水相合成CdSe量子點用于熒光標(biāo)記的光譜研究

楊 琴(長沙航空職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410124)

水相合成CdSe量子點用于熒光標(biāo)記的光譜研究

楊 琴
(長沙航空職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410124)

生物素-親和素系統(tǒng)(BAS) 已成為目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術(shù)。采用水相合成的CdSe納米粒子標(biāo)記生物分子親合素，用熒光分光光度法研究了親合素與量子點的結(jié)合作用，結(jié)果表明標(biāo)記了親合素的量子點發(fā)光強(qiáng)度高于單一的CdSe量子點，光譜峰位置稍微有所紅移。通過改變體系的pH值，親合素的濃度及熒光顯微成像等手段，發(fā)現(xiàn)光譜的變化確實是由量子點和親合素的結(jié)合作用所引起的，證明CdSe可以很好的用于生物標(biāo)記。

量子點；CdSe；親合素；熒光光譜；生物標(biāo)記

熒光量子點(Quantum Dots，簡稱QDs)是一種半導(dǎo)體納米微晶體，是由Ⅱ-Ⅵ族及Ⅲ-Ⅴ族元素組成的納米顆粒，由于其具有優(yōu)異的光學(xué)光譜特征和光化學(xué)穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的熒光探針相比，量子點激發(fā)光譜寬，且連續(xù)分布，而發(fā)射光譜呈對稱分布，且寬度窄，顏色可調(diào)，并且光化學(xué)穩(wěn)定性高，通過調(diào)節(jié)晶粒的尺寸和組分還能控制發(fā)射光譜的位置，它在生命科學(xué)、分析科學(xué)、材料科學(xué)、免疫醫(yī)學(xué)、檢驗檢疫科學(xué)等傳統(tǒng)及新興的領(lǐng)域中都得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了一定的研究進(jìn)展，尤其是在生命科學(xué)的各個領(lǐng)域中，它的作用更是日益突出[1]。目前，人們已成功制備出各種高發(fā)光性能的量子點[2, 3]，如可見光區(qū)的CdTe，CdSe，CdS等，以及近紅外區(qū)的CdHgTe，PbS，PbSe等。常用的量子點合成方法有水相合成法和有機(jī)相合成法。有機(jī)相制備條件苛刻，成本較高，且不適用于生物體系。水相合成法的原料來源方便，實驗條件溫和，無需對量子點表面進(jìn)行親水轉(zhuǎn)相處理，水相合成的量子點尺寸一般小于5 nm，其表面鍵合的配體含有羧基和氨基等官能團(tuán)，可以采用靜電吸附或共價偶聯(lián)等方法直接與生物分子連接，具有非常好的水溶性[4]。

近年大量研究證實，生物素—親合素系統(tǒng)(Biotin-Avidin System，簡稱BAS)幾乎可與目前研究成功的各種標(biāo)記物結(jié)合，該系統(tǒng)具有反應(yīng)迅速、專一、穩(wěn)定等特點?？梢欢伺悸?lián)大分子生物反應(yīng)體系，一端連接標(biāo)記或支持材料，并產(chǎn)生多級放大效應(yīng)。將量子點標(biāo)記到親合素(Avidin)或鏈霉親和素(Streptavidin)上，在后續(xù)實驗中利用生物素和抗生物素蛋白(Biotin-Avidin)之間的高度特異性結(jié)合力將量子點標(biāo)記到目標(biāo)分子上，可廣泛用于免疫標(biāo)記和示蹤分析及定量檢測等方面，在醫(yī)學(xué)、免疫組織化學(xué)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。

目前，有周華健等[5]以3-巰基丙酸(MPA)為穩(wěn)定劑制備了CdTe量子點并對其進(jìn)行了表征。萬異等[6]研究了水相溶液中巰基丙酸包覆的CdTe量子點與親和素的結(jié)合作用, 但以L-半胱氨酸為穩(wěn)定劑合成CdSe量子點用于標(biāo)記親合素方面還需進(jìn)一步研究。本文研究以L-半胱氨酸為穩(wěn)定劑，合成水溶性CdSe量子點，利用其良好的熒光特性，研究CdSe量子點與親合素的結(jié)合作用。在選定的pH值條件下合成的CdSe量子點表面被L-半胱氨酸包覆帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的生物分子通過靜電相互作用而結(jié)合，見圖1。同時本文還對不同pH值和不同濃度親合素作用下的CdSe量子點進(jìn)行比較并表征其相關(guān)特性，該方法簡便、快速，為進(jìn)一步用量子點標(biāo)記生物素化蛋白、抗體或DNA奠定了基礎(chǔ)。

圖1 量子點和親合素作用原理

1 實驗部分

1.1 實驗儀器及試劑

L-半胱氨酸，上海陸安生物科技有限公司；無水亞硫酸鈉(Na2SO3)，上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；硒粉，天津市化學(xué)試劑研究所；二水醋酸鎘(Cd(CH3COO)2·2H2O)，天津市化學(xué)試劑二廠；天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。親和素(avidin)，上海純優(yōu)生物科技有限公司。將親合素溶于pH 7.33的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，并于0～4℃下保存。所有試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

