微血管損傷對大鼠記憶行為能力及腦組織淀粉樣蛋白片段的影響

丁玲，肖波，畢方方，李嗇夫，吳平，羅星，湯顯靖

論著·基礎

微血管損傷對大鼠記憶行為能力及腦組織淀粉樣蛋白片段的影響

丁玲，肖波，畢方方，李嗇夫，吳平，羅星，湯顯靖

目的觀察SD大鼠腦微血管損傷后行為學及腦組織內淀粉樣蛋白片段(Aβ)水平變化。方法SD大鼠60只，隨機分為空白對照組、假手術組、造模組各20只。用血栓法制備多發性腦栓塞動物模型，以morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶能力，Westen-blot方法檢測大鼠腦組織內Aβ蛋白水平。結果定位航行實驗中，模型組大鼠找到平臺的潛伏期明顯長于空白對照組和假手術組(P<0.01)，而后2組間差異無統計學意義(P>0.05)；空間探索實驗中，模型組在原平臺所在象限停留的時間明顯短于空白對照組和假手術組(P<0.01)，而后2組間差異無統計學意義(P>0.05)；模型組腦組織Aβ蛋白水平較空白對照組和假手術組明顯升高(P<0.01)，而后2組間差異無統計學意義(P>0.05)。結論大鼠腦微血管損傷后出現學習和記憶能力下降，腦組織Aβ蛋白水平升高，可能促發了阿爾茨海默病的發生。

阿爾茨海默病；腦微血管損傷；淀粉樣蛋白片段，腦組織；大鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)又名老年性癡呆，是一種以進行性認知障礙和記憶損害為特征的神經退行性疾病。淀粉樣蛋白片段(Aβ)被認為是導致AD的直接病理原因，是引起AD腦中其他病理改變的關鍵環節[1]。目前AD的發病機制不明，盡管AD是一個神經變性疾病，越來越多的研究資料顯示，其與血管危險因素和血管發病機制緊密聯系[2]。本研究目的是觀察大鼠腦微血管損傷后大腦是否有Aβ沉積，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：健康成年雄性清潔級SD(Sprangue-Dawley)大鼠60只，5～6月齡，體質量(300±50)g，由中南大學湘雅醫學院實驗動物中心提供；隨機分為空白對照組、假手術組、手術造模組，每組20只。主要試劑及儀器：兔抗Aβ 多克隆抗體(Cell Signaling公司，美國)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)內參抗體(Roche公司，德國)，morris水迷宮視頻分析系統(上海欣軟信息科技有限公司)，Ethovision 圖像自動采集和軟件分析系統(Noldus公司，荷蘭)，HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(武漢大學影像工程公司)。

1.2 動物模型制作

1.2.1 栓子制備：同種異體大鼠左心室內采血1 ml，于37℃溫箱內自然干燥制作成全血凝塊，將其研碎后用200μm篩孔過篩，應用時取血栓栓子1 mg加生理鹽水0.5ml，搖勻成混懸液。

1.2.2 建立腦微血管損傷動物模型：模型組SD大鼠20只：參考文獻[3]方法制作多發栓塞性動物模型，暴露頸總動脈、頸外動脈與頸內動脈，暫時夾閉頸總動脈，于頸外動脈逆行插管，緩慢注入栓子溶液0.3 ml,推注同時開放頸總動脈，使栓子通過頸內動脈進入顱內至大腦各動脈造成多發性腦梗死，然后結扎頸外動脈，縫合皮膚。假手術組20只：手術方法同模型組，只在穿刺時以生理鹽水0.3 ml代替栓子溶液。空白對照組20只：正常喂養，不給任何藥物。

1.3 觀測項目

1.3.1 morris水迷宮觀察大鼠行為：水迷宮池壁上標有東南西北4個入水點，將水池等分為4個象限。訓練期間迷宮外參照物保持不變。

1.3.2 定位航行實驗：存活大鼠飼養1個月后，先將大鼠放入morris水迷宮的水池中(不放平臺)自由游泳2 min使其熟悉迷宮環境。實驗方法歷時5d，每天于固定時間段，每個時間段訓練4次。記錄大鼠在2 min內尋找平臺的時間(逃避潛伏期)。如果大鼠在2 min內未找到平臺，潛伏期記錄為120s。由實驗者將其拿上平臺，在平臺上休息15s再進行下一次實驗。每天以大鼠4次訓練潛伏期的平均值作為大鼠當日的學習成績。

1.3.3 空間探索實驗：定位航行實驗全部結束后，次日進行空間探索實驗。撤去平臺，從任一入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄2 min內大鼠在平臺各象限停留的時間。

