miR-126在人結腸癌細胞中的表達及其對結腸癌 細胞生物學行為的影響

林孟波，王金泗，薛芳沁，黃若磊，李偉華

論著·基礎

miR-126在人結腸癌細胞中的表達及其對結腸癌 細胞生物學行為的影響

林孟波，王金泗，薛芳沁，黃若磊，李偉華

目的探討MicroRNA-126(miR-126)在人結腸癌細胞中的表達以及對結腸癌細胞生物學行為的影響。方法應用熒光PCR定量檢測60例結腸癌患者的結腸癌組織以及癌旁組織中miR-126的表達，共60對，再測定5株結腸癌細胞(SW480、HT29、HCT116、LOVO、SW620)中的表達情況;CCK-8法、劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并進一步通過體外實驗研究miR-126對結腸癌細胞生物學行為的影響。結果與癌旁組織細胞比較，miR-126在結腸癌細胞中表達下降(95.0% vs.55.0%，P<0.05)，發生轉移者與未發生轉移者比較，差異有統計學意義(25.0% vs. 75.0%，P<0.05)。miR-126可以抑制SW480細胞的生長及其侵襲轉移，有基質膠Transwell實驗中，轉染組及空白對照組細胞遷移數分別為(10.0±4.3)個和(258.0±30.6)個；無基質膠的Transwell實驗中，分別為(84.0±13.2)個和(335.0±27.3)個，差異均有統計學意義(P<0.05)。miR-126高表達可以增強癌細胞對奧沙利鉑的敏感性。結論miR-126可明顯抑制結腸癌細胞的發生發展，影響多種結腸癌細胞株生物學行為。

miR-126；結腸癌細胞；生物學行為；影響

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，好發于直腸乙狀結腸交界處，近年來發病率逐年上升，2012年《腫瘤登記年報》排名第3位，發病率為29.44/萬，病死率排第5位，為14.23/萬。結腸癌組織學主要為腺癌、黏液腺癌和未分化癌，危害極大[1]。最近的研究表明miR-126在肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達均下降，但其在結腸癌中表達是否下降仍然不很清楚，其在結腸癌發生發展中的分子機制也不甚了解。現通過基因表達芯片技術了解miR-126在結腸癌組織、癌旁組織和5株人結腸癌細胞系中的表達及變化，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2013年1—9月我院腫瘤科確診為結腸癌手術患者的腫瘤組織和癌旁組織(癌旁0.5 cm和癌旁15 cm)，共60例，患者在手術前均未進行放、化療。男40例，女20例，年齡35～65(50.0±1.6)歲。組織學類型：高分化13例，中分化17例，低分化30例。Dukes分期：A期4例，B期23例，C期20例，D期13例。有淋巴結轉移36例，無淋巴結轉移24例。有遠處轉移13例，無遠處轉移47例，所有組織于離體15 min內置于液氮罐中保存。

1.2 細胞系、載體及試劑 5株人結腸癌細胞系SW480、HT29、HCT116、LOVO 和 SW620 均購買于行知生物科技有限公司，HEK293T細胞株購自美國ATCC(美國模式菌種收集中心)。慢病毒表達載體pGIPZ、慢病毒包裝質粒pCD/NL-BHDDD、膜蛋白表達質粒pLTRG均購自深圳市寶珠生物科技有限公司。Lipofectamine2000購自上海葉舟生物科技有限公司，快速限制性內切酶CLaI、MLuI、T4DNA連接酶均購自美國Fermentas公司,CCK-8試劑盒、DMEM培養液、地高辛標記hsa-miR-126寡核苷酸探針購自丹麥Exiqon公司。胎牛血清購自上海拜力生物科技有限公司，總RNA的提取液，IRS-l兔單克隆抗體購自Epitomics公司。

1.3 研究方法

1.3.1 細胞培養：將5種結腸癌細胞株(SW480、HT29、HCT116、LOVO、SW620)，在含有100 ml/L胎牛血清的1640培養基和DMEM培養液中(37℃ 5% CO2飽和濕度)常規培養，這些細胞株代表的組織各異，分別用來檢測miR-126在各自細胞株的表達，在細胞生長狀態良好時(取對數生長期)用于實驗[3]。SW480主要用于測定細胞的侵襲轉移對細胞生長的影響；SW620用于細胞轉染。分別測定miR-126在各個細胞的表達。

