非水相固定化生物催化的研究進(jìn)展

丁東慧，于煒婷，劉袖洞，馬小軍

（1大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連116622；2中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連116023）

隨著綠色化學(xué)的穩(wěn)定發(fā)展和社會(huì)可持續(xù)發(fā)展需求，傳統(tǒng)化學(xué)工業(yè)的高消耗、高污染已經(jīng)成為亟待解決的問(wèn)題。在日益注重生產(chǎn)效率和環(huán)境保護(hù)的氛圍下，基于酶和微生物細(xì)胞的生物催化技術(shù)也取得突破性進(jìn)展［1］，尤其是在生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品和藥物的工藝中，一些更加綠色和可持續(xù)的生物催化工藝正在取代傳統(tǒng)的化學(xué)合成路徑［2］；而且，為了克服底物或產(chǎn)物溶解度低、產(chǎn)物抑制等限制，對(duì)于需要高選擇性的一些精細(xì)化學(xué)品、手性中間體及藥物合成的工藝中還引入了非水相介質(zhì)。相比于水相生物催化，非水相生物催化有很多潛在的優(yōu)勢(shì)：如更高的底物溶解性、水解反應(yīng)的可逆性以及修飾酶的特異性［3］。

目前，在非水相生物催化的研究與應(yīng)用中，人們依靠現(xiàn)代分析技術(shù)和精確的計(jì)算，對(duì)于催化劑活性、微觀酶結(jié)構(gòu)、分子動(dòng)力學(xué)和溶劑極性之間的關(guān)系有了深入的認(rèn)識(shí)。例如，精確計(jì)算是利用計(jì)算機(jī)模擬非水相生物催化，從分子水平對(duì)酶行為細(xì)節(jié)進(jìn)行研究，獲取活性和選擇性等有價(jià)值的信息，再將其與實(shí)驗(yàn)結(jié)合，能夠更加全面地認(rèn)識(shí)非水相生物催化過(guò)程［4］。

同時(shí)，為了實(shí)現(xiàn)生物催化過(guò)程的工業(yè)應(yīng)用，更多的研究側(cè)重于如何提高生物催化劑活性和選擇性等方面。這主要涉及兩部分：一個(gè)是溶劑工程，即通過(guò)改變酶促反應(yīng)的介質(zhì)環(huán)境以調(diào)節(jié)酶活性和底物選擇性等性質(zhì)的酶工程技術(shù)；另一個(gè)是生物催化工程，即通過(guò)篩選極端微生物、酶的改造和工程手段，提高生物催化劑的溶劑耐受性或者調(diào)節(jié)活性等，如定向篩選、蛋白質(zhì)工程和固定化技術(shù)［2］。

1 非水相介質(zhì)

生物催化系統(tǒng)主要由底物及產(chǎn)物、反應(yīng)介質(zhì)、生物催化劑三個(gè)基本要素構(gòu)成。在非水相生物催化過(guò)程中，選擇條件溫和且無(wú)污染的反應(yīng)介質(zhì)［5］對(duì)于可持續(xù)發(fā)展尤其重要。

1.1 常規(guī)的水－有機(jī)溶劑介質(zhì)

生物催化體系研究中，水－有機(jī)溶劑系統(tǒng)是研究相對(duì)全面的非水相介質(zhì)。添加有機(jī)溶劑一方面能夠提高疏水性底物的利用率、降低底物或產(chǎn)物對(duì)生物催化劑的抑制；另一方面也可能影響生物催化劑活性和選擇性。因此，在選擇有機(jī)溶劑的時(shí)候必須綜合考慮上述兩個(gè)方面的影響［2，6］。

Kansal等［7］首先研究了有機(jī)溶劑與水形成的兩相體系對(duì)假絲酵母菌（C.viswanathii）活性的影響，包括二甲基亞砜（DMSO）、甲醇、二甲基甲酰胺（DMF）、乙醇、異丙醇、正丙醇、己醇、苯、庚醇、己烷、癸醇和庚烷等12種溶劑。在水∶溶劑比為1∶1時(shí)，細(xì)胞活性保持率在己烷中最高（59%）而在DMSO中最低，表明較高的溶劑濃度（50%，體積比）對(duì)微生物是高毒性的。以苯乙酮為底物，在水－異丙醇（10%，體積比）中轉(zhuǎn)化率高達(dá)94%、對(duì)映體過(guò)量值（ee）＞99%；在水－乙醇和水－己烷中也都高于80%，優(yōu)于水相中76%的轉(zhuǎn)化率，但是水－己烷中的ee值為96%；而且添加異丙醇還增強(qiáng)了高溫下的操作穩(wěn)定性，45℃、50℃下均得到90%的轉(zhuǎn)換率和＞99%的ee值。上述結(jié)果說(shuō)明低濃度溶劑對(duì)細(xì)胞活性影響較小，通過(guò)提高底物溶解度可以實(shí)現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)化率，而選擇不同溶劑還可以調(diào)控酶的選擇性。此外，將細(xì)胞固定在海藻酸鈣凝膠中，在高濃度水－己烷（50%，體積比）兩相中細(xì)胞活性保持率達(dá)91%，遠(yuǎn)高于游離細(xì)胞的59%，表明固定化技術(shù)可以提高細(xì)胞在高濃度有機(jī)溶劑中的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