1.3.4 Aβ蛋白檢測：實驗結束后處死大鼠使用Westen-blot方法檢測大鼠腦組織內Aβ蛋白水平。因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)在大鼠組織中相對恒定表達，可用GAPDH的光密度作為內參照，目的蛋白光密度與GAPDH光密度比值即為目的蛋白的相對值。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標帶的光密度，得出Aβ的相對值，進行統計學處理。

2 結 果

2.1 行為變化 在定位航行實驗中，模型組大鼠找到平臺的潛伏期均明顯長于空白對照組和假手術組(P<0.01)；空白對照組和假手術組大鼠的潛伏期基本相同(P>0.05)，說明2組大鼠的適應能力和體能情況基本相同。隨學習時間的延長各組的潛伏期均呈遞減趨勢，見圖1。在空間探索實驗中，所有大鼠在原平臺所在象限(第1象限)停留的時間都明顯高于其他象限(P<0.01)，但模型組大鼠在原平臺所在的目標象限停留的時間明顯低于空白對照組和假手術組(P<0.01)，空白對照組和假手術組停留時間基本相同(P>0.05)，見圖2。

圖1 大鼠找到平臺的潛伏期

圖2 大鼠在各象限停留時間

2.2 Aβ蛋白變化 空白對照組與假手術組大鼠腦組織內可見少量Aβ蛋白(0.24±0.06 vs. 0.27±0.12)，2組比較差異無統計學意義(P>0.05)，模型組Aβ蛋白量(0.65±0.28)較空白對照組和假手術組明顯升高(P<0.01)，見圖3。

注：M.Marker；1.空白對照組；2.假手術組；3.模型組

3 討 論

腦微血管一般指腦微小動脈和微小靜脈之間的毛細血管及微血管網，形成了三維立體的網絡結構，是腦微循環的通路，其為直徑<100μm的血管系統，如穿通支動脈、軟腦膜血管等。在生理狀態下，微循環系統為腦組織提供營養，當動脈血流中斷時，會使下游的微循環相繼發生病理性改變，如微小血栓形成、內皮細胞通透性增加、基底膜破裂及炎性反應等，這一系列的缺血“瀑布”反應，導致微循環結構和功能發生損傷，大腦營養、代謝都會出現障礙，最終導致神經元損害[4]。

腔隙性腦梗死為發生于微血管的腦血管疾病。大鼠腦內注射栓子是栓塞性腦缺血模型的常用制備方法，可用來模擬臨床腔隙性腦梗死，從而觀察腦微血管損傷的病理生理變化。本實驗將外源性栓子注入動物體內，造成多發性腦梗死，既往研究表明，本方法造模后栓子在腦內分布廣泛，大腦中動脈分布區域肯定累及，100%大鼠手術同側腦部有栓子存在[5]。本實驗中大鼠造模后進行的行為學檢查結果顯示，模型組大鼠與空白對照組及假手術組相比，找到平臺的潛伏期明顯延長，在原平臺所在象限停留的時間明顯減低，說明模型組大鼠空間學習能力及空間記憶能力均受影響。

AD最常見的病理改變是：老年斑、神經纖維纏結、腦血管的淀粉樣改變、神經細胞的丟失[6]。Aβ是淀粉樣沉淀的產物，被認為是導致AD的直接病理原因。Aβ包括分別含有40個和42個氨基酸殘基的多肽Aβ40和Aβ42，雖然Aβ42的量較Aβ40少得多，但Aβ42以更穩定的形式存在于老年斑和神經元纖維纏結中[7]。大量形態學研究表明，AD患者腦組織中普遍存在微血管病變，如腦淀粉樣血管病、微血管變性、血腦屏障的改變、白質損害及微血管梗死、腦出血等。在AD和正常老年人腦中存在很多微血管改變，包括血管襻形成、血管扭曲，以及小動脈硬化、纖維素樣壞死、脂質變性、血管外膜鈣化、白質和灰質微血管密度下降[2，8]。有些微血管變化與AD患者的神經元脫失平行。許多研究者發現了AD發作的血管位點，以及Aβ損傷的目標是中樞神經系統的小動脈、細動脈和毛細血管[9]。腦血管損害在AD患者發病機制中的作用還不十分清楚，缺血在前還是Aβ沉積于腦血管加重了腦缺血，加重了AD的認知功能減退，多數觀點認為，Aβ是導致AD的直接病理原因，是引起AD腦中其他病理改變的關鍵環節。本實驗反其道而行之，觀察到大鼠腦微血管損傷后腦組織內Aβ表達，推測腦微血管損傷可能影響了Aβ清除而促發淀粉蛋白沉著，是AD的促發因素，一方面可以解釋腦卒中動物模型的學習記憶功能障礙，可能存在Aβ沉積，進一步可解釋膽堿酯酶抑制劑對血管性癡呆的癥狀治療有效[10]；另一方面為構建AD模型提供了思路，同時也解釋了臨床運用擴張血管、改善腦血液供應、神經營養等治療單獨用于可能的AD或癥狀輕微的AD[6，11]。

1 Panchal M, Rholam M, Brakch N. Abnormalities of peptide metabolism in Alzheimer’s disease[J].Curr Neurovase Res,2004,1(4):317-323.

