ORP調(diào)控對葡萄糖和果糖混合底物丁醇發(fā)酵的影響

齊高相，吳又多，陳麗杰，萬慧慧，白鳳武，3

（1大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連116023；2大連理工大學(xué)化學(xué)分析測試中心，遼寧 大連116023；3上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海200240）

與好氧發(fā)酵過程相比，厭氧發(fā)酵過程由于缺少合適的控制參數(shù)而難以進(jìn)行過程優(yōu)化。氧化還原電位（oxidoreduction potential，ORP）調(diào)控作為一種新的過程調(diào)控手段已經(jīng)應(yīng)用于很多厭氧發(fā)酵過程，比如1，3－丙二醇發(fā)酵［1］、木糖醇發(fā)酵［2］、丙酸發(fā)酵［3］、乳 酸 發(fā) 酵［4］和 丁 醇 發(fā) 酵［5］等 生 物 過 程工藝。

ORP是綜合反映發(fā)酵培養(yǎng)基pH值、溶解氧濃度、電解質(zhì)電勢和平衡常數(shù)的參數(shù)［6］，在所有生物的生命過程中起到很重要的作用［7］，每一菌種甚至是每一菌株都有最利于其生長的ORP范圍。ORP不僅與培養(yǎng)基理化性質(zhì)有關(guān)，而且能夠反應(yīng)菌體內(nèi)部氧化還原狀態(tài)［8］。通過蛋白膜電勢（protein film voltammery，PFV）技術(shù)將酶分子固定到ORP電極上，測定許多與氧化還原反應(yīng)有關(guān)的酶的活性隨ORP變化，結(jié)果表明酶分子有其最佳的ORP水平［9］。因此，可以通過調(diào)節(jié)ORP影響酶的活性進(jìn)而影響胞內(nèi)代謝流分布，最終可有效提高目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)酵終點(diǎn)產(chǎn)量。

菊芋具有生長適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)量高等天然作物優(yōu)勢，且菊芋塊莖相對木質(zhì)纖維素原料更易水解而獲得可發(fā)酵糖，可作為生物丁醇發(fā)酵生產(chǎn)的理想底物［10－11］。然而，由于菊芋塊莖酸解液中的發(fā)酵糖主要為葡萄糖和果糖的混合糖體系，菌體在以混合糖為底物進(jìn)行的丁醇發(fā)酵過程中存在顯著的碳源阻遏效應(yīng)（carbon catabolite repression，CCR），即菌體細(xì)胞優(yōu)先利用葡萄糖，果糖利用極其緩慢，直至葡萄糖消耗殆盡后果糖代謝才開始緩慢進(jìn)行。丁醇發(fā)酵過程是典型的雙相發(fā)酵體系，即菌體首先主要代謝生成乙酸和丁酸，稱為產(chǎn)酸期；隨后再將二者吸收轉(zhuǎn)化生成丙酮、丁醇和乙醇等主要溶劑稱為產(chǎn)溶劑期［12］。產(chǎn)酸階段優(yōu)先利用葡萄糖產(chǎn)生的大量有機(jī)酸尤其是丁酸對細(xì)胞有毒性［13－14］。因此CCR效應(yīng)和丁酸毒性使菌體細(xì)胞無法從產(chǎn)酸期順利轉(zhuǎn)變到產(chǎn)溶劑期而導(dǎo)致有機(jī)酸過度積累，最終使得發(fā)酵提前終止［15］，即典型的“酸崩潰”現(xiàn)象［16］。

通過前期研究表明，控制以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程的ORP不低于－460mV能夠有效防止“酸崩潰”現(xiàn)象的發(fā)生。本文通過對比最佳ORP調(diào)控下的發(fā)酵過程與無控ORP發(fā)酵過程的底物消耗，菌體生長，產(chǎn)物生成以及胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物含量（輔酶A酯類化合物，能量狀態(tài)，還原力水平和糖酵解途徑中間化合物），旨在探究ORP調(diào)控對以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程的影響。

1 實(shí)驗材料和方法

1.1 菌種

作者實(shí)驗室馴化保存的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌ClostridiumacetobutylicumL7。

1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖11，果糖44，乙酸銨2.76，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，對氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，酵母粉2，初始pH值5.5。

滅菌前向裝有活化培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的點(diǎn)滴瓶充氮?dú)?min，壓蓋。