Cheng等［8］研究了酵母細(xì)胞中乙醇脫氫酶在水／己烷兩相體系中合成手性1－苯基－1－正丁醇的過(guò)程。在只含有輔因子Zn2＋的水相體系中（無(wú)己烷），（S）－1－苯基－1－正丁醇的產(chǎn)量是65.3%，ee值是93.0%；而在含有40%己烷的兩相體系中，（R）－1－苯 基－1－正 丁 醇 產(chǎn) 量 是9.6%，ee值 是90.9%。表明選擇合適的水－有機(jī)溶劑兩相可以影響對(duì)酶的對(duì)映選擇性。

侯丹丹等［9］研究了海藻酸鈉－殼聚糖微膠囊固定化酵母菌的生長(zhǎng)代謝情況，結(jié)果顯示，在水－癸二酸二丁酯兩相中，微囊內(nèi)酵母細(xì)胞活性保持良好，微囊內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)未受影響；底物L(fēng)－苯丙氨酸的濃度在8～16g／L范圍內(nèi)，生物催化生產(chǎn)2－苯乙醇的過(guò)程呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)化率，2－苯乙醇產(chǎn)量達(dá)4.5g／L，初步驗(yàn)證了海藻酸鈉－殼聚糖微膠囊體系用于非水相催化的可行性。

Costas等［10］研究了有機(jī)溶劑對(duì)果膠微球固定化脂肪酶穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，固定化脂肪酶在正己烷、正十四烷和正庚烷中的穩(wěn)定性與水相中類似，但在異丁醇、己醇等溶劑存在時(shí)穩(wěn)定性顯著下降。而且，將脂肪酶包埋在鈣離子交聯(lián)的果膠凝膠中，其在70%水－有機(jī)溶劑互溶體系中酶活性比單純水相中提高3～4倍。

Kapoor等［11］研究了4－硝基苯甲醛和乙酰乙酸乙酯的脫羧羥醛反應(yīng)，通過(guò)大孔丙烯酸載體固定化念珠菌，在60%的乙腈和40%水的反應(yīng)介質(zhì)中合成4－羥基－4－（4－硝基苯基）－丁酮－2－酮，反應(yīng)72小時(shí)產(chǎn)率達(dá)99%。同時(shí)，為了提高反應(yīng)速率以及增加產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)中添加了30%（摩爾分?jǐn)?shù)）的咪唑，速率從原來(lái)的85μmol／（L·min·mg）增加到了557μmol／（L·min·mg），產(chǎn) 率 在14h就 得 到98%，該結(jié)果表明，固定化念珠菌細(xì)胞在水－溶劑介質(zhì)中具有很好的反應(yīng)活性，而適當(dāng)使用添加劑，能夠促進(jìn)非水相介質(zhì)中的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，有利于商業(yè)過(guò)程開(kāi)發(fā)。

為了盡可能避免有機(jī)溶劑的不利影響，上述例子均結(jié)合了固定化技術(shù)，利用固定化載體能盡量避免生物催化劑與溶劑直接接觸，以降低溶劑的相毒性，因此增強(qiáng)了生物催化劑的活性和穩(wěn)定性，有利于反應(yīng)向產(chǎn)物合成的方向進(jìn)行。

1.2 新型非水相體系

近幾年來(lái)，除了致力于篩選具有合適物化性能和生物相容性的有機(jī)溶劑以及構(gòu)建不同的水－有機(jī)溶劑組合，人們也嘗試一些新型非水相介質(zhì)的應(yīng)用，如將離子液體和超臨界二氧化碳流體等綠色溶劑應(yīng)用于生物催化與生物轉(zhuǎn)化研究中。

1.2.1 離子液體

離子液體也被叫做熔化鹽，是由有機(jī)陽(yáng)離子和不同陰離子組成的有機(jī)熔鹽。典型的離子液體是二烷基陽(yáng)離子與弱陰離子（如MeOSO3或者PF6）的混合物。高級(jí)的離子液體膽堿檸檬酸鹽可生物降解，比較便宜，并且是毒性較小的陰離子和陽(yáng)離子的組合［12－13］，因此有望用于生物催化并擴(kuò)大到工業(yè)生產(chǎn)。

