛋白質印跡結果顯示，hucMSC-Ex處理8 h后，順鉑誘導損傷的HK-2細胞Bax的表達下調（P＜0.001），而Bcl-2表達上調（P＜0.01），在一定程度上減緩了順鉑所導致的細胞損傷。見圖2。

圖1 順鉑處理前后HK-2細胞形態變化（×100）

圖2 HucMSC-Ex處理后HK-2細胞凋亡蛋白的表達

此外，FITC-Tunel檢測后通過高內涵成像系統分析發現，和正常對照組相比，順鉑＋PBS組綠色熒光強度明顯增加（P＜0.001），而經hucMSC-Ex處理8 h后，其綠色熒光強度顯著下降（P＜0.01）。見圖3、圖4。結果說明husMSC-Ex可明顯提高HK-2細胞的凋亡率。

圖3 Tunel-FITC檢測細胞凋亡結果

圖4 HucM SC-Ex處理后HK-2細胞的凋亡率

2.3 hucMSC-Ex處理后HK-2細胞增殖結果

熒光酶標儀檢測發現，順鉑處理后，HK-2細胞增殖能力下降（P＜0.01）。而經hucMSC-Ex處理8 h后，細胞增殖能力則明顯增強（P＜0.05）。見圖5。

圖5 HucM SC-Ex處理后HK-2細胞的增殖能力

3 討論

順鉑的抗癌效果因不良反應而受限，有1／3患者表現為腎毒性或急性腎損傷。本研究觀察hucMSCEx對順鉑誘導的人源腎上皮細胞損傷的修復作用。通過預實驗，確定以16μmol／L順鉑處理HK-2細胞，結果發現細胞形態由橢圓形變為梭形；凋亡蛋白Bax的表達呈上調狀態，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達和細胞增殖能力均下降。加入hucMSC-Ex后，HK-2細胞增殖能力和凋亡率發生了逆轉，相對于損傷對照組，細胞增殖能力明顯增強，細胞凋亡顯著減弱。

外切體是由細胞分泌的并帶有細胞表面抗原的囊性小泡［1］，小泡中包含大量的蛋白質、脂類和RNA等生物活性物質［5］，能與靶細胞特異性融合并將其包含的大量生物因子直接轉移入細胞內部，更直接有效地作用于細胞，在細胞間信息傳遞方面發揮重要作用［1，9－10］。本研究的結果顯示，hucMSC-Ex通過抗凋亡和促增殖發揮了對順鉑誘導的HK-2細胞損傷的修復作用。然而，hucMSC-Ex中何種生物活性成分發揮作用，又是如何作用的確切機制還有待闡明。也有研究提示，外切體可能通過轉運miRNAs修復受損細胞［5］，這為我們進一步的研究提供了思路與借鑒。總之，hucMSC來源的外切體可減緩順鉑誘導的HK-2細胞損傷。本研究結果為臨床應用hucMSC-Ex治療腎損傷提供了新的實驗依據。

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Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells repair cisplatin induced human renal proximal tubular epithelial cells injury

JIANG Liu-liu，JIAHao-yuan，ZHU Yuan，YIN Lei，LILi-ming，YE Hui-hui，XUE Jian-guo，XUWen-rong，QIAN Hui
（School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the effects of exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells（hucMSCs-Ex）on cisplatin induced injury in human renal proximal tubular epithelial（HK-2）cells.M ethods：HK-2 cells injury were induced with cisplatin at a concentration of 16μmol／L for 16 h.Then injured HK-2 cellswere co-cultured with hucMSC-Ex for another 8 h.The apoptosis and proliferation of HK-2 cellswere tested byWestern blot，and FITC-Tunel assay and MTT respectively.At the same time，healthy HK-2 cells and injured HK-2 cells co-cultured with human lung fibroblasts-derived exosomes（HFL1-Ex）and PBSwere used as control.Results：Cisplatin-induced HK-2 injury was confirmed in vitro.Western blot results showed thatexpression of pro-apoptosis protein Bax was decreased and anti-apoptotic protein Bcl-2 was increased accordingly.FITC-Tunel results also showed HK-2 cells apoptosiswas reduced obviously in hucMSCs-Ex group.Furthermore，the MTT assay indicated that hucMSCs-Ex treatment promoted the proliferation of HK-2 cell.Conclusion：hucMSCs-Ex could alleviate cisplatin-induced HK-2 cell injury via promoting cell proliferation and inhibiting apoptosis.

exosomes；cisplatin；human renal proximal tubular epithelial（HK-2）cells；prolification；apoptosis

蔣留留（1987—），男，碩士研究生；錢暉（通訊作者），教授，博士生導師，博士生導師，E-mail：lstmmmlst＠163.com

R692.6

A

1671－7783（2014）04－0294－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140088

國家自然科學基金資助項目（81272481，31340040）；江蘇省高校優秀科技創新團隊項目［蘇教科（2013）10號］；江蘇省醫學領軍人才與創新團隊項目（LJ201117）

2014－04－03 ［編輯］何承志