內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理對丙烯腈氧化性損傷的保護作用

方云濤，張盼盼，趙文君，王蘇華，邢光偉，馬靜，陸榮柱

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生檢驗系，江蘇鎮(zhèn)江212013）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理對丙烯腈氧化性損傷的保護作用

方云濤，張盼盼，趙文君，王蘇華，邢光偉，馬靜，陸榮柱

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生檢驗系，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑2-脫氧葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）預(yù)處理探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對丙烯腈氧化性損傷的保護效應(yīng)及其作用機制。方法：將36只SD雄性大鼠隨機分為6組，即空白組、2-DG組、50 mg／kg丙烯腈組、75 mg／kg丙烯腈組、2-DG＋50 mg／kg丙烯腈組、2-DG＋75 mg／kg丙烯腈組。采取腹腔注射的方式給予2-DG預(yù)處理和急性丙烯腈染毒，空白組注射生理鹽水。2-DG預(yù)處理為100 mg／kg每天定時腹腔注射1次，持續(xù)1周，隨后丙烯腈染毒；丙烯腈組腹腔注射丙烯腈（質(zhì)量濃度為50、75 mg／kg）1 h后麻醉大鼠并斷頭處死，迅速在冰上分離腦和肝，利用蛋白印跡法檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein，Grp78）的表達，同時測定肝臟和大腦中丙二醛、還原性谷胱甘肽（GSH）含量和SOD活性。結(jié)果：與空白組比較，2-DG對大鼠肝臟和大腦中Grp78的表達具有明顯的誘導(dǎo)作用（P＜0.05），丙烯腈染毒明顯增加大鼠肝臟和大腦中丙二醛含量（P＜0.05），但卻明顯降低GSH含量和SOD活性（P＜0.05）。經(jīng)2-DG預(yù)處理后丙烯腈染毒大鼠肝、腦中的丙二醛含量增加幅度減小，且GSH含量和SOD活性的降低也有所緩解。結(jié)論：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)能拮抗丙烯腈誘導(dǎo)的氧化性損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；2-脫氧葡萄糖；丙烯腈；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78

丙烯腈是一種重要的有機化工原料，是生產(chǎn)腈綸纖維、塑料和樹脂等化工產(chǎn)品的重要原料［1］。但是丙烯腈也具有毒性，作用類似于氫氰酸，屬于高毒腈類有機化合物，會損害神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)與呼吸循環(huán)系統(tǒng)，并且具有致癌性［2－3］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress）是指細胞內(nèi)蛋白質(zhì)加工運輸或鈣穩(wěn)態(tài)失衡，生理功能紊亂的病理過程。當(dāng)細胞穩(wěn)態(tài)被破壞時，發(fā)生錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，鈣離子外流，蛋白質(zhì)糖基化被抑制，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運被阻斷，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［4］。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細胞為適應(yīng)環(huán)境壓力而進行自我保護的重要手段。已有研究發(fā)現(xiàn)，適度上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達能夠保護外源性化學(xué)物所致的神經(jīng)、肝臟以及腎臟的損傷，因而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能成為保護內(nèi)源性細胞的重要手段［5］。為此，在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究采用2-脫氧葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并觀察這種預(yù)誘導(dǎo)對丙烯腈急性氧化性毒性的拮抗效應(yīng)，為丙烯腈中毒的治療與預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

Bio-Rad垂直電泳系統(tǒng)、臺式冷凍離心機（美國Beckman公司）；722可見分光光度計（上海新茂儀器有限公司）；丙二醛試劑盒、還原性谷胱甘肽（GSH）試劑盒以及超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；總蛋白抽提試劑盒購于上海康成生物工程有限公司；2-DG（美國Sigma公司），兔抗大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucoseregulated protein，Grp78）抗體（美國Cell Signaling Technology公司），HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（美國Santa Cruz公司）。

1.2 實驗分組及處理

36只雄性SD大鼠，購自江蘇大學(xué)實驗動物中心，體質(zhì)量180～220 g，分為空白組、2-DG組、50 mg／kg丙烯腈組，75 mg／kg丙烯腈組、2-DG＋50 mg／kg丙烯腈組，2-DG＋75 mg／kg丙烯腈組。