Maruyama等［14］研究發(fā)現(xiàn)，盡管天然脂肪酶粉末在離子液體中活性較低，但仍能將乙酸乙烯酯與2－苯基－1－丙醇醇解為2－苯基－1－丙基乙酸；當(dāng)采用聚乙二醇（PEG）固定化脂肪酶，其在離子液體1－丁基－3甲基咪唑六氟磷酸鹽（［Bmim］［PF6］）中的反應(yīng)活性明顯提高，在45℃下反應(yīng)6h的產(chǎn)率就比游離酶高50%左右。同時(shí)比較了固定化脂肪酶在離子液體［Bmim］［PF6］、1－己基－3－甲基咪唑六氟磷酸鹽（［Hmim］［PF6］）、1－辛基－3－甲基咪唑六氟磷酸鹽（［Omim］［PF6］）和有機(jī)溶劑n－正己烷、異辛烷、DMSO、乙腈中的最初反應(yīng)速率，離子液體中的速率比有機(jī)溶劑中要高出4倍左右。而且，PEG固定化脂肪酶在離子液體中醇解具有相對(duì)高的對(duì)映選擇性，在［Bmim］［Tf2N］中，ee值是98%，比［Hmim］［PF6］中的80%和［Omim］［PF6］中的77%要高，而后兩種離子液體的對(duì)映選擇性與在n－正己烷中是相當(dāng)?shù)模@些結(jié)果表明并不是所有的離子液體能夠提高對(duì)映選擇性，應(yīng)該進(jìn)行合適的篩選，以達(dá)到期望的結(jié)果，同時(shí)也表明將離子液體與固定化技術(shù)結(jié)合用于生物催化有很大的優(yōu)勢(shì)。

Shah等［15］將脂肪酶固定在多層碳納米管上，研究了其在非水相介質(zhì)中的性能。實(shí)驗(yàn)選取了兩種非水相介質(zhì)進(jìn)行對(duì)比，一個(gè)是己烷－水系統(tǒng)，與游離酶相比，固定化脂肪酶使得酯基轉(zhuǎn)移速率增加了22倍，丁酸丁酯的產(chǎn)率從14%增加到64%；另一個(gè)是離子液體［Bmim］［PF6］系統(tǒng)，速率增加14倍，產(chǎn)率達(dá)71%，而且固定化脂肪酶顯著提高了對(duì)映選擇性，ee值超過(guò)99%。通過(guò)比較可看出，固定化脂肪酶在離子液體中的活性及選擇性要優(yōu)于常規(guī)的水－有機(jī)溶劑系統(tǒng)。

分析認(rèn)為，通過(guò)對(duì)陽(yáng)離子和陰離子的適當(dāng)組合或者改性可以調(diào)節(jié)離子液體極性和物質(zhì)溶解性能，因此，它作為生物催化過(guò)程中的非水相介質(zhì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的底物或者產(chǎn)物溶解能力，進(jìn)而會(huì)降低底物或者產(chǎn)物對(duì)生物催化劑的抑制作用；而且離子液體也不會(huì)破壞細(xì)胞膜，表現(xiàn)出較小的細(xì)胞和生物毒性，對(duì)于生物催化劑的活性、穩(wěn)定性和選擇性有一定增強(qiáng)作用［16－17］。另外，離子液體的使用還能夠簡(jiǎn)化產(chǎn)品分離過(guò)程。盡管上述研究表明離子液體作為一種新型非水相介質(zhì)，在生物催化過(guò)程中具有一定的優(yōu)越性，但是其在生物催化中的應(yīng)用仍停留在實(shí)驗(yàn)階段，待解決的主要問(wèn)題有：離子液體的陰陽(yáng)離子組合設(shè)計(jì)與生物催化劑性能的匹配、離子液體的純度與穩(wěn)定性、離子液體的高效回收利用及降低成本等。

1.2.2 超臨界流體

超臨界流體是指溫度和壓力稍高于臨界點(diǎn)時(shí)的一種特殊狀態(tài)流體（如CO2在31℃和7.38MPa以上的狀態(tài)），顯示出了獨(dú)特的性能：具有液體一樣的密度、溶解能力和傳熱系數(shù)，具有氣體一樣的低黏度和高擴(kuò)散系數(shù)。在臨界狀態(tài)附近，溫度和壓力的微小變化會(huì)導(dǎo)致溶質(zhì)的溶解度發(fā)生幾個(gè)數(shù)量級(jí)的突變，利用這一特性，超臨界流體可以溶解、分離物質(zhì)，成為很有潛力的一種綠色反應(yīng)介質(zhì)［18］。

Lozano等［18］在離子液體與超臨界二氧化碳（scCO2）結(jié)合的介質(zhì)中，研究了固定化脂肪酶催化合成環(huán)氧丙基酯的反應(yīng)過(guò)程，這是因?yàn)殡x子液體能夠保證酶的活性，scCO2能夠很好的溶解、傳遞疏水性的底物。在35℃，7～18MPa條件下，即使底物濃度小也能夠完成合成反應(yīng)，而且在scCO2中的反應(yīng)速率是有機(jī)溶劑中的2倍，同時(shí)scCO2添加到離子液體中，混合體系的黏性僅是同樣條件下離子液體的1／5，顯著提高了物質(zhì)的傳遞速率。