1.3.2 RT-PCR檢測miR-126在結腸癌組織及癌旁細胞中的表達：利用總RNA的提取液，嚴格按照提取液操作說明書提取結腸癌組織和癌旁細胞中總RNA ，CDNA的制備按照All-in-one miRNA qRT-PCR Detection kits，反應體系如下：RNA 2 μg，poly A polymerase(2.5 U/μl,1 μl) ,RTase Mix 1 μl,5×Reaction Buffer 5 μl,加H2O至終體積25 ml。反應條件:37.5℃ 90 min,80℃ 5 min,25℃保存。實施定量的反應體系同樣用All-in-one miRNA qRT-PCR Detection kits說明書進行，反應條件：預期變性90℃ 10 min，90℃ 10 s,退火60℃ 30 s。

1.3.3 miR-126慢病毒表達載體構建：利用Primes軟件設計引物，同時引入CLaI、MLuI酶切位點及引物的序列及末端的保護堿基，根據生物信息技術從數據庫可以查出基因序列為引物序列：5`-CGACGCGTCGGGTTTACAGAACACCCATCA-3`，Reverse:5`-CCATGGGGCACAGCAACAAAAGACT-3`，擴增的片段長度為357 bp,以正常黏膜組織DNA為模,PCR擴增miR-126，在一定的反應條件下，循環擴增。將擴增的產物利用瓊脂漿電泳液電泳，如果發現無雜帶就直接對PCR產物純化回收。經CLaI、MLuI酶切PCR產物，連接到pGIPZ載體上，再經過轉化、挑選單克隆、菌液PCR鑒定陽性菌落制備小量的質粒，通過酶切，測序后得到正確的重組質粒pGIPZ-miR-126。

1.3.4 結腸癌細胞的復制能力：按照CCK-8試劑盒說明進行。將細胞按每孔2×103/150 μl接種于100孔板中繼續培養,每組設3個復孔,分別選取1、3、5、7 d時間點進行檢測,檢測前換液1次,每孔加100 μl新鮮培養基和10 μ1 CCK-8,繼續在37℃ 5% CO2條件下培養2 h,使用酶標儀于550 nm波長檢測光密度值。

1.3.5 劃痕實驗：細胞鋪入8孔板,放入37℃ 5% CO2培養箱中孵育，等到細胞融合達85%以上時,用15 μl微量移液頭在8孔板內水平劃痕,PBS液洗滌3次，每隔24 h在倒置顯微鏡下觀察細胞的遷移情況并拍照[4]。

1.3.6 細胞轉染：轉染前1天，將對數生長期的HCT116細胞接種于8孔培養板。每孔2×105個細胞。24 h培養至細胞融合度 60%時，分為pGIPZ-miR-126轉染組、空白對照組(pGIPZ)。按照Lipofectamine2000說明書，將2組病毒上清分別感染SW480細胞，感染后72 h熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的發光情況，成功轉染細胞后置于37℃5%CO2的培養箱中培養[5]。

1.4 統計學方法 利用SPSS13.0軟件進行數據處理。組織標本采用配對樣本t檢驗比較miR-126水平差異,熒光定量PCR采用單因素方差分析，體外增殖實驗采用析因設計的方差分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-126在結腸癌組織中表達 應用Real-timePCR檢測60對配對的結腸癌組織中miR-126的表達，結果顯示，癌旁組織中miR-126陽性率為95.0%，明顯高于結腸癌組織的55.0%(P<0.01)。見表1。進一步分析miR-126與結腸癌臨床特點的關系表明，miR-126表達與性別、年齡、癌組織分化程度以及腫塊大小均無明顯的相關性(P>0.05),而無轉移的結腸癌細胞中miR-126的陽性表達率為75.0%，高于已發生侵襲轉移者的25.0%(P<0.05)。見表2。

表1 結腸癌組織和癌旁組織中miR-126的表達 [n(%)]