空白組：腹腔注射生理鹽水。2-DG組：按體質(zhì)量腹腔注射2-DG（100 mg／kg），每24 h 1次，持續(xù)1周；最后一次給藥8 h后麻醉斷頭處死大鼠，迅速在冰上分離腦和肝儲存?zhèn)溆谩１╇娼M腹腔注射丙烯腈（質(zhì)量濃度為50、75 mg／kg）并在1 h后麻醉斷頭處死，迅速在冰上分離腦和肝，儲存待用。2-DG＋丙烯腈組：每天腹腔注射2-DG 1次，持續(xù)給藥1周，最后一次給藥8 h后予丙烯腈染毒1 h。后續(xù)步驟同其他組。

1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白Grp78的檢測

稱取－80℃保存的肝、腦組織各100 mg，加入預(yù)冷組織蛋白裂解液（每1 mL蛋白質(zhì)裂解液中加入5μL蛋白酶抑制劑，5μL PMSF和5μL磷酸酶），在組織勻漿器中研磨，勻漿均勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4℃，12 000×g離心15 min，取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，每管約200μL，取少量利用BCA試劑盒進行蛋白定量，隨后加入蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液，煮沸10 min，儲存于－80℃?zhèn)溆谩２捎玫鞍踪|(zhì)印跡法檢測肝、腦組織中Grp78的表達情況。

1.4 大鼠大腦和肝臟中丙二醛含量的檢測

采用硫代巴比妥酸（TBA）法，取0.2 mL組織勻漿上清液，按照丙二醛測試盒說明書要求，加入試劑，快速混勻器混勻，95℃水浴60 min，流水冷卻，3 500 r／min離心10 min，取上清液，波長532 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測定各管光密度值，通過標(biāo)準(zhǔn)計算公式求出TBA反應(yīng)產(chǎn)物（TBARS）的含量。結(jié)果以組織勻漿液每mg蛋白中TBARS的nmol數(shù)表示。

1.5 大鼠大腦和肝臟中GSH含量的檢測

采用5-硫代2-硝基苯甲酸比色法（DTNB）檢測大鼠腦組織和肝組織GSH含量。在10%組織勻漿中，加入5%三氯乙酸，2 000 r／min離心20 min，取上清液。按照GSH試劑盒要求，加入試劑，快速混勻器混勻，在波長420 nm，1 cm光徑下，蒸餾水調(diào)零，測定各管光密度值，結(jié)果以每mg蛋白中GSH的nmol數(shù)表示。

1.6 檢測大鼠大腦和肝臟中的SOD活性

黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（O2－）可氧化羥胺形成亞硝酸鹽，后者在顯色劑作用下生成紫紅色的產(chǎn)物，樣品中含有的SOD對O2－有專一的抑制作用，從而使亞硝酸鹽的形成減少，通過測定樣品管與對照管的光密度值，計算被測樣品的SOD活性。在波長500 nm，1 cm光徑下檢測光密度值，結(jié)果以每mg蛋白的SOD活性為單位表示。實驗試劑及配制，操作步驟，以及實驗數(shù)據(jù)的處理方法參見南京建成科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒說明書。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進行單因素方差分析及兩兩比較的q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2-DG誘導(dǎo)大鼠肝臟Grp78表達

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，2-DG誘導(dǎo)了大鼠體內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生（圖1，圖2）。在100 mg／kg 2-DG預(yù)處理時，大鼠肝臟區(qū)域Grp78的表達明顯上升（P＜0.05）。而大腦中Grp78的表達亦顯示上升趨勢，但與對照組比較，差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 2-DG對丙烯腈染毒大鼠肝、腦組織丙二醛含量的影響