超臨界流體比較容易獲得，能夠溶解疏水和親水的溶質(zhì)，對(duì)于酶反應(yīng)具有一定的優(yōu)勢(shì)，但目前更多的是借助分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)行分析。通過(guò)模擬無(wú)水scCO2和純水中南極假絲酵母脂肪酶性能顯示，脂肪酶在水中比在純scCO2中更穩(wěn)定，但是在scCO2中添加少量水，就會(huì)增加酶的穩(wěn)定性。同時(shí)對(duì)離子液體－scCO2兩相進(jìn)行模擬，結(jié)果顯示脂肪酶在兩相中比在單純的scCO2中更穩(wěn)定［4］，這些結(jié)果僅僅是分子動(dòng)力學(xué)模擬的分析，實(shí)際操作還不成熟，但是將酶－離子液體系統(tǒng)在scCO2中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，過(guò)程更加干凈，為綠色化學(xué)工業(yè)發(fā)展開(kāi)辟了一條新路。

1.2.3 質(zhì)子惰性的有機(jī)溶劑

質(zhì)子惰性的有機(jī)溶劑是非水相生物催化研究中的一種新介質(zhì)。Egusa等［19］在質(zhì)子惰性的非水溶劑N，N－二甲基乙酰胺中，研究了殼二糖合成長(zhǎng)鏈甲殼素的過(guò)程，用蔗糖油酸表面活性劑包埋溶菌酶，再用質(zhì)子酸做輔助催化劑，得到了較高的催化效率（40%～80%）。

Egusa等［20］還通過(guò)N，N－二甲基乙酰胺表面活性劑包埋纖維素酶，很好地保護(hù)了酶的活性，同時(shí)添加質(zhì)子酸做輔助催化劑，在質(zhì)子惰性的有機(jī)溶劑中成功從纖維二糖中直接高效地合成長(zhǎng)鏈纖維素，并且合成纖維的聚合度也達(dá)到了120，濃度比普通的無(wú)酸系統(tǒng)高出了5倍。

上述結(jié)果表明質(zhì)子惰性的有機(jī)溶劑作為生物催化反應(yīng)的介質(zhì)是可行的，并且在大規(guī)模的低聚糖、多糖的合成上也是很有效率的，只是現(xiàn)在還不是很成熟，應(yīng)用范圍窄，需要進(jìn)一步探索其在藥物、精細(xì)化學(xué)品等合成方面的應(yīng)用性能，以更廣泛地應(yīng)用于生物催化工程。

1.2.4 深低共熔溶劑

深低共熔溶劑［21］（DES）也是非水相生物催化中應(yīng)用的一種新型綠色溶劑，是通過(guò)銨鹽與氫鍵供體的結(jié)合形成的，熔點(diǎn)接近室溫，具有低的揮發(fā)性和高的熱穩(wěn)定性，而且DES可生物分解，價(jià)廉易得，比多數(shù)離子液體具有明顯優(yōu)勢(shì)。

Durand等［21］在深低共熔溶劑中，研究了固定化南極假絲酵母脂肪酶進(jìn)行乙烯基酯的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，同時(shí)評(píng)價(jià)了不同鏈長(zhǎng)度的醇類對(duì)底物極性的影響規(guī)律，結(jié)果顯示固定化脂肪酶有更好的活性，并且深低共熔溶劑中的氫鍵供體組分能夠和醇解反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)；同時(shí)研究了其他深低共熔溶劑在60℃生成正丁醇、正辛醇以及十八醇的濃度和選擇性的對(duì)比，如摩爾比1∶2的膽堿氯化物與尿素、摩爾比1∶2的膽堿氯化物與甘油、摩爾比1∶1的膽堿氯化物與草酸、摩爾比1∶1的膽堿氯化物與丙二酸等，其中脂肪酶在摩爾比為1∶2的膽堿氯化物與甘油中表現(xiàn)出更高的活性和選擇性，ee值可超過(guò)99%，這為脂肪酶催化提供了更多的選擇。

相比傳統(tǒng)的溶劑，深低共熔溶劑能很好保持酶的活性，但是在DES的具體例子中都是基于二羧基酸，其自身黏度就很高，隨著反應(yīng)進(jìn)行黏度會(huì)逐漸增加，使得攪拌和回收都很困難，從而影響反應(yīng)的進(jìn)行及產(chǎn)物分離。