培養(yǎng)基滅菌條件均為121℃，15min。

1.3 培養(yǎng)條件

菌種活化培養(yǎng)：將5mL冷凍保藏的菌種接種于裝有100mL活化培養(yǎng)基點(diǎn)滴瓶中，37.5℃培養(yǎng)20h。

種子培養(yǎng)：將充分活化的菌種以10%的接種量接種于100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37.5℃培養(yǎng)24h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：預(yù)先向裝有滅菌后培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中通無菌氮?dú)?0min，以排除發(fā)酵培養(yǎng)基中溶解的氧氣，然后將經(jīng)過搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)后的種子接入發(fā)酵罐中，接種量10%，設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速150r／min，溫度37.5℃。

例如，教師可以將學(xué)生分成不同小組，合作探究教材中的案例，自主搜集資料，從不同角度進(jìn)行思考，無形中鍛煉學(xué)生解決問題和分析整理的能力。此外，學(xué)生在小組學(xué)習(xí)中更容易積極表達(dá)自身的不同看法，在提高自主學(xué)習(xí)積極性和會計專業(yè)核心素養(yǎng)的同時，啟迪智慧，將學(xué)生快速培養(yǎng)成社會所需人才。

1.4 ORP調(diào)控策略

控制發(fā)酵全程ORP不低于－460mV將ORP電極顯示系統(tǒng)連接繼電器和控制器（蠕動泵），當(dāng)ORP顯示數(shù)值低于－460mV時，繼電器吸合，自動開啟控制器，系統(tǒng)通過控制器向發(fā)酵培養(yǎng)基泵入無菌空氣直至ORP顯示數(shù)值高于－457mV停止。隨著發(fā)酵進(jìn)行，ORP發(fā)生變化，當(dāng)ORP顯示數(shù)值再次到達(dá)－460mV時，系統(tǒng)按上述方式開啟新的調(diào)控。通過調(diào)控裝置可以控制發(fā)酵全過程ORP下限不低于－460mV。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體濃度測定方法

在620nm處測定菌體的吸光度作為菌體濃度（OD620），細(xì)胞干重（dry cell weight，DCW，g／L）由以下公式計算得到。

DCW＝0.8009×OD620

1.5.2 糖濃度測定

葡萄糖濃度使用SBA－40C生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）測定，總還原糖濃度采用DNS法測定，果糖濃度為總還原糖濃度與葡萄糖濃度之差。

1.5.3 丙酮、丁醇及乙醇濃度的測定

發(fā)酵液中丙酮、丁醇和乙醇濃度采用氣相色譜法測定。色譜分離條件：毛細(xì)管色譜柱Agilent HP－INNOWAX（30cm×0.25mm×0.50μm），柱溫：100℃，進(jìn)樣口溫度250℃，F(xiàn)ID檢測器溫度300℃，H2流速40mL／min，空氣流速400mL／min，載氣N2流速30mL／min，進(jìn)樣量0.2μL，分流比50∶1，內(nèi)標(biāo)物為異丁醇。

1.5.4 乙酸和丁酸濃度的測定

乙酸和丁酸濃度使用Waters 1525高效液相色譜測定，色譜分離條件：Aminex HPX－87H有機(jī)酸分析柱（30cm×7.8mm；Bio－Rad，Hercules），流動相為5mmol／L H2SO4，流速0.5mL／min，進(jìn)樣量20μL，柱溫50℃，PDA檢測器檢測波長210nm。

1.5.5 胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物提取和測定

（1）淬滅方法

用注射器快速抽取10mL發(fā)酵液，加入到裝有30mL，預(yù)冷至－40℃、60%甲醇（體積比，下同）的50mL離心管中，搖勻，瞬間淬滅。

（2）提取方法

發(fā)酵液和甲醇淬滅液混合均勻后在－10℃10000r／min離心5min。離心完畢去上清，沉淀加5mL預(yù)冷至－40℃、60%的甲醇洗滌，再次離心，條件同上。沉淀加入1mL、75%的乙醇，混勻后放入90℃水浴中加熱10min，加熱完畢后放入液氮中迅速冷卻。將樣品取出解凍后在－10℃10000r／min離心8min，上清液用于LC－ESI／MS法對代謝物進(jìn)行定量分析。

（3）LC－ESI／MS分析條件

色譜條件：色譜柱為X Bridge BEH Amide Column XP（2.5μm，2.1×100mm，Waters）；柱溫25℃；流動相A為10mmol／L醋酸氨溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫，洗脫條件見表1，流速200μL／min；進(jìn)樣量10μL。

