肝癌患者血漿PEDF和VEGF表達水平及其 與預后關系的探討

朱莉麗，楊凱，劉亞

論著·臨床

肝癌患者血漿PEDF和VEGF表達水平及其 與預后關系的探討

朱莉麗，楊凱，劉亞

目的觀察肝癌患者血漿色素上皮衍生因子(PEDF)及血管內皮生長因子(VEGF)表達水平并探討其與預后的關系。方法采用ELISA法檢測肝癌患者43例(肝癌組)、肝臟良性疾病患者20例(良性肝病組)及健康對照者20例(健康對照組)血漿PEDF和VEGF水平；肝癌患者平均隨訪(12.02±0.23)個月，記錄短期主要不良終點事件(SMAE)發(fā)生情況。結果血漿PEDF水平肝癌組較良性肝病組及健康對照組明顯降低(P<0.01)，VEGF水平明顯升高(P<0.01)，而良性肝病組與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。肝癌患者隨訪結束后，高PEDF/VEGF比值(≥3)亞組22例發(fā)生SMAE 3例(13.64%)，低PEDF/VEGF比值(<3)亞組21例發(fā)生SMAE 7例(33.33%)，Kaplan-Meier生存曲線顯示2組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.039)。另外，與未發(fā)生SMAE的肝癌患者(33例)比較，發(fā)生SMAE者(10例)有更低的PEDF/VEGF比值(2.14±0.76 vs. 3.49±1.12,P<0.01)。結論PEDF和VEGF參與肝癌的病理生理過程，低表達的PEDF及高表達的VEGF反映肝癌發(fā)生、發(fā)展及轉移情況，兩者比值可能成為預測肝癌轉移及預后的有效指標。

肝癌；色素上皮衍生因子；血管內皮生長因子；預后；關系

肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的惡性實體腫瘤之一[1]，新生血管形成是其發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中極為關鍵的步驟[2]。當腫瘤生長至1 mm3以上時即需要腫瘤內血管生成，否則腫瘤靜止于休眠狀態(tài)而不會發(fā)生轉移，一旦進入血管生長期腫瘤的轉移潛能即迅速出現[3]。在眾多血管新生調控因子中，色素上皮衍生因子(PEDF)與血管內皮生長因子(VEGF)發(fā)揮重要作用。PEDF抑制VEGF引起的血管內皮細胞遷移，選擇性地抑制新生血管的形成，具有很強的抗血管生成作用[4，5]。因此，本研究應用ELISA法檢測肝癌、良性肝臟疾病及健康對照3組人群血漿PEDF及VEGF水平，探討其與肝癌侵襲轉移及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年5月—2013年5月診治的肝癌患者43例，均符合肝癌診斷標準[6]，根據臨床癥狀、體征、超聲或CT檢查及腫瘤標記物等生化指標確診，作為肝癌組，其中男29例，女14例；年齡26～68(57.3±8.7)歲；鱗癌21例，腺癌11例，腺鱗癌6例，小細胞肺癌5例；病程1～4(2.2±1.0)年，不伴有其他系統(tǒng)腫瘤。入選同期我院診治的良性肝臟疾病患者20例為良性肝病組，其中男14例，女6例，年齡25～66(55.8±9.2)歲；慢性肝炎18例，肝硬化13例，肝囊腫9例。另外，隨機選擇同期健康查體者20例作為健康對照組，男16例，女4例；年齡24～61(49.7±10.5)歲，排除可能引起血漿PEDF改變的其他疾病，如其他系統(tǒng)腫瘤、糖尿病視網膜病、酒精性肝病、銀屑病等。3組研究對象性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)，具有可比性。試驗過程中血標本采集經醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 血漿PEDF和VEGF含量檢測 (1)血漿標本采集： 3組研究對象分別于清晨空腹抽取肘靜脈血4 ml(EDTA抗凝)，以3 000 r/min離心15 min，微量移液器取上清，-80℃保存待測。(2)PEDF與VEGF檢測：血漿PEDF和VEGF含量檢測采用ELISA法，試劑盒均購自深圳晶美生物工程有限公司，靈敏度分別為0.2 ng/ml、5 pg/ml，批內及批間變異均<9.5%。試驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行，每份標本檢測2孔，取平均值。酶標儀450 nm處進行檢測，5 min內測定各孔吸光度值(OD)，根據標準曲線分別計算出PEDF及VEGF水平。