2 固定化載體

在非水相生物催化中，保持或增強(qiáng)酶和微生物的活性和穩(wěn)定性是必須要考慮的方面，除了篩選極端微生物或通過(guò)定向進(jìn)化等生物手段改造酶，固定化技術(shù)是一個(gè)簡(jiǎn)單易行且行之有效的工程手段。固定化技術(shù)的關(guān)鍵之一就是所用載體材料的性能，一般要求具有良好的傳質(zhì)性能、可保持酶或細(xì)胞的高活性、穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度高、價(jià)格低廉、適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)等［22－24］。

常用的固定化載體可以分為無(wú)機(jī)載體（玻璃、硅凝膠、鋁、斑脫土等）、高分子載體（天然高分子和合成高分子），近年來(lái)還出現(xiàn)了新型的無(wú)載體固定化技術(shù)。

2.1 無(wú)機(jī)載體

無(wú)機(jī)載體具有穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度高、對(duì)微生物無(wú)毒性、不易被微生物所分解、耐酸堿、成本低、壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因而其應(yīng)用日益增多。

Zhang等［25］通過(guò)吸附法將釀酒酵母脂肪酶固定在水化碳酸氫氧鎂鋁載體上，用于生物柴油的生產(chǎn)。結(jié)果顯示，固定化脂肪酶活性在50℃時(shí)保留了95%，而游離酶是88%。從米根霉中提取的脂肪酶固定在CaCO3上，固定化的生物柴油產(chǎn)率在30min達(dá)到95%。但是吸附法的最大問(wèn)題是容易造成酶的泄露及在溶劑中使用的活性損失［26］。可以看到，對(duì)于生物柴油生產(chǎn)，發(fā)展迅速的固定化技術(shù)滿足了工業(yè)化需求，在不久的將來(lái)會(huì)替代化學(xué)催化。

Vila－Real等［27］將柚苷酶固定化在四甲氧基硅烷和甘油組成的溶膠－凝膠基質(zhì)上，研究了柚苷水解為還原糖的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中選取了8種溶劑：二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、1，2－乙二醇二甲醚和1，4－二氧己烷，用來(lái)提高柚苷溶解性，并考察了柚苷酶的穩(wěn)定性和活性，同時(shí)對(duì)α－L－鼠李糖苷酶和β－D－葡萄糖苷酶進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，在有機(jī)溶劑或者共溶劑的存在下，固定化酶仍能保留50%的活性，并且穩(wěn)定性也提高了；在水－四氫呋喃中，α－L－鼠李糖苷酶和β－D－葡萄糖苷酶的半衰期也分別增加了21倍和59倍。四甲氧基硅烷和甘油組成的溶膠－凝膠載體對(duì)于生物催化是一大創(chuàng)新，對(duì)將來(lái)更好地應(yīng)用于生物催化顯示了很大的優(yōu)勢(shì)。

近年來(lái)二氧化硅載體成為研究的熱點(diǎn)。二氧化硅具有大比表面區(qū)域和可控制的孔徑，而且能根據(jù)特定酶的尺寸進(jìn)行調(diào)整，被廣泛用于酶固定化的惰性載體［28］。Yu等［29］通過(guò)物理吸附、交聯(lián)和共價(jià)結(jié)合三種方法，將玫瑰念珠菌脂肪酶固定在多孔二氧化硅載體上，研究了其在異辛烷溶劑中對(duì)共軛亞油酸和乙醇的選擇性酯化作用。實(shí)驗(yàn)中的二氧化硅通過(guò)嵌段共聚物的非離子表面活性劑、氨基化和戊二醛嫁接進(jìn)行修飾，固定的玫瑰念珠菌脂肪酶活性比游離酶高8倍，同時(shí)也展現(xiàn)了高水平的酯化活性和操作穩(wěn)定性，并且在32h連續(xù)反應(yīng)后總酯化作用的產(chǎn)率為43.2%～46.9%。共價(jià)結(jié)合法是表面功能團(tuán)和固相支持物表面的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價(jià)鍵連接，該方法與載體結(jié)合緊密，使用過(guò)程中不易脫落，但反應(yīng)激烈、條件較難控制，往往容易造成活性損失，應(yīng)用并不廣泛。Cruz等［30］將南極假絲酵母脂肪酶用物理吸附法固定在二氧化硅納米顆粒中，研究了己烷中進(jìn)行的n－乙酰－L－苯丙氨酸乙酯的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，結(jié)果顯示酶活性顯著提高。

傳統(tǒng)的無(wú)機(jī)載體材料價(jià)廉易得、機(jī)械強(qiáng)度高、無(wú)毒且穩(wěn)定性好，一般是借助吸附法或經(jīng)小分子化學(xué)改性以共價(jià)鍵合方式固定化酶，幾乎不用于固定化細(xì)胞。但無(wú)機(jī)載體的結(jié)構(gòu)不易調(diào)控，影響傳質(zhì)且鍵合酶的能力差，因此，通過(guò)對(duì)無(wú)機(jī)載體進(jìn)行修飾或者與有機(jī)載體結(jié)合使用、制備兼具優(yōu)良特性的載體成為今后研究的熱點(diǎn)。

