1,25-二羥維生素D3調節NF-κB通路對減輕海水吸入型急性肺損傷的作用

張敏龍 王 莉 金發光

1,25-二羥維生素D3調節NF-κB通路對減輕海水吸入型急性肺損傷的作用

張敏龍 王 莉 金發光

目的探討海水吸入型肺損傷大鼠肺組織中核因子-κB(NF-κB)通路的變化以及1,25-二羥維生素D3對其干預作用。 方法32只大鼠完全隨機分為空白對照組、海水處理組、VitD3預處理組和地塞米松處理組，每組8只。采用氣管內滴注海水(3 ml/kg)的方法制作海水吸入型急性肺損傷大鼠模型，觀察肺部病理變化，用ELISA法檢測肺組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的含量，Western blot檢測磷酸化NF-κB的表達變化，免疫熒光觀察A549細胞NF-κB核轉移情況。 結果海水吸入4 h后，大鼠肺部損傷明顯，TNF-α和IL-1β的含量增高，NF-κB磷酸化以及核轉移增多；1,25-二羥維生素D3預處理顯著減輕了海水吸入導致的急性肺損傷，減少了炎癥因子的釋放，并且抑制了NF-κB磷酸化以及核轉移。 結論NF-κB通路參與了海水吸入型肺損傷的發生發展，1,25-二羥維生素D3能夠通過抑制NF-κB信號通路減輕肺損傷。

急性肺損傷； 海水； 1,25-二羥維生素D3； 核因子-κB

淹溺是引起死亡最常見的原因之一。據估計，全世界每年因淹溺導致的死亡接近150萬人，而海水淹溺占據了其中的一大部分[1]。盡管經過了幾十年的研究，海水淹溺的病死率仍居高不下。海水吸入可以引起急性肺損傷(acute lung injury, ALI)，甚至發展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)。許多海水吸入急性肺損傷動物模型表明，炎癥細胞大量滲入到肺泡腔以及肺間質導致了肺組織嚴重的炎癥反應，同時這些炎癥細胞分泌大量的炎癥因子和活性氧基團，進一步加重了肺損傷。

核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)通路是被廣泛認可的參與炎癥反應的細胞內信號通路。NF-κB分子在幾乎所有的細胞中都有表達，并且可以調節許多與免疫和急性炎癥反應相關的基因[2-3]。許多因素如炎癥因子的刺激都可以激活NF-κB通路。NF-κB通路的激活首先通過IκB激酶(IKK)使IκBs(inhibitors of κB)磷酸化，然后下游的NF-κB磷酸化并轉移至細胞核，最終引起一系列炎癥因子的轉錄[4-5]。

1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2VitD3]是維生素D3的生物活性代謝產物，除了調節鈣和磷的代謝外，還具有其他的生物活性。最近的研究發現1,25-二羥維生素D3與炎癥反應相關。在脂多糖誘導的急性肺損傷中，1,25-二羥維生素D3抑制了中性粒細胞的浸潤并且減少了炎癥因子的產生[6]。本研究通過復制大鼠海水吸入型急性肺損傷(seawater aspiration-induced, ALI)模型，觀察1,25-二羥維生素D3的治療作用，并進一步探討NF-κB信號通路參與其中的相關機制。地塞米松能夠用于ALI/ARDS的臨床治療，并且已經證實對海水吸入型急性肺損傷具有良好的治療效果[7]。因此，我們選擇地塞米松作為陽性治療對照。

材料與方法

一、 實驗試劑

1,25-二羥維生素D3以及地塞米松購自Sigma公司，高效液相(high performance liquid Chromatography, HPLC)檢測純度達到99%以上，1,25-二羥維生素D3用10%甲醇-1‰Triton X-100溶液制成的混懸液灌胃給藥，地塞米松用5‰羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose)溶液制成混懸液灌胃給藥。配方海水按照中國國家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我國東南沿海海水的主要成分配制：NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141 g/L，NaHCO30.202 g/L，KCl 0.725 g/L，NaBr0.083 g/L；pH 8.2，相對密度1.05，滲透壓1300 mmol/L。TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒購于R&D公司。NF-κB p65和磷酸化NF-κB(pNF-κB) p65 抗體購于Cell Signaling公司，β-actin抗體購于Santa Cruz公司。其他試劑均為國產或進口分析純。