1.3 預后隨訪 通過門診、住院或電話隨訪肝癌患者短期不良終點事件(short-term major adverse events,SMAE)發(fā)生情況，包括肝癌轉移或復發(fā)、嚴重并發(fā)癥或死亡等，死亡患者記錄死亡時間及死亡原因。

2 結 果

2.1 血漿PEDF及VEGF水平 健康對照組、良性肝病組和肝癌組血漿PEDF水平分別為(12.25±2.19)μg/ml、(11.16±2.09)μg/ml 、(6.10±1.24)μg/ml。與健康對照組及良性肝病組比較，肝癌組患者血漿PEDF明顯降低(P<0.01)，良性肝病組與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)。見圖1。3組研究對象血漿VEGF水平分別為(61.88±15.87)μg/ml、(63.47±13.94 )μg/ml和(194.80±14.60)μg/ml，與健康對照組及良性對照組比較，肝癌組患者血漿VEGF水平明顯升高(P<0.01)。見圖2。

注：與健康對照組比較，*P<0.01；與良性肝病組比較，#P<0.01

注：與健康對照組比較，*P<0.01；與良性肝病組比較，#P<0.01

2.2 肝癌患者PEDF/VEGF比值與近期預后的關系 根據PEDF/VEGF比值將所有肝癌患者分為高PEDF/VEGF比值(≥3)亞組22例和低PEDF/VEGF比值(<3)亞組21例，結果顯示：高PEDF/VEGF比值亞組發(fā)生SMAE 3例(13.64%)，低PEDF/VEGF比值亞組發(fā)生SMAE 7例(33.33%)，2亞組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.039)。見圖3。

圖3 不同PEDF/VEGF比值亞組肝癌患者生存曲線

2.3 SMAE比較 43例患者均完成隨訪工作。平均隨訪(12.02±0.23)個月后，記錄患者SMAE發(fā)生情況。43例肝癌患者共發(fā)生SMAE 10例，包括死亡1例，肝癌破裂出血1例，骨轉移2例，胸水2例，復發(fā)4例；與未發(fā)生SMAE者(33例)相比，發(fā)生SMAE者(10例)血漿PEDF/VEGF比值明顯降低(3.49±1.12 vs. 2.14±0.76)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討 論

肝癌是一種多血質的實體腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展和轉歸很大程度上依賴于新生血管形成。PEDF是目前最有效的天然血管抑制劑之一，具有強烈的血管生成抑制作用[7]。其作用機制包括：激活Fas/FasL系統(tǒng)誘導內皮細胞凋亡[8]，抑制毛細管道形成，抑制內皮細胞遷移[9]，抑制VEGF表達和修飾VEGFR1[10]。另外，PEDF和細胞外基質復合作用，抑制血管新生，誘導內皮細胞凋亡。有研究表明，低氧條件HCC細胞株分泌PEDF受抑制，而新生血管刺激因子——VEGF卻明顯增高[11]。VEGF是一種以亞基內及亞基間二硫鍵交聯形成的同源雙聚體糖蛋白，與其受體Flt-1和KDR特異性結合后，發(fā)揮多種功能，如促血管內皮細胞分裂增殖，增加血管通透性，調節(jié)內皮細胞凋亡的傳導路徑，對抗其凋亡過程等[12]。因此，生理情況下血漿中微量的PEDF與VEGF一般不參與新生血管形成，兩者共同作用維持正常的血管密度和通透性。

本結果顯示，與良性肝病患者及健康對照者比較，HCC患者血漿PEDF水平明顯降低，VEGF含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明肝癌發(fā)生時，促血管新生的VEGF與拮抗血管新生的PEDF平衡失調，致病理性新生血管大量產生，加劇腫瘤生長及轉移。進一步研究發(fā)現，PEDF/VEGF比值越低者，其近期肝癌轉移、復發(fā)等不良事件發(fā)生率越高。其機制可能為腫瘤迅速增長致間質壓力增加，引起毛細血管受壓閉合和連續(xù)性腫瘤壞死，缺氧負反饋調節(jié)機制抑制抗血管新生因子PEDF表達，而啟動促血管生成因子VEGF大量表達，重建腫瘤的血供系統(tǒng)，為腫瘤生長、轉移提供充足養(yǎng)分，進而形成了腫瘤生長轉移和血管生成的惡性循環(huán)。