2.2 高分子載體

高分子載體既可用作酶的固定化，也可用于微生物細(xì)胞的固定化。固定化細(xì)胞是在固定化酶基礎(chǔ)上逐步發(fā)展形成的，與酶固定化相比較，其具有以下優(yōu)點(diǎn)：①無(wú)須進(jìn)行酶的分離提取；②酶的穩(wěn)定性高；③可進(jìn)行細(xì)胞中多酶體系反應(yīng)等。而且，固定化細(xì)胞具有密度大、可增殖、可實(shí)現(xiàn)反復(fù)使用、有利于產(chǎn)品的分離提取等特點(diǎn)，因此，固定化細(xì)胞技術(shù)在連續(xù)反應(yīng)中占有明顯的優(yōu)勢(shì)，主要被應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)分析、環(huán)境保護(hù)、能源開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域［31］。高分子載體包括天然高分子和合成高分子［32］。

2.2.1 天然高分子載體

天然高分子材料的主要特點(diǎn)是來(lái)源廣泛、無(wú)毒、有良好的傳質(zhì)性能。常見(jiàn)的天然高分子載體有海藻酸鈉、殼聚糖、淀粉、瓊脂、卡拉膠、纖維素、明膠、膠原等，其中瓊脂的機(jī)械強(qiáng)度較差［33］。另外，瓊脂或者纖維素衍生物等可以形成油包水微乳液的有機(jī)凝膠，應(yīng)用在不同種酶催化反應(yīng)中，能夠保留酶活性并且增加穩(wěn)定性［34］。但是天然高分子材料也存在強(qiáng)度低、厭氧條件下易被微生物分解、使用壽命短等缺點(diǎn)，所以在實(shí)際應(yīng)用中受到一定程度的限制。

Quiroga等［35］將酶包埋在海藻酸鈣膠珠中，在4℃保存45天后，酶活性仍保留95%，20個(gè)水解反應(yīng)周期后，活性維持在78%，固定化酶活性在縮氨酸的合成中比游離酶提高了26倍。這里用到的固定化方法是典型的包埋法［21］，是將細(xì)胞或酶包裹在凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)或半透性聚合物薄膜內(nèi)，小分子底物和產(chǎn)物可自由擴(kuò)散，而細(xì)胞或酶不會(huì)擴(kuò)散到周圍的介質(zhì)。

Garikipati等［36］利用海藻酸鈣載體固定大腸桿菌，在乙酸月桂酸酯／水的兩相體系中將萘轉(zhuǎn)化為萘酚，但是實(shí)驗(yàn)中游離和固定化細(xì)胞損失60%，可能是有機(jī)溶劑的毒性造成的，但相比水相中而言，固定化細(xì)胞催化產(chǎn)物的產(chǎn)量提高了8倍。

張芳等［37］采用海藻酸鈉載體固定化紅酵母細(xì)胞，在水／有機(jī)溶劑兩相體系中考察了3，5－雙三氟甲基苯乙酮合成（S）－3，5－雙三氟甲基苯乙醇的反應(yīng)。結(jié)果表明，固定化紅酵母細(xì)胞在5%辛烷中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，于30℃、pH＝8、1142mg／mL底物濃度并添加葡萄糖作為輔助底物的條件下，轉(zhuǎn)化效果最佳，經(jīng)6次重復(fù)使用，仍可保留50%的轉(zhuǎn)化活力。

盡管海藻酸鈉具有良好的生物相容性，是目前在生物技術(shù)和醫(yī)用組織工程等領(lǐng)域很有前景的生物材料，但在為數(shù)不多的非水相介質(zhì)中應(yīng)用時(shí)仍表現(xiàn)出機(jī)械強(qiáng)度差、溶劑相毒性和疏水物質(zhì)傳遞難等問(wèn)題，需要對(duì)其進(jìn)行改性或與其他材料復(fù)合使用，以擴(kuò)大它的應(yīng)用。

Li等［38］研究了酵母酒精脫氫酶的固定化催化反應(yīng)，將苯基乙醛酸催化形成苯乙醇酸，使用殼聚糖納米微粒作為載體，用靜電吸附和共價(jià)結(jié)合固定的方法，考察了固定化時(shí)間、酶濃度和pH值等條件，與游離酶比較，固定化酶保留原始活性的65%，顯示了更顯著的熱穩(wěn)定性和持久性。