表1 液質(zhì)聯(lián)用梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件：TSQ Quantum Ultra液質(zhì)聯(lián)用儀（Thermo Scientific）；電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI）；離子化模式為正模式和負(fù)模式；噴霧電壓3.0kV（正離子掃描模式），2.5kV（負(fù)離子掃描模式）；鞘氣設(shè)定為35units，輔助氣設(shè)定為10units；離子源氣化溫度250℃；毛細(xì)管溫度340℃；掃描采用選擇反應(yīng)監(jiān)測（selected reaction monitoring，SRM）模式；采集時間均為0.2s，碰撞氣采用氬氣，碰撞氣壓力1.5mTorr。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中的菌體生長、底物消耗和產(chǎn)物生成

以混合糖為底物，ORP調(diào)控下的丁醇發(fā)酵和無控ORP條件下的丁醇發(fā)酵結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明ORP調(diào)控能夠顯著提高發(fā)酵過程混合糖尤其是果糖的利用率，有效降低發(fā)酵終點(diǎn)殘?zhí)菨舛炔⑻岣甙l(fā)酵過程中的菌體濃度和溶劑產(chǎn)量。發(fā)酵終點(diǎn)時，空白對照組和ORP調(diào)控組葡萄糖均被完全消耗，空白對照組果糖剩余30.82g／L，而ORP調(diào)控組果糖剩余僅為1.38g／L。ORP調(diào)控組，發(fā)酵時間為96h，但是空白對照組在發(fā)酵72h以后，發(fā)酵液中溶劑、有機(jī)酸及殘?zhí)菨舛茸兓瘶O其微弱，發(fā)酵出現(xiàn)提前終止的特征。丁醇發(fā)酵過程是典型的雙相發(fā)酵，即菌體首先主要代謝生成乙酸和丁酸，隨后再將二者吸收轉(zhuǎn)化生成丙酮、丁醇和乙醇等主要溶劑。表2結(jié)果表明發(fā)酵終點(diǎn)的有機(jī)酸濃度差別不大，但從圖1的pH值變化曲線可以看出，有機(jī)酸的積累過程不同。在ORP調(diào)控下的丁醇發(fā)酵過程存在著兩個明顯的有機(jī)酸重吸收階段，分別出現(xiàn)在葡萄糖代謝階段（12h到24h）和果糖代謝階段（60h到72h），發(fā)酵后期培養(yǎng)基中的有機(jī)酸積累是第二階段重吸收后產(chǎn)生的。而空白對照組發(fā)酵過程中僅存在一個明顯的有機(jī)酸重吸收過程，即出現(xiàn)在葡萄糖代謝階段（12h到24h），果糖緩慢代謝所產(chǎn)生的有機(jī)酸由于缺乏足夠的還原力而無法被重吸收。

表2 ORP調(diào)控組與及空白對照組的丁醇發(fā)酵結(jié)果

2.2 發(fā)酵過程中的pH值和ORP變化

如圖1所示，在整個發(fā)酵過程中，ORP調(diào)控組的pH值高于空白對照組pH值，說明在不進(jìn)行ORP調(diào)控的發(fā)酵過程中有更多的有機(jī)酸積累，因此菌體受到有機(jī)酸尤其是丁酸的毒害作用更強(qiáng)，導(dǎo)致“酸崩潰”現(xiàn)象的發(fā)生。對比發(fā)酵全程ORP變化可以發(fā)現(xiàn)，ORP調(diào)控的發(fā)酵過程ORP變化曲線在24h到60h之間有一個明顯的波形突起（－423mV到－460mV），在這個波形突起的期間，發(fā)生從產(chǎn)酸期到產(chǎn)溶劑期的轉(zhuǎn)變［17］。空白對照組的ORP在達(dá)到最低點(diǎn)（－516mV）后開始緩慢上升，相應(yīng)的，在果糖緩慢代謝利用的發(fā)酵過程中未出現(xiàn)明顯的有機(jī)酸重吸收過程，實(shí)驗結(jié)果表明ORP的變化與從產(chǎn)酸期到產(chǎn)溶劑期的轉(zhuǎn)變之間存在一定關(guān)聯(lián)性。

2.3 發(fā)酵過程中胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物含量變化

為探究以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程中發(fā)生“酸崩潰”的原因和ORP調(diào)控機(jī)理，對代謝過程中的胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物進(jìn)行了提取和定量分析，結(jié)果為兩組批次重復(fù)實(shí)驗結(jié)果的平均值。主要對關(guān)鍵的輔酶A酯類化合物，能量狀態(tài)，還原力水平和糖酵解途徑中間化合物進(jìn)行了分析，待測化合物的質(zhì)譜測定條件優(yōu)化結(jié)果見表3。