二、實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠，清潔級，體重220 g左右，第四軍醫大學實驗動物中心提供。采用完全隨機方法將實驗大鼠分為四組：A：空白對照組，B：海水淹溺組，C：VitD3預處理組，D：地塞米松預處理組，每組8只。造模前1 h給藥，各組大鼠分別灌胃：A和B組：生理鹽水；C組：25 μg/kgVitD3；D組：10 mg/kg地塞米松。B、C、D組大鼠制作海水吸入型急性肺損傷模型，造模4 h后放血處死動物收集肺組織標本。動物模型的制備：大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)麻醉，仰臥固定，頸正中切口暴露氣管，取1 ml的注射器插入氣管，在4 min之內緩慢注入3 ml/kg海水。

三、細胞培養及處理

A549細胞用含有100 U/ml青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養液在5% CO2培養箱中37 ℃進行培養。海水刺激前1 h，分別用10-6MVitD3和10-6M地塞米松進行預處理，之后用25%海水(1 ml培養液中含0.25 ml海水)刺激細胞4 h。

四、檢測指標及方法

1. 肺組織病理學檢查：取各組大鼠左下肺組織迅速放入4%多聚甲醛液中固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精—伊紅染色(hematoxylin-eosin staining, HE)，光學顯微鏡觀察。

2. 肺組織濕干比(W/D)測定：取每只大鼠相同部位肺組織，擦拭血跡后立即稱量得肺組織濕重，將肺組織標本置于70 ℃烘干箱中72 h至恒重，稱量干重，計算濕干比。

3. TNF-α和IL-1β檢測：用ELISA的方法檢測肺組織勻漿中的TNF-α和IL-1β的含量，具體步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

4.Western-blot檢測NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白表達：取適量的肺組織，加入蛋白裂解液冰上勻漿，離心收集上清，定量，沸水煮15 min，電泳，然后轉膜。將已做好標記的膜放入封閉液中，室溫振蕩2 h封閉；加入1︰1000稀釋的一抗，4 ℃過夜，加入1︰5000稀釋羊抗兔二抗，37℃溫育1 h，增強化學發光法 (enhanced chemiluminescence, ECL)顯色，避光保存并照相，做灰度掃描處理。

5. 免疫熒光觀察A549細胞中NF-κB核轉位：進行細胞爬片，并對細胞進行處理，處理后的細胞用4%多聚甲醛液固定10 min，0.1% TritonX-100穿透處理10 min，然后山羊血清封閉30 min，加入1︰100稀釋的NF-κB p65抗體4 ℃過夜，之后加入1︰200稀釋的異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的二抗，最后DAPI染核，封片，熒光顯微鏡觀察并照相。

五、統計學方法

結 果

一、 病理學檢測結果

空白對照組大鼠肺泡結構清晰，未見明顯的病理結構變化；海水處理組大鼠肺組織結構紊亂，局部肺不張，肺間質可見出血、水腫，并可見大量炎癥細胞浸潤；VitD3和地塞米松預處理組大鼠肺組織結構尚清晰，間質水腫、出血和炎細胞浸潤等改變較海水處理組大鼠明顯減輕，見圖1。

注：A:空白對照組；B：海水4 h組；B；BC：VitD3預處理組；D：地塞米松預處理組

二、肺組織濕干比(W/D)結果

吸入海水4 h后，肺組織濕干比明顯增加(P<0.001)，VitD3和地塞米松預處理組能夠明顯降低肺組織含水量，減小濕干比(P<0.05)，但VitD3預處理組效果好于地塞米松預處理組，見圖2。

注：A：空白對照組；B：海水4 h組；C：VitD3預處理組；D：地塞米松預處理組；***P<0.001 vs. 空白對照組；##P<0.01，#P<0.05 vs. 海水4 h組

三、ELISA檢測結果

與空白對照組相比，海水處理組大鼠肺組織中TNF-α和IL-1β明顯升高(P<0.001)，VitD3和地塞米松預處理組能夠明顯降低炎癥因子含量(P<0.01)，但VitD3預處理組效果好于地塞米松預處理組，見圖3。

注：A：空白對照組；B：海水4 h組；C：VitD3預處理組；；BD：地塞米松預處理組；***P<0.001 vs. 空白對照組；###P<0.001，##P<0.01 vs. 海水4 h組

四、Western blot檢測結果

與空白對照組相比，海水處理組大鼠肺組織中pNF-κB表達顯著增加(P<0.001)，VitD3和地塞米松預處理組能夠明顯抑制NF-κB的磷酸化(P<0.05)，但VitD3預處理組效果好于地塞米松預處理組，見圖4。