韓鴻鵬等［39］選擇瓊脂、明膠、瓊脂－明膠3類載體固定化放線菌2235產(chǎn)生的纖維素酶，分別以羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）和濾紙為底物，測(cè)定不同方法固定化纖維素酶的活性，確定用于固定化纖維素酶的優(yōu)良載體。結(jié)果表明，明膠法固定化效果最差；瓊脂－明膠協(xié)同法固定化效果最優(yōu)，采用該方法測(cè)得的濾紙酶和CMC酶活性分別可達(dá)3317nkat·mL－1和8868nkat·mL－1。

2.2.2 合成高分子載體

合成高分子材料有較好的強(qiáng)度、較強(qiáng)的抵抗微生物分解性能，但是傳質(zhì)性能比較差。它可以用作任何一種酶的固定化載體，如果包埋細(xì)胞會(huì)使細(xì)胞的活性有一定程度的降低［40］。常見(jiàn)的合成高分子有聚丙烯酸（PAA）、聚乙烯醇（PVA）、聚丙烯酰胺（PAM）、聚氨酯泡沫（PUF）等。

Yadav等［41］將脂肪酶固定在大孔聚丙烯酸樹(shù)脂上，在甲苯溶劑中進(jìn)行丁基－4－甲基－3－氧化戊酸酯的合成，結(jié)果顯示，酯基轉(zhuǎn)移率為87%，產(chǎn)物純度達(dá)到98%，而且固定化酶是可以重復(fù)使用的。另外，他們還在微波照射的情況下，利用丙烯酸樹(shù)脂固定化南極假絲酵母脂肪酶，進(jìn)行（±）－1－（1－萘基）乙醇的動(dòng)力學(xué)拆分研究，在60℃和30mg固定化酶用量下于n－正庚烷溶劑中反應(yīng)3h，產(chǎn)物濃度達(dá)到47.74%，同時(shí)對(duì)映選擇性為90.05%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算模擬一致，具有極大的工業(yè)應(yīng)用前景［42］。

Pavlidis等［43］研究了水－離子液體微乳液基礎(chǔ)的有機(jī)凝膠，這是一種新的固定化載體，當(dāng)這種載體固定的酶被用在不同種類的極性和非極性的有機(jī)溶劑或者離子液體中時(shí)，酯化活性是油包水的微乳液有機(jī)凝膠固定化酶的44倍。這種固定化酶的活性在70℃仍保留幾個(gè)小時(shí)，半衰期也比在水－油微乳液中高25倍。

Arabi等［44］分別用海藻酸鈉、瓊脂、卡拉膠、聚乙烯醇為載體固定化念珠藻，在十六烷／水的催化體系中，將雄－4－3，17－二酮轉(zhuǎn)化為睪酮，不同載體的產(chǎn)率分別為瓊脂（25±18）%、卡拉膠（31±31）%、聚乙烯醇（36±6）%，而相比游離念珠藻（24±13）%的產(chǎn)率，海藻酸鈉固定化細(xì)胞顯示出更高的產(chǎn)率（72±23）%，比較可看出天然高分子載體的優(yōu)勢(shì)，而海藻酸鈉是最突出的。

以上都是常用于非水相生物催化的高分子載體，它們的性能比較如表1所示［2］。

表1 常用高分子載體材料的性能比較

雖然整體上看合成高分子載體有一定的優(yōu)勢(shì)，但是傳質(zhì)性能差常導(dǎo)致反應(yīng)效率低下及產(chǎn)物抑制等問(wèn)題；天然高分子載體生物相容性好，對(duì)酶和細(xì)胞的毒性小，但需要進(jìn)一步提高機(jī)械強(qiáng)度和在非水相介質(zhì)中的適應(yīng)性。

2.3 無(wú)載體固定化

無(wú)載體固定化技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型固定化方法。無(wú)載體酶固定化可能使用不同功能的交聯(lián)劑，如利用戊二醛交聯(lián)。另外，當(dāng)一些酶在緊密靠近的時(shí)候，能夠通過(guò)交聯(lián)產(chǎn)生聚集體，如蛋白質(zhì)晶體。

一方面，交聯(lián)酶聚集體（CLEAs）有一定的優(yōu)點(diǎn)：成本低、制備簡(jiǎn)單、具有高單位活性和操作穩(wěn)定性、容易恢復(fù)和重新獲得，同時(shí)在水相中是完全穩(wěn)定的［45－46］。目前，CLEAs已經(jīng)用于抗生素合成及化合物手性拆分等領(lǐng)域，表現(xiàn)出較好的催化活性和操作穩(wěn)定性［47］。兩種或多種不同類型酶（水解酶、氧化還原酶和裂解酶）的聚合和交聯(lián)可以形成結(jié)合的CLEAs，適合利用多種酶的串聯(lián)過(guò)程進(jìn)行工業(yè)相關(guān)的生物轉(zhuǎn)化，如將羥氰裂解酶、腈水解酶和酰胺酶構(gòu)建成一個(gè)三層式立體交叉的結(jié)合－CLEA，置于反應(yīng)器中成功實(shí)現(xiàn)苯甲醛到S－扁桃酸的一步轉(zhuǎn)化過(guò)程［45］。