圖1 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中pH值和ORP變化曲線

表3 SRM模式下使用的代謝物質(zhì)譜碰撞參數(shù)

輔酶A酯類化合物在丁醇代謝合成過程中非常重要，從糖酵解過程產(chǎn)生的丙酮酸生成乙酰輔酶A過程開始，輔酶A酯類化合物經(jīng)過逐步還原，生成丁醇。對比圖2（a）和圖2（b）不難看出，在24h到72h之間，空白對照組和ORP調(diào)控組的輔酶A酯類化合物含量變化趨勢明顯不同。空白對照組，在24h到48h之間，菌體產(chǎn)酸較快，生成輔酶A酯類化合物，所以輔酶A酯類化合物含量呈上升趨勢，在48h到72h之間，由于有機(jī)酸對細(xì)胞的毒害導(dǎo)致細(xì)胞裂解，從而導(dǎo)致輔酶A酯類化合物含量下降。ORP調(diào)控組，在24h到36h之間，有機(jī)酸還在進(jìn)行微弱的重吸收過程，所以輔酶A酯類化合物含量稍有下降，在36h到60h之間，由于菌體利用果糖產(chǎn)酸，輔酶A酯類化合物濃度升高，在60h到72h之間，有機(jī)酸快速被重吸收，輔酶A酯類化合物含量也出現(xiàn)明顯下降。

圖2 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中輔酶A酯類化合物含量變化曲線

對于丙酮丁醇梭菌，其細(xì)胞內(nèi)部pH值比外界環(huán)境要高，以維持其生長和代謝活動正常進(jìn)行［18］。在丁醇發(fā)酵過程中菌體自身產(chǎn)生的乙酸和丁酸會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，尤其是丁酸的解偶聯(lián)作用能夠降低菌體維持細(xì)胞內(nèi)外ΔpH的能力。當(dāng)菌體內(nèi)pH值降低時，菌體就會采用消耗ATP的方式將細(xì)胞內(nèi)的H＋外排。因此，通過細(xì)胞內(nèi)ATP含量可以推測菌體對外部有機(jī)酸毒性的抵抗能力。對比圖3（a）和圖3（b）可以看出，菌體在快速利用葡萄糖時大量生成ATP，在24h到60h之間ATP含量非常低，大量ATP被用于抵抗外部有機(jī)酸的毒性。對于空白對照組，整個發(fā)酵過程ATP含量呈單調(diào)下降趨勢，直至發(fā)酵結(jié)束。而ORP調(diào)控下，菌體在經(jīng)歷了36h的極低ATP水平后，由于有機(jī)酸重吸收開啟，菌體開始快速生成ATP。從發(fā)酵36h至發(fā)酵結(jié)束，ORP調(diào)控組菌體內(nèi)的能荷（energy charge，EC）高于空白對照組，表明ORP調(diào)控對細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)有調(diào)節(jié)作用。

圖3 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中能量狀態(tài)變化曲線

細(xì)胞內(nèi)眾多的反應(yīng)都受到NADH和NAD＋比例的調(diào)節(jié)，對于丁醇發(fā)酵而言，每生成1mol丁醇需要消耗4mol NADH。因此NADH和NAD＋的水平對于丁醇發(fā)酵而言至關(guān)重要。嚴(yán)格厭氧的丙酮丁醇梭菌解除氧毒害作用機(jī)理方面直接與NADH和NAD＋水平有關(guān)［19］，因此通過向培養(yǎng)基中通入無菌空氣調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的培養(yǎng)基ORP對于菌體內(nèi)的NADH和NAD＋水平也有著重要的調(diào)節(jié)作用。對比圖4（a）和圖4（b）發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期菌體利用葡萄糖迅速產(chǎn)酸，NADH大量生成，NADH／NAD＋也較高，空白對照組和ORP調(diào)控組NADH／NAD＋均為0.27。隨后隨著有機(jī)酸重吸收過程進(jìn)行，NADH逐漸被消耗。在24h到60h之間，空白對照組NADH／NAD＋呈下降趨勢，而ORP調(diào)控下NADH／NAD＋上先升后下降，表明ORP調(diào)控能夠調(diào)整細(xì)胞內(nèi)還原力水平。在24h到60h期間，NADH／NAD＋一直處于0.03到0.09的較低水平，使得從產(chǎn)酸期到產(chǎn)溶劑期過渡緩慢，延長了發(fā)酵時間。