五、免疫熒光結果

與空白對照組對比，海水處理A549細胞中NF-κB明顯出現核轉移，而VitD3和地塞米松預處理組能夠抑制NF-κB的核轉移，見圖5。

討 論

海水吸入型肺損傷最主要的病理生理變化是炎癥反應和肺水腫。由于海水的高滲特性，當其吸入肺泡時會迅速引起肺水腫。肺組織屏障損傷導致炎癥細胞大量滲出，多種炎癥因子釋放，也表明了肺部的急性炎癥反應是海水吸入肺損傷的主要發病機制。在本研究中，我們觀察到海水吸入4 h后，大鼠肺泡中伴有出血以及大量炎細胞浸潤，肺組織伴有明顯的水腫，炎癥因子的表達也增高。通過1,25-二羥維生素D3的預處理，肺水腫和炎癥反應得到了一定程度的減輕。

盡管有很多藥物用于治療ALI和ARDS，但這些治療并沒有明顯的降低病死率[8]。1,25-二羥維生素D3是維生素D3的活性代謝產物，最終通過結合維生素D受體進一步調控下游基因[9]。大量研究表明，在許多細胞模型如人類血細胞、樹突狀細胞、人角質成纖維細胞以及鼻息肉成纖維細胞中，1,25-二羥維生素D3起到了抑制炎癥反應的作用[10-13]。另外，1,25-二羥維生素D3在脂多糖誘導的肺損傷中具有抑制炎癥細胞滲出的作用。

NF-κB信號通路與炎癥反應有密切的聯系，在海水吸入型肺損傷中該通路的激活也起到了重要的作用[14-15]。海水刺激后，大量被釋放的細胞因子會導致IκBs的降解，與此同時，NF-κB磷酸化并轉移至細胞核，從而與目標基因結合并調控這些基因的表達[16]。該過程會引起NF-κB依賴的炎癥因子的表達和釋放，這些炎癥因子最終又會促進肺組織屏障通透性的增加和炎細胞的浸潤，從而加重組織的損傷。在我們的試驗中，海水吸入導致大鼠肺組織中磷酸化NF-κB表達增加，同時免疫熒光表明，海水刺激后NF-κB核轉位增加。而1,25-二羥維生素D3的預處理可抑制肺組織中磷酸化NF-κB表達的增加，同時也可抑制NF-κB的核轉位。

本實驗結果證明了NF-κB信號通路在海水吸入型肺損傷中發揮了重要的作用。海水吸入刺激誘導了NF-κB的磷酸化和核轉位，而1,25-二羥維生素D3的預處理可減輕肺水腫和肺部炎癥反應，并且抑制了NF-κB的磷酸化和核轉位。這些結果部分的解釋了1,25-二羥維生素D3在海水吸入型肺損傷中的作用機制，并且為1,25-二羥維生素D3的臨床應用提供了實驗依據。

圖5 各組細胞免疫熒光檢測結果

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(本文編輯：王亞南)

張敏龍，王 莉，金發光. 1,25-二羥維生素D3調節NF-κB通路對減輕海水吸入型急性肺損傷的作用[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2014， 7(5)： 512-517.

1,25-(OH)2VitD3alleviates seawater aspiration-induced acute lung injury by regulating NF-κB pathway

ZhangMinlong,WangLi,JinFaguang

(DepartmentofRespiratoryDisease,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

JinFaguang,Email：jinfag@fmmu.edu.cn

Objective To observe the change of NF-κB pathway in seawater aspiration-induced acute lung injury and the intervention effect of 1,25-(OH)2VitD3. Methods A total of 32 rats were randomly divided into 4 groups: normal control group, seawater group, VitD3pre-treated group and dexamethasone pre-treated group. Every group contains 8 rats. Seawater aspiration-induced acute lung injury model was made by seawater instillation (3 ml/kg) into the airway. Pathology detection was carried out after modeling. The contents of tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin-1β(IL-1β) were measured by ELISA and the expression of phospho-NF-κB was measured by western blot. Immunofluorescence was used to detect the nuclear translocation of NF-κB in A549 cells. Results After 4 h seawater stimulation, lung injury was obvious and the contents of TNF-α and IL-1β were increased. The expression of phospho-NF-κB was up-regulated and nuclear translocation was enhanced. However, pre-treatment of 1,25-(OH)2VitD3attenuated lung injury, suppressed the release of pro-inflammation cytokines, and inhibited the expression of phospho-NF-κB and the nuclear translocation. Conclusion NF-κB pathway plays an important part in the seawater aspiration-induced acute lung injury and 1,25-(OH)2VitD3attenuated lung injury by inhibiting NF-κB pathway.

Acute lung injury; Seawater; 1,25-(OH)2VitD3; Nuclear factor-kappa B

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2014.05.009

國家自然科學基金面上項目(81270124)

710032 西安，第四軍醫大學唐都醫院呼吸內科

金發光，Email： jinfag@fmmu.edu.cn

R563

A

2014-05-05)