綜上所述，血漿PEDF和VEGF在肝癌發(fā)生、生長和轉移過程中起重要作用，兩者可作為肝癌診斷和判斷預后的新腫瘤標記物。此外，腫瘤新生血管是目前重組人PEDF或VEGF拮抗劑等多種抗血管新生藥物的作用靶點，可能為腫瘤治療提供更廣闊的前景。

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4 Yamagishi SI,Matsui T,Kawaguchi T,et al.Pathophysiological role of pigment epithelium-derived factor (PEDF) in hepatic disorders[J]. Current Medicinal Chemistry, 2010, 17(19): 1995-2000.

5 Wang Q,Zhang Z,Ding T,et al.Mesenchymal stem cells over-expressing PEDF decreased the angiogenesis of gliomas[J].Biosci Rep,2012, 33(2): e00019.

6 楊秉輝，夏景林．原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標準[J]．中華肝臟病雜志，2001，9(6)：324．

7 Tombran-Tink J,Barnstable CJ.PEDF: a multifaceted neurotrophic factor[J]. Nature Reviews Neuroscience, 2003, 4(8): 628-636.

8 Mirochnik Y,Aurora A,Schulze-Hoepfner FT,et al.Short pigment epithelial-derived factor-derived peptide inhibits angiogenesis and tumor growth[J]. Clinical Cancer Research, 2009, 15(5): 1655-1663.

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11 Matsumoto K.Antiangiogenic property of pigment epithelium derived factor in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2003, 38(4-1):402A-403A.12 Yamagishi S,Matsui T.Pigment epithelium-derived factor(PEDF)and cardiometabolic disorders[J].Curr Pharm Des,2013.Epub ahead of print.

Therelationshipbetweenplasmalevelsofpigmentepithelialderivedfactorandvascularendothelialgrowthfactorinthepatientswithhepatocellularcarcinomaandprognosis

ZHULili,YANGKai,LIUYa.

DepartmentofGeneralSurgery，BeijingHaidianHospital,Beijing100080,China

YANGKai，E-mail:zlilii@126.com

ObjectiveTo observe the expression of pigment epithelium derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in liver cancer patients, and to explore its relationship with the prognosis.MethodsELISA was used to detect 43 cases of patients with hepatocellular carcinoma (HCC group), 20 patients with benign liver disease (benign liver disease group) and 20 cases of healthy controls' (healthy control group) levels of plasma PEDF and VEGF levels, patients with hepatocellular carcinoma with average follow-up (12.02 ± 0.23) months, the main short recording adverse events (SMAE) occurrence were recorded.ResultsThe levels of plasma PEDF of liver cancer group decreased than in benign liver disease group and healthy control group (P<0.01), VEGF level increased significantly (P<0.01), and benign disease group and the healthy control group had no significant difference (P>0.05). At the end of the follow-up of patients with hepatocellular carcinoma, high ratio of PEDF/VEGF subgroup (22 cases, PEDF/VEGF≥3) SMAE occurred in 3 patients (13.64%), low PEDF/VEGF ratio subgroup (21 cases, PEDF/VEGF < 3) SMAE occurred in 7 patients (33.33%), Kaplan-Meier survival curve showed statistically significant differences between the 2 groups (P=0.039). In addition, compared with without the occurrence of SMAE in patients with hepatocellular carcinoma (33 cases), patients with occurrence of SMAE (10 cases) with lower PEDF/VEGF ratio (2.14 ± 0.76 vs. 3.49 ± 1.12,P<0.01).ConclusionPEDF and VEGF have role in the pathophysiology of hepatocellular carcinoma, low expression of PEDF and high expression of VEGF reflects the development and metastasis of HCC, the ratio between the two may be an effective index to predict the metastasis and prognosis of hepatocellular carcinoma.

Hepatocellular carcinoma;Pigment epithelium derived factor;Vascular endothelial growth factor;Prognosis；Correlation

100080 北京市海淀醫(yī)院/北京大學第三醫(yī)院海淀院區(qū)普外科

楊凱，E-mail:zlilii@126.com

10.3969/j.issn.1671-6450.2014.06.017

2014-03-12)