圖1 2-DG及不同劑量丙烯腈對大鼠肝臟Grp78表達的影響

圖2 2-DG及不同劑量丙烯腈對大鼠腦組織Grp78表達的影響

與空白組比較，丙烯腈染毒導(dǎo)致腦組織和肝組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛含量明顯升高（P＜0.05），以腦組織中增加更明顯（P＜0.05），并且隨著丙烯腈濃度的增大丙二醛含量也隨之增加。與相應(yīng)的丙烯腈組比較，2-DG＋丙烯腈組的丙二醛含量均有所下降，但只有2-DG＋50mg／kg丙烯腈組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 2-DG預(yù)處理對丙烯腈染毒大鼠腦和肝臟丙二醛含量的影響

2.3 2-DG預(yù)處理對丙烯腈染毒大鼠肝、腦組織GSH含量的影響

單獨2-DG處理肝和腦組織對GSH含量基本沒有影響，丙烯腈處理組肝組織和腦組織中GSH含量較空白組明顯下降（P＜0.05），且肝臟GSH下降較腦組織更明顯。2-DG＋50 mg／kg丙烯腈和2-DG＋75 mg／kg丙烯腈組腦組織中GSH含量較丙烯腈組明顯增加（P＜0.05），而肝組織中2-DG＋75 mg／kg丙烯腈組GSH含量的增加具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

2.4 2-DG對丙烯腈染毒大鼠肝、腦中SOD活性的影響

與對照組比較，丙烯腈染毒組腦組織和肝組織中SOD活性有所下降。其中，75 mg／kg丙烯腈組SOD活性下降具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），50 mg／kg組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對應(yīng)的丙烯腈組比較，2-DG＋50 mg／kg丙烯腈處理組和2-DG＋75 mg／kg丙烯腈處理組的SOD活性均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖4 2-DG預(yù)處理對丙烯腈染毒大鼠腦和肝臟中GSH含量的影響

圖5 2-DG預(yù)處理對丙烯腈染毒大鼠腦和肝臟中SOD活性的影響

3 討論

丙烯腈的毒性主要與其在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的CN－有關(guān)，中毒癥狀與無機氰化物類似，主要作用于細胞線粒體呼吸鏈，CN－抑制細胞色素C氧化酶，中斷呼吸鏈中電子的傳遞，使生物氧化過程完全中止，誘發(fā)細胞內(nèi)窒息導(dǎo)致細胞死亡［6－7］。

慢性丙烯腈中毒可出現(xiàn)頭痛，頭暈，乏力，失眠多夢等癥狀，還具有一定的致癌性［3］。長期的致癌實驗結(jié)果顯示，通過飲水、灌胃、吸入等方式進行染毒，均會誘導(dǎo)大鼠發(fā)生不同類型的腫瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤與丙烯腈的相關(guān)性更為明顯［8－9］。作為一種劇毒性有機氰，丙烯腈的主要靶器官為中樞神經(jīng)系統(tǒng)，急性丙烯腈中毒時，中樞神經(jīng)系統(tǒng)最早出現(xiàn)癥狀，且癥狀最為突出。大鼠急性染毒主要表現(xiàn)為流涎、多汗等膽堿能神經(jīng)興奮癥狀，隨后出現(xiàn)抽搐、呼吸衰竭，最終死亡［10］。丙烯腈急性中毒后也會引起人體肌力及肌張力減弱、感覺障礙、原始反射減退等周圍神經(jīng)損害癥狀，還會導(dǎo)致消化系統(tǒng)和呼吸循環(huán)系統(tǒng)異常［11］。對職業(yè)人群進行的流行病學(xué)調(diào)查也證實丙烯腈可引起疲勞、記憶力減退等精神神經(jīng)癥狀［12］。雖然對丙烯腈的毒性機制已經(jīng)研究得越來越深入，但其確切機制仍未明了。有研究提示，缺氧、低糖、化學(xué)毒物等應(yīng)激信號可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯誤折疊蛋白增多，誘發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）［13］。最近相繼有研究提示，激發(fā)細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是提高細胞適應(yīng)能力和進行細胞保護的重要手段，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達能夠保護外源性化學(xué)物質(zhì)所致的神經(jīng)、肝臟以及腎臟的損傷［13］。這些結(jié)果提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)可提高細胞活力，拮抗體內(nèi)外有害因素的損害。