另一方面，雖然具有制備過(guò)程簡(jiǎn)單和催化性能優(yōu)良的特點(diǎn)，但由于酶的種類、純度和來(lái)源的差別，不同酶的CLEAs往往在制備及性質(zhì)上存在差異，這就需要根據(jù)不同酶及所催化的反應(yīng)特點(diǎn)來(lái)制備和使用CLEAs，才能將CLEAs技術(shù)應(yīng)用于各類生物催化反應(yīng)中。而且，在連續(xù)生物催化進(jìn)程中，對(duì)于無(wú)載體的酶微粒，較差的機(jī)械強(qiáng)度和高壓縮性是值得考慮的問(wèn)題［48］。

Lai等［49］研究了青霉菌脂肪酶交聯(lián)酶聚集體的催化性能并用于生物柴油的生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)考察了交聯(lián)酶在水相、有機(jī)溶劑以及離子液體中的活性和穩(wěn)定性，結(jié)果顯示交聯(lián)酶在有機(jī)溶劑中的半衰期比在水相中要高一些，并且在離子液體［Bmim］［PF6］中，青霉菌脂肪酶交聯(lián)酶催化生產(chǎn)生物柴油的產(chǎn)率達(dá)到85.7%，從而表明青霉菌脂肪酶交聯(lián)酶聚集體在生物柴油的工業(yè)生產(chǎn)中具有一定的應(yīng)用潛力。

正是基于高活性保留和穩(wěn)定性、高的催化生產(chǎn)力和產(chǎn)率，這種不需要載體的交聯(lián)酶聚集體具有相當(dāng)大的工業(yè)應(yīng)用潛能。而且將這種酶固定在微通道反應(yīng)器中可以實(shí)現(xiàn)快速篩選和最優(yōu)化，并用于連續(xù)生產(chǎn)，這是生物催化技術(shù)的一大優(yōu)勢(shì)。交聯(lián)酶聚集體技術(shù)的發(fā)展將更多地集中在制備機(jī)理的分析、微觀結(jié)構(gòu)的表征調(diào)控、與底物相互作用的研究以及應(yīng)用體系的拓寬，并會(huì)與載體工程、溶劑工程等領(lǐng)域的新方法結(jié)合，以使其在生物催化和轉(zhuǎn)化中發(fā)揮更大的優(yōu)勢(shì)［46］。

3 展 望

非水相生物催化技術(shù)具有提高疏水性底物和產(chǎn)物溶解性、降低產(chǎn)物抑制、抑制水解反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在手性中間體及藥物合成、精細(xì)化學(xué)品和生物能源生產(chǎn)等領(lǐng)域日益受到關(guān)注。目前，非水相生物催化技術(shù)的研究一方面集中在發(fā)現(xiàn)和篩選溶劑耐受性生物催化劑，利用合理設(shè)計(jì)及定向進(jìn)化等技術(shù)改造酶以提高熱穩(wěn)定性或選擇性；另一方面則致力于探索與構(gòu)建生物相容且與生物催化劑性能匹配的非水相介質(zhì)，而且實(shí)現(xiàn)了離子液體、超臨界流體等新型介質(zhì)中的生物催化過(guò)程，但是新型非水相介質(zhì)要實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用，還需達(dá)到規(guī)模化制備、性能穩(wěn)定、可降解或易于回收、價(jià)格便宜以及適用范圍廣等要求。

固定化技術(shù)是傳統(tǒng)水相生物催化過(guò)程中保持酶或微生物活性及穩(wěn)定性的有效手段，而且能夠解決生物催化劑長(zhǎng)期操作穩(wěn)定性差、難以回收再利用等問(wèn)題，是工業(yè)應(yīng)用環(huán)境中提高生物催化劑操作性能的一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的技術(shù)。近年來(lái)，固定化技術(shù)與非水相介質(zhì)結(jié)合用于生物催化過(guò)程的報(bào)道日漸增多，在保持酶或微生物活性及穩(wěn)定性、提高產(chǎn)率及調(diào)節(jié)反應(yīng)選擇性等方面都取得一定效果，但是，固定化載體制備條件的溫和性、在非水相介質(zhì)中的穩(wěn)定性、底物和產(chǎn)物傳質(zhì)能力以及生物催化反應(yīng)合成藥物、手性中間體的區(qū)域選擇性、立體選擇性以及對(duì)映選擇性等方面仍是需要努力的方向。

總之，非水相介質(zhì)與固定化載體材料及方法的匹配與優(yōu)化，并且選擇合適的生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)和操作方式，才能更好的保證生物催化劑的活性和穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)高效的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，推動(dòng)非水相固定化生物催化在工業(yè)中的應(yīng)用。

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