圖4 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中還原力水平變化曲線

磷酸化是葡萄糖和果糖進(jìn)入細(xì)胞的第一步反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)磷酸化糖類的水平在一定程度上能夠反映糖類進(jìn)入細(xì)胞情況以及糖酵解過程的強(qiáng)弱。為了考察ORP調(diào)控組和空白對照組發(fā)酵過程中菌體對糖的利用，對胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量進(jìn)行了比較。對比圖5（a）和圖5（b）可以看出，在發(fā)酵前48h空白對照組和ORP調(diào)控組己糖單磷酸和己糖二磷酸含量變化趨勢相同，都呈單調(diào)下降趨勢，因為菌體在發(fā)酵前24h快速利用葡萄糖，糖酵解作用強(qiáng)，在24h到48h之間，糖酵解作用減弱，胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量下降。在48h以后，在ORP調(diào)控組和空白對照組胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量出現(xiàn)相反趨勢，空白對照組中有機(jī)酸的毒害作用導(dǎo)致菌體逐漸裂解死亡，胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量也出現(xiàn)下降，而ORP調(diào)控組菌體葡萄糖利用完畢并經(jīng)過一段延遲時間后，開始快速利用果糖進(jìn)行糖酵解，胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量快速升高。ORP調(diào)控組發(fā)酵72h以后胞內(nèi)己糖單磷酸和己糖二磷酸含量開始下降，這是因為隨著發(fā)酵液中丁醇濃度的提高，細(xì)胞活性降低，對糖的利用減慢，糖酵解作用開始減弱。丙酮酸是糖酵解代謝途徑的終產(chǎn)物，丙酮酸到乙酰輔酶A代謝流決定了底物碳流流向溶劑的多少。對比圖5（a）和圖5（b）可以看出，在12h和24h之間，ORP調(diào)控組的丙酮酸含量要高于空白對照組，這可能是由于通氣改變了丙酮酸到乙酰輔酶A的代謝流向。因為丙酮酸經(jīng)酶催化裂解形成乙酰輔酶A的代謝途徑有兩條，一條代謝途徑是丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體催化裂解生成乙酰輔酶A和CO2，另一條代謝途徑是丙酮酸經(jīng)嚴(yán)格厭氧的丙酮酸甲酸裂解酶催化生成甲酸和乙酰輔酶A［20］，通空氣能夠抑制丙酮酸甲酸裂解酶活性從而使丙酮酸含量上升。另外，ORP調(diào)控條件下的發(fā)酵過程中，由于氧氣的脅迫導(dǎo)致胞內(nèi)海藻糖含量的提高。這一現(xiàn)象已在對釀酒酵母進(jìn)行的乙醇發(fā)酵研究中得到驗證，在高乙醇濃度、高滲透壓、溶解氧和熱等外界脅迫條件下，釀酒酵母胞內(nèi)海藻糖含量也有提高［21－24］。

圖5 空白對照組和ORP調(diào)控組發(fā)酵過程中糖酵解途徑中間化合物和海藻糖含量變化曲線

3 結(jié) 論

葡萄糖和果糖混合糖模擬菊芋塊為底物的丁醇發(fā)酵過程中存在的果糖利用率和丁醇產(chǎn)量低，有機(jī)酸積累過多等問題，其原因主要是菌體細(xì)胞內(nèi)還原力不足，發(fā)酵后期難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)酸期向產(chǎn)溶劑期的轉(zhuǎn)變，致使發(fā)酵體系有機(jī)酸尤其是丁酸過量積累，最終導(dǎo)致發(fā)酵提前終止。本工作采取ORP調(diào)控的方式調(diào)節(jié)以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程，通過改變發(fā)酵過程中細(xì)胞內(nèi)還原力水平，能量狀態(tài)和碳源代謝流向，實(shí)現(xiàn)對發(fā)酵過程調(diào)控，使發(fā)酵終點(diǎn)丁醇濃度由ORP調(diào)控前的3.39g／L提高到11.65g／L。研究結(jié)果證明ORP調(diào)控是一種簡單而有效的丁醇發(fā)酵工藝優(yōu)化策略，能夠有效緩解以葡萄糖和果糖混合糖為底物的丁醇發(fā)酵過程中出現(xiàn)的“酸崩潰”現(xiàn)象。

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