注：與癌旁組織比較,*P<0.01

表2 miR-126表達與結腸癌臨床特點相關性分析

2.2 miR-126表達對結腸癌細胞生物學行為影響

2.2.1 miR-126表達可抑制SW480細胞生長：利用MTT比色法檢測轉染組和空白對照組SW480細胞的增殖能力，結果顯示隨培養時間的延長，轉染組細胞增殖能力明顯低于空白對照組，提示miR-126具有抑制結腸癌細胞增殖的能力。進一步對2組細胞周期進行檢測發現，miR-126主要阻滯腸癌細胞G1期進程。

2.2.2 miR-126抑制SW480細胞侵襲轉移：利用有基質膠及無基質膠Transwell實驗檢測miR-126對細胞遷移、侵襲能力的作用，經過一段時間的觀察，結果表明，有基質膠的細胞培養36 h后，轉染組及空白對照組細胞遷移數分別為(10.0±4.3)個和(258.0±30.6)個;無基質膠的細胞在培養36 h后計數,轉染組和空白對照組分別為(84.0±13.2)個、(335.0±27.3)個，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2.3 miR-126的表達對結腸癌細胞耐藥性的影響：使用奧沙利鉑(抗癌類藥物)處理細胞，發現轉染組SW480細胞對奧沙利鉑的敏感性明顯高于空白對照組(P<0.05)。說明結腸癌細胞中恢復miR-126的表達可提高癌細胞對化療類藥物的敏感性。通過增加miR-126可以加強化療類藥物的藥效，進一步可以加強對結腸癌的治療。

3 討 論

結腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，結腸癌發病與高脂肪食物和纖維素攝入不足有關。結腸的慢性炎性反應使腸癌的發生率比一般人群高。有結腸息肉者結腸癌發病率是無結腸息肉者的5倍[5]。家族性多發性腸息肉病，癌變的發生率更高。遺傳因素可能也參與結腸癌的發生。其發病率和病死率在世界大多數國家及地區有上升趨勢，給人類的健康帶來嚴重的危害，發生侵襲轉移為其主要死因。MicroRNA(miRNA)是近年新發現的一類非編碼小分子單鏈RNA，長度為21～23個核苷酸。在細胞分化、增殖、凋亡及腫瘤的發生發展等方面具有重要的生物學功能。miR-126參與調節血管生成和維持血管完整性。

miR-126在肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達都會下降，在結腸癌細胞株中特別是高侵襲轉移能力的細胞系中表達下調，尤其是發生侵襲轉移的癌組織中表達降低，高度提示miR-126在結直腸癌侵襲轉移中發揮重要作用[6]。Guo等[7]研究表明miR-126在結腸癌細胞中普遍缺失。本研究表明在結腸癌組織存在miR-126表達下降，并且miR-126表達水平的變化與結腸癌是否發生侵襲轉移密切相關(P<0.05)，與文獻報道相近。體外實驗還證實miR-126可通過抑制結腸癌細胞周期(主要為G1期)進程、促進結腸癌細胞凋亡而發揮抑瘤作用，并可顯著抑制結腸癌細胞遷移及侵襲能力[8]。但是對于miR-126表達方式以及miR-126對結腸癌細胞作用的具體分子機制現在還不甚了解，有待于進一步研究。

本研究表明高表達miR-126的細胞株對轉移性結腸癌一線化療藥物奧沙利鉑的敏感性明顯高于空白對照組，可見在結腸癌細胞中恢復miR-126的表達可抑制結腸癌細胞增殖、侵襲轉移并減少耐藥性的發生，同時也表明增加miR-126的表達可以進一步增加化療藥物的療效。與前期的研究報道相符。化療過程中可以按照周期進行，同時應用使miR-126恢復的藥物治療方法可以使治療效果更好。

加強對結腸癌發生發展的預防，慢性結腸炎患者、結腸息肉患者、男性肥胖者等為易感人群。每年要定期在結腸癌高危人群中進行篩檢，通過檢測miR-126表達的變化防止癌細胞發生轉移[9～11]。最好能早發現、早診斷、早治療，降低疾病的病死率。對已經確診的結腸癌患者最好檢測miR-126表達的變化，指導預后判斷，miR-126表達水平越低患者預后越差。

1 李楠,李夏雨,黃鑠,等.miR-126靶向調控IRSl，SLC7A5及TOM l基因抑制結腸癌的增殖及侵襲轉移[J].中南大學學報，2013,38(8)：809-811.