Grp78也稱為重鏈結(jié)合蛋白，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的中心調(diào)節(jié)者。由于其在蛋白質(zhì)折疊、聚集、促進非折疊蛋白降解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2＋調(diào)節(jié)和控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜感受器的激活等過程中具有重要作用，因此Grp78的誘導(dǎo)被廣泛用作內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR啟動的生物標(biāo)記［12］。本研究結(jié)果顯示，大鼠腹腔注射2-DG可誘導(dǎo)腦、肝臟細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，Grp78表達明顯增強可啟動UPR；UPR既是細胞抵抗應(yīng)激保護自身，也是應(yīng)激損傷細胞恢復(fù)自身功能的重要機制。本實驗通過動物模型進行2-DG預(yù)誘導(dǎo)來探討激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路對丙烯腈毒性的作用，結(jié)果證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑2-DG誘導(dǎo)了大鼠肝臟和腦中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，從而保護了丙烯腈誘導(dǎo)的氧化性損傷。

GSH是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的三肽，參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)及糖代謝，使人體獲得高能量［13］。作為細胞內(nèi)一種重要的代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)，GSH能激活多種酶，從而促進糖類、脂肪及蛋白質(zhì)代謝，并能影響細胞的代謝過程。GSH還能參與體內(nèi)氧化還原過程，與過氧化物及自由基結(jié)合以對抗氧化劑對巰基的破壞，保護細胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)和含巰基酶不被破壞。因此，GSH也是機體內(nèi)一種重要的非酶類抗氧化劑［14］。本實驗發(fā)現(xiàn)丙烯腈處理組腦組織GSH含量明顯下降，可能由于線粒體遭破壞，生成的GSH減少，或者是由于丙烯腈誘導(dǎo)產(chǎn)生過多的自由基導(dǎo)致GSH耗竭。本實驗結(jié)果顯示大鼠經(jīng)丙烯腈急性染毒后，肝臟和腦組織中SOD活性明顯降低，丙二醛生成明顯增多，說明在本實驗條件下丙烯腈（50，75 mg／kg）會誘發(fā)神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激損傷的產(chǎn)生。2-DG預(yù)處理上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后可明顯抑制丙烯腈誘導(dǎo)的丙二醛含量的生成、GSH的消耗和SOD活性的降低，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激具有拮抗丙烯腈氧化毒性的作用。無論在大鼠腦組織還是肝組織，2-DG都能減輕丙烯腈誘導(dǎo)的氧化性損傷，證實氧化應(yīng)激是丙烯腈神經(jīng)毒性的一個重要機制。本研究利用2-DG預(yù)處理證明其可通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)減輕丙烯腈毒性，為丙烯腈中毒的防治提供了新的線索和救治途徑。

［1］AN Group.About acrylonitrile［EB／OL］.http：／／www.angroup.org／about／index.cfm

［2］Al-Abbasi FA.Acrylonitrile-induced gastric toxicity in rats：the role of xanthine oxidase［J］.Med Sci Monit，2012，18（6）：BR208-214.

［3］Whysner J，Steward RE 3rd，Chen D，et al.Formation of 8-oxodeoxyguanosine in brain DNA of rats exposed to acrylonitrile［J］.Arch Toxicol，1998，72（7）：429－438.

［4］Cao SS，Kaufman RJ.Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress in cell fate decision and human disease［J］.Antioxid Redox Signal，2014.［Epub ahead of print］

［5］Mei Y，Thompson MD，Cohen RA，etal.Endoplasmic reticulum stress and related pathological processes［J］.J Pharmacol Biomed Anal，2013，1（2）：1000107.

［6］陸榮柱，金復(fù)生，陳自強.丙烯腈的神經(jīng)毒性研究概況［J］.中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2002，20（1）：73－75.

［7］Caito SW，Yu Y，Aschner M.Differential inflammatory response to acrylonitrile in rat primary astrocytes andmicroglia［J］.Neurotoxicology，2014，42：1－7.

