響應(yīng)面法優(yōu)化燈心草多糖的超聲提取工藝

陳 帥，王慧竹，薛健飛

(吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022)

燈心草 Juncus effusus L.［J.effusus L.var.decipiens Buchen.;J.decipiens(Buchen.)Nakai］又名碧玉草(《本草綱目》)，水燈心(《植物名實圖考》)，秧草(《長白山植物志》).生于水旁、田邊等潮濕處，在長江下游及福建、四川、貴州、陜西等地均有分布，江蘇、蘇州地區(qū)及四川亦有栽培［1］.本植物的根及根莖亦供藥用，藥用燈心草(Medulla Junci)為燈心草科燈心草屬植物燈心草的莖髓或全草，性微寒，味甘、淡，歸心、肺、小腸、膀胱經(jīng)，主治熱淋、水腫、小便不利、濕熱黃疸，心煩不寐、小兒夜啼、喉痹、口舌生瘡等癥［2］.莖髓含多種菲類衍生物、揮發(fā)油、酮類成分、酚類成分、黃酮類成分以及多糖類化合物［3-8］.本實驗利用響應(yīng)面法對燈心草多糖的超聲提取工藝進(jìn)行研究，優(yōu)選出易操作、成本低、得率高且適合工業(yè)化生產(chǎn)的工藝條件，為今后燈心草的綜合利用提供理論依據(jù).

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

燈心草，由安國中藥飲片批發(fā)提供，吉林大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定為燈心草屬燈心草科植物燈心草(Juncus effusus L.)的干燥精髓;葡萄糖(分析純)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙醇(分析純)、濃硫酸(分析純)、苯酚(分析純)天津大茂化學(xué)試劑廠.

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004N電子分析天平上海精密科學(xué)儀器有限公司;W5-100SP恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;KQ5200DE超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司;JY2002電子天平上海市精密儀器有限公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;DHG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SHZ-D循環(huán)水真空泵河南鞏義市予華責(zé)任有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 燈心草多糖的提取

燈心草→粉碎→蒸餾水超聲提取→過濾→濾液→醇沉→離心→真空干燥→收集浸膏→含量測定→數(shù)據(jù)分析→確定最佳提取工藝.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品0.020 6 g，置100 mL容量瓶中，加入蒸餾水溶解，并稀釋至刻度.分別精密吸取上述溶液6、8、10、12、14、16 mL于50 mL容量瓶中以蒸餾水稀釋至刻度.取上述溶液各2 mL于10 mL容量瓶中加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，在40℃水浴中保溫30 min后冰浴放置5 min，依照分光光度法，以相應(yīng)溶劑作空白，在490 nm波長處測定吸光度［9-11］.以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=59.604C+0.010 4，R2=0.999，結(jié)果表明葡萄糖在4.944～13.18μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

1.3.3 燈心草多糖含量的測定

精密稱量燈心草多糖樣品粉末0.010 0 g，置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解，定容至刻度，即得供試品溶液.取2 mL供試品溶液于10 mL容量瓶中，按“1.3.2”項下方法進(jìn)行吸光度測量，然后按以下公示計算提取率.

其中，w%為燈心草多糖提取率;A為吸光度;m2為所得浸膏質(zhì)量;m1為稱取燈心草的質(zhì)量.1.3.4 單因素實驗

以蒸餾水為溶劑，固定超聲頻率為59 KHz，提取次數(shù)為2次，分別考察超聲時間、浸提溫度、浸提時間、料液比對燈心草多糖提取率的影響.在單因素實驗的基礎(chǔ)上利用星點設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化燈心草多糖的提取工藝.

(1)超聲時間對多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.0 g粉碎度40的燈心草粉末5份，分別置于100 mL圓底燒瓶中，在浸提溫度70℃，浸提時間 2 h，料液比 70 1，超聲頻率59 KHz，浸提2次條件下，分別超聲提取10、20、30、40、50 min.

(2)浸提溫度對多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.0 g粉碎度40目的燈心草粉末5份，分別置于100 mL圓底燒瓶中，固定浸提時間2 h，料液比701，超聲頻率59 KHz，浸提次數(shù)2次，分別在浸提溫度 60、65、70、75、80 ℃的條件下超聲提取20 min.

(3)浸提時間對多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.0 g粉碎度40目的燈心草粉末5份，分別置于100 mL圓底燒瓶中，固定浸提溫度75℃，料液比70 1，超聲頻率59 KHz，浸提次數(shù)2次，分別在浸提時間 1、1.5、2、2.5、3 h 的條件下超聲提取20 min.

(4)液料比對多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.0 g粉碎度40目燈心草粉末5份，分別置于100 mL圓底燒瓶中，固定浸提溫度75℃，浸提時間2 h，超聲頻率59 KHz，浸提次數(shù)2次，分別在料液比70 1、80 1、90 1、100 1、110 1的條件下超聲提取20 min.

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)星點實驗設(shè)計原理，選取超聲時間、浸提溫度、浸提時間、液料比四個對燈心草多糖提取率的影響較為顯著的因素作為試驗因素，以多糖提取率為響應(yīng)值設(shè)計實驗，實驗的因素水平見表1，實驗結(jié)果采用SAS8.0軟件進(jìn)行分析.

表1 響應(yīng)面實驗因素水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲時間對多糖提取率的影響

從圖1可看出，隨著超聲時間的增加，燈心草多糖提取率逐漸上升，超聲時間為20 min時多糖提取率最高，隨后多糖提取率隨超聲時間的增加反而下降.因此超聲時間選20 min左右比較適宜.