2 Franzblau M, Gonzales-Portillo C, Gonzales-Portillo GS, et al. Vascular damage: A persisting pathology common to Alzheimers`disease and traumatic brain injury[J].Med Hypotheses,2013,9(13):450-457.

3 梅建勛，張伯禮，張云嶺.多發梗塞性癡呆動物模型的改進與應用[J].天津中醫學院學報，1997,16(2):38-40.

4 Bink DI, Ritz K, Aronica E, et al. Mouse models to study the effect of cardiovascular risk factors on brain structure and cognition[J]. J Cereb Blood Flow Metab,2013,8(10):1038.

5 Ren M, Lin ZJ, Qian H, et al. Embolic middle-cerebral artery occlusion model using thrombin and fibrinogen composed clots in rat[J].J Neurosci Methods,2012,9(2):296-304.

6 溫蒲圓，周軍.阿爾茨海默病治療的研究進展[J].中國老年學雜志，2013,33(7):3524-3527.

7 張志慧，曹冉，周龍崗，等.通心絡對Aβ損傷腦微血管內皮細胞中炎性因子及信號通路NF-κB表達的影響[J].疑難病雜志，2010，9(9):645-646

8 Jelliner KA.Alzeimer disease and cerebrovascular pathology an update[J]. J Neural Transm,2002,109(5-6)：813-836.

9 Knopman D, Boland LL, Mosley T, et al. Cardiovascular risk factors and conitive decline in middle-aged adults[J]. Neuroloy,2001,56(1)：42-48.

10 魏翠柏，周愛紅，王芬，等.膽堿酯酶抑制劑在癡呆治療中的現狀[J].疑難病雜志，2010，9(12):948-949.

11 Langbaum JB, Fleisher AS, Chen K, et al. Ushering in the study and treatment of preclinical Alzheimer’s disease [J].Nat Rev Neurol，2013,9(7)：371-381.

數值的修約

按照GB 8170-1987《數值修約規則》進行，其簡明口訣為“4舍6入5看齊，5后有數進上去，尾數為0向左看，左數奇進偶舍棄”。例如：修約到一位小數，12.149修約為12.1；12.169修約為12.2；12.150修約為12.2，12.250修約為12.2。

Theethologyandtheexpressionofamyloidβpeptideaftercerebralmicrovascularembolisminrats

DINGLing*,XIAOBo,BIFangfang,LILinfu,WUPing,LUOXing,TANGXianjing.

*DepartmentofNeurology,theThirdHospitalofChangsha,Changsha410075,China

ObjectiveTo observe the ethology and the expression of amyloid β peptide after cerebral microvascular embolism in adult rats.MethodsSixty SD rats were randomly divided into control group, sham operation group, mode group with 20rats in each group. Prepared animal model of multiple cerebral embolism with thrombus legal system to detect morris water maze spatial learning and memory in rats, Westen-blot was used to detect the protein in rat brain Aβ levels.ResultsNavigation test showed that, time of the model rats found the latency was significantly longer than the control group and the sham group (P<0.01), between the latter two groups, there was no statistically significant (P>0.05); in the space exploration experiments, the stay time on the the former platform of model group was significantly shorter than the control group and the sham group (P<0.01), between the latter two groups, there was no statistically significant(P>0.05); brain tissue Aβ protein levels in mode group higher than the control group and the sham group (P<0.01), between the latter two groups, there was no statistically significant (P>0.05).ConclusionAfter brain microvascular injury occurs, learning and memory of rat decline, increased brain Aβ protein levels may trigger the occurrence of Alzheimer's disease.

Alzheimer's disease; Cerebral microvascular embolic model; Amyloid β peptide; Brain tissue; Rats

長沙市2013年度指導性科技計劃項目(No.K13ZD060-33)，長沙市第三醫院院內課題

410075 長沙市第三醫院神經內科(丁玲、李嗇夫、吳平、羅星、湯顯靖)； 410008 長沙，中南大學湘雅醫院神經 內科(肖波、畢方方)

10.3969/ j.issn.1671-6450.2014.02.027

2013-10-09)