［8］Tong Z，Huailan Z，Hongjun J.Chronic toxicity ofacrylonitrile and acetonitrile to Daphnia magna in 14-d and 21-d toxicity tests［J］.Bull Environ Contam Toxicol，1996，57（4）：655－659.

［9］Johannsen FR，Levinskas GJ.Chronic toxicity and oncogenic dose response effects of lifetime oral acrylonitrile exposure to Fischer 344 rats［J］.Toxicol Lett，2002，132（3）：221－247.

［10］Ghanayem BI，F(xiàn)arooqui MY，Elshabrawy O，et al.Assessment of the acute acrylonitrile-induced neurotoxicity in rats［J］.Neurotoxicol Teratol，1991，13（5）：499－502.

［11］Blair A，Stewart PA，Zaebst DD，et al.Mortality of industrial workers exposed to acrylonitrile［J］.Scand J Work Environ Health，1998，24（Suppl2）：25－41.

［12］Sch?nthal AH.Endoplasmic reticulum stress：its role in disease and novel prospects for therapy［J］.Scientifica（Cairo），2012，2012：857516.

［13］Kitamura M.The unfolded protein response triggered by environmental factors［J］.Semin Immunopathol，2013，35（3）：259－275.

［14］Yu ZF，Luo H，F(xiàn)u W，et al.The endoplasmic reticulum stress-responsive protein GRP78 protects neurons againstexcitotoxicity and apoptosis：suppression of oxidative stress and stabilization of calcium homeostasis［J］.Exp Neurol，1999，155（2）：302－314.

Effects of endoplasm ic reticulum stress pretreatment on oxidative toxicity of acrylonitrile in rats

FANGYun-tao，ZHANGPan-pan，ZHAOWen-jun，WANGSu-hua，XINGGuang-wei，MA Jing，LU Rong-zhu
（Department of Public Health Laboratory Sciences，School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To explore the effects of pretreatment of endoplasmic reticulum stress on oxidative toxicity of acrylonitrile in rats.M ethods：Thirty-six SD rats were randomly divided into six groups as follows：blank control group，2-DG alone treated group，two acrylonitrile treated groups，2-DG pretreated and acrylonitrile treated groups.The animalswere intraperitoneally injected daily with 2-DG at the dosage of100 mg／kg for1 week，then ratswere intraperitoneally injected with acrylonitrile（50，75 mg／kg），and they were decapitated 1 h after the lastadministration of acrylonitrile or normal saline.The brain and liver tissueswere immediately dissected out and weighted on ice.The expression of glucose-regulated protein-78（Grp78）was determined by Western blotting.Oxidative toxicity of acrylonitrile was assessed by the reduced glutathione levels（GSH），products of lipid peroxidation（MDA），and superoxide dismutase（SOD）activity in the brain and liver.Results：Levels of protein expression of Grp78 increased after pretreatmentwith 2-DG compared with thatof control group（P＜0.05）.A significant increase in levels ofMDA was observed in the acrylonitrile-treated group both in the brain and liver compared with the control group（P＜0.05）.These increaseswere accompanied by a significant decrease in GSH contentand a significant reduction in SOD activity in the same tissues（P＜0.05）.However，when rats were pretreated with 2-DG，increase of MDA and decrease of GSH contents and SOD activity was significantly attenuated both in liver and brain，compared with acrylonitrile administration alone.Conclusion：Pretreatment with 2-DG reversed the acrylonitrile-induced effects by reducing the levels of MDA and enhancing SOD activity and increasing GSH content bothin the brain and liver.

endoplasmic reticulum stress；2-dexoxy-D-glucose；acrylonitrile；glucose-regulated protein 78

TQ086.5

A

1671－7783（2014）04－0302－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140112

國家自然科學(xué)基金資助項目（30872139；81273124）

方云濤（1988—），男，碩士研究生；陸榮柱（通訊作者），博士，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：lurz＠m(xù)ail.ujs.edu.cn

2014－04－29 ［編輯］陳海林