2 陳芳,周暢,陸艷霞,等.Hsa-miR-186在結腸癌細胞中的表達及作用[J].南方醫科大學學報,2013,33(5):654-660.3 張文鵬,趙紅超,趙敬坤,等.miR-301a在結腸直腸癌組織中的表達及其對結腸癌細胞侵襲[J].外科理論與實踐，2013,18(3)：236-241.4 史留斌,宋寧,王燕,等.真核翻譯起始因子-3c在結腸癌細胞中的表達及其對細胞增殖的影響[J].中國臨床醫學，2013,20(4)：480-483.

5 章福彬,朱斌,唐郡,等.siRNA沉默Musashi-1基因表達對人HCT116結腸癌細胞生物學行為的影響[J].局部手術學雜志，2013,21(6)：604-606.

6 陳衛群,陳和明,孔德勇,等. microRNA-301在胰腺癌中的表達及其臨床意義[J]. 中華檢驗醫學雜志,2010,33(1):62-67.

7 Guo C，Sah JF.The noncoding RNA，miR-126，suppresseSthe growth of neoplastic cellSby targeting phosphatidylinositol 3-kinase singaling and iSfrequently lost in colon cancres[J]. GeneSChromosomeSCancer，2008，47(11)：939.

8 楊愛萍,姜藻,陳靜.Musashi-1、Ki-67 的表達與食管鱗癌的臨床意義[J].中國現代醫生，2009，47(32):58-60.

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10 蘇沐,姜藻.5-FU對SW480細胞Musashi-1基因表達的影響[J].東南大學學報：醫學版,2007，26 (3):198-201．

11 葉任高,陸再英.內科學[M].6版.北京:人民衛生出版社,2005:340-346.

miR-126expressionanditseffectonhumancoloncancercellsinthebiologicalbehaviorofcoloncancercells

LINMengbo,WAGNJinsi,XUEFangqin,HUANGRuolei,LIWeihua.

DepartmentofOncology,FujianProvincialHospital,Fuzhou350001,China

ObjectiveTo investigate the expression of MicroRNA -126 (miR-126) in human colon cancer cellSand itSeffect on biological behavior of colon cancer cells.MethodsSixty patientSwith colon cancer were enrolled in the study. Fluorescence PCR waSused to detect the expression of miR-126 in the cancerouStissueSand in the tissueSadjacent to carcinoma. The expression of miR-126 in the cancerouStissueSpaired up with the expression of miR-126 in the tissueSadjacent to carcinoma,and there were 60 pairSin total. The expression of miR-126 in 5 colon cancer cell lineS(SW480,HT29,HCT116,LOVO,SW620) waSalso detected. The proliferation,migration and invasion ability of the cellSwere measured using CCK 8 assay,scratch experimentSand Transwell assay,respectively. The effect of miR-126 on the biological behaviorSof human colon cancer cellSwaSfurther studied through the experimentSin vitro.ResultsCompared with adjacent normal tissue cells,miR-126 waSdecreased (95.0% vs. 55.0%,P<0.05) in colon cancer cells,and were obviously when cancer metastasiSor invasion iSparticularly evident,when compared with those without metasis,there were significant difference(25.0% vs.75.0%,P<0.05). StudieShave shown that miR-126 can inhibit the growth of SW480 cellSand their invasion and metastasis,Transwell assay with matrigel showed the migration cell number in transfection group and blank control group waS(10.0±4.3) and (258.0±30.6),while Transwell assay without matrigel showed the migration cell number waS(84.0±13.2) and (335.0±27.3) respectively,there were significant differences(P<0.05). miR-126 expression can enhance the sensitivity of cancer cellSto oxaliplatin.ConclusionmiR-126 can inhibit the development of colon cancer cells,the impact of a variety of strainSof the biological behavior of colon cancer cells.

Micro RNA-126;Colon cancer cells; Biological behavior; Impact

350001 福州，福建省立醫院腫瘤外科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.04.021

2013-11-15)