圖1 超聲時間對多糖提取率的影響

2.1.2 浸提溫度對多糖提取率的影響

從圖2可看出，隨著浸提溫度的上升，燈心草多糖提取率逐漸增大，浸提溫度為75℃時多糖提取率最大，超過75℃后多糖提取率急劇下降.因此浸提溫度選75℃左右比較適宜.

圖2 浸提溫度對多糖提取率的影響

2.1.3 浸提時間對多糖提取率的影響

從圖3可看出，隨著浸提時間的延長，燈心草多糖提取率逐漸增大，浸提時間為2.0 h時多糖提取率最大，超過2 h后多糖提取率呈下降趨勢.因此浸提時間選2 h左右比較適宜.

圖3 浸提時間對多糖提取率的影響

2.1.4 液料比對多糖的影響

從圖4可看出，液料比為80 1 mL/g時多糖提取率最大，然后隨著料液比的增大多糖提取率呈下降趨勢.因此料液比選80 1 mL/g左右比較適宜.

圖4 液料比對多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

對超聲時間A、浸提溫度B、浸提時間C、料液比D作如下變換:X1=(A-20)/10，X2=(B-75)/5，X3=(C-2)/0.5，X4=(D-80)/10.以多糖提取率為響應(yīng)值(Y)，以 X1、X2、X3、X4為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表2.

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

其中實驗號1-16是析因試驗部分，17～24是星點試驗部分，25～30是中心試驗部分，中心試驗重復(fù)6次，用以估計實驗誤差.

用SAS8.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得出回歸模型參數(shù)值及方差分析結(jié)果，見表3和表4.

表3 回歸系數(shù)顯著性檢驗

表4 回歸方程的方差分析

由表3可知燈心草多糖提取率對編碼自變量的二次回歸方程為:

Y=0.56+0.047X1+0.060X2+0.057X3+0.034X4-0.057X21+0.007 6X1X2-0.032 X1X3+0.027X1X4-0.050X22-0.018X2X3+0.025X2X4-0.084X23-0.0073X3X4-0.051X24.在回歸方程中，常數(shù)項、一次項X1、X2、X3及二次項 X1X1、X2X2、X3X3、X4X4都達(dá)到了極顯著水平(P ＜0.01)，一次項X4和交互項X1X3、X1X4、X4X2系數(shù)呈顯著水平(P＜0.05)，因此各實驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系［12］.所以，可以利用該回歸方程確定燈心草多糖的最佳提取工藝.對回歸方程及實驗的各因素進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示.

由表4可知，回歸方程的P ＜0.01，說明所建立的二次多項式模型具有高度顯著性，線性項和二次項的P＜0.01也說明具有高度顯著性，模型的決定系數(shù)R2=0.954 5，說明響應(yīng)值的變化有95.45%來源于所選變量，模型擬合度好，可以較準(zhǔn)確地描述各實驗因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系.

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各試驗因子X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維空間曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用.當(dāng)特征值均為正值時，響應(yīng)面分析圖為山谷形曲面，有極小值存在;當(dāng)特征值為負(fù)值時，為山丘曲面，有極大值存在;當(dāng)特征值有正有負(fù)時，為馬鞍形曲面，無極值存在［12］.根據(jù)回歸模型繪制相應(yīng)響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，如圖5～10所示.

圖5 超聲時間(X1)和浸提溫度(X2)對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖6 超聲時間(X1)和浸提時間(X3)對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖7 超聲時間(X1)和液料比(X4)對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖8 浸提溫度(X2)和浸提時間(X3)對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖9 浸提溫度(X2)和液料比(X4)對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖10 浸提時間(X3)和液料比(X4)對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

由圖5～10可以直觀看出各因素對多糖提取率的影響，響應(yīng)面的坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對于操作條件的改變越敏感，曲面坡度越小，表明操作條件改變對響應(yīng)值的影響也越小，等高線圖表明多糖提取率最大條件應(yīng)該在圓心處.將圖5～10對比分析可知多糖提取率隨試驗因子的增大均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，且響應(yīng)曲面開口朝下，表明該模型有穩(wěn)定點，且穩(wěn)定點即為最大值［13-17］.

利用SAS軟件RSREG語句對模型進(jìn)行典型性分析，得到燈心草多糖提取最佳工藝為超聲時間25.86 min、浸提溫度78.91℃、浸提時間2.05 h、液料比86.64 1 mL/g，在此工藝條件下燈心草多糖的提取率理論值得到0.607 4%，但考慮實際情況，將最佳工藝條件修正為超聲時間25.9 min、浸提溫度78.9℃、浸提時間2.05 h、料液比86.6 1 mL/g.在此修正工藝條件下進(jìn)行試驗驗證，重復(fù)3次，測得多糖平均提取率為0.613 2%，多糖提取工藝驗證試驗值與理論值的差值僅占理論值的0.95%.可見預(yù)測模型較好地反映出燈心草多糖的提取工藝條件，從而也證明了響應(yīng)面法確定燈心草多糖的提取工藝條件的可行性.

3 結(jié) 論

本研究通過單因素實驗考察了超聲時間、浸提溫度、浸提時間、料液比對多糖提取率的影響，將超聲時間考察范圍定為10～50 min，浸提溫度考察范圍定為60～80℃、浸提時間考察范圍定為1～3 h，液料比考察范圍定為1 70～1 110.通過星點設(shè)計-響應(yīng)面法，建立了超聲提取燈心草多糖的數(shù)學(xué)模型，模型的決定系數(shù)為0.954 5，方程顯著，擬合良好，可以進(jìn)行實際預(yù)測，并最終確定燈心草多糖超聲提取的最佳工藝參數(shù)為:超聲時間25.9 min、浸提溫度78.9℃、浸提時間2.05 h、液料比86.6 1 mL/g.

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