用熒光分光光度計(日本日立，F(xiàn)-4500)測定熒光光譜，激發(fā)波長320 nm，光縫寬度5 nm；采用倒置熒光生物顯微鏡(美國ACCU-SCOPE，3032)表征量子點的顆粒大小及形態(tài)。

1.2 CdSe量子點的制備

實驗所用尺度較為均一的CdSe納米晶體的制備如文獻(xiàn)[7]中已有詳細(xì)報道，先制備Na2SeSO3，在10mL超純水中加入0.5 mmol的Na2SO3，在磁力攪拌下緩慢加熱至50℃左右，迅速加入1.5 mmol硒粉，繼續(xù)加熱至80℃約1小時，攪拌至硒粉充分溶解，得到的溶液為黃色透明的Na2SeSO3溶液。

制備CdSe量子點：將1.5 mmol的L-半胱氨酸(L-Cys)與50 mL去離子水配成溶液，超聲分散均勻，再加入1 mmol的Cd(CH3COO)2·2H2O，用0.1 M NaOH調(diào)節(jié)混合液的pH值為8.0，通入均勻的氮氣10 min后，將10 mL已合成的Na2SeSO3溶液快速加入到混合液中，再緩慢加熱至30℃，攪拌回流，自然冷卻到室溫后停止通氮氣，得到10 mM水溶性CdSe/Cys納米微體系。

1.3 CdSe量子點標(biāo)記親合素

用PH=7.3的PBS緩沖溶液分別稀釋親和素和CdSe納米粒子，然后向納米粒子溶液中加入一定量的親和素，室溫下混合均勻。

2 結(jié)果與討論

2.1 Avidin和CdSe量子點的光學(xué)性質(zhì)

(a)Avidin在PBS緩沖液中的熒光發(fā)射光譜 (b)CdSe量子點在PBS緩沖液中的熒光發(fā)射光譜

圖2為PBS緩沖液中親和素的熒光光譜和CdSe量子點的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長為320 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。由圖2可知，CdSe量子點在525 nm處有一強(qiáng)的熒光發(fā)射帶。親合素在338 nm處有一弱峰，由于兩種物質(zhì)的峰位置不同，在450-600 nm波長范圍內(nèi)，由親和素分子自身發(fā)出的熒光不會對CdSe量子點的熒光測定產(chǎn)生影響，因此可以用CdSe量子點來修飾親合素來進(jìn)行生物表征。

2.2 CdSe-Avidin標(biāo)記物性能的表征

圖3 CdSe量子點和CdSe-Avidin標(biāo)記物熒光發(fā)射光譜

圖3為CdSe量子點和CdSe量子點結(jié)合親合素后的熒光發(fā)射光譜，CdSe濃度為5mM。曲線a為量子點，b為CdSe-Avidin標(biāo)記物。從圖中可以看出，CdSe標(biāo)記親合素后熒光峰位稍有紅移，峰強(qiáng)明顯增強(qiáng)，而CdSe與CdSe-Avidin的發(fā)射譜的半峰寬基本不變。引起發(fā)射峰位變化的原因是CdSe量子點與親和素通過靜電相互作用結(jié)合，量子點間的距離縮短，粒徑增大，粒子間偶極與偶極的相互作用增加，從而使其Stokes位移增大，CdSe-Avidin的發(fā)射譜相對于單一CdSe量子點的發(fā)射光譜發(fā)生了紅移[8]。CdSe與CdSe-Avidin的發(fā)射譜的半峰寬基本不變，表明在標(biāo)記過程中量子點之間沒有發(fā)生團(tuán)聚，分散較均勻。峰強(qiáng)增加表明親合素對量子點有修飾作用，能減少量子點表面的缺陷，使熒光強(qiáng)度增大。

為了更進(jìn)一步證實CdSe納米粒子與親和素分子之間發(fā)生了相互作用，考察了不同濃度親和素與一定濃度的CdSe量子點發(fā)生作用后的熒光發(fā)射光譜，如圖4所示，激發(fā)波長320 nm。由圖可知，CdSe量子點分別加入不同濃度的親和素溶液后，溶液的熒光強(qiáng)度會逐漸增加，當(dāng)溶液加入親和素為100 μg /mL時，熒光強(qiáng)度有最大值，這就表明親和素對量子點表面缺陷有修飾作用。親合素與量子點的結(jié)合除了靜電引力作用之外，可能還有L-半胱氨酸上的-COOH與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基在偶聯(lián)劑作用下產(chǎn)生共價偶聯(lián)作用[9]。這兩種方式的結(jié)合均可以降低量子點的表面缺陷，增大量子點的熒光強(qiáng)度。當(dāng)加入過量蛋白質(zhì)后，剩余蛋白與結(jié)合蛋白之間或蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生交叉結(jié)合，可能使部分量子點產(chǎn)生聚集，使熒光強(qiáng)度反而略有降低。

圖4 CdSe量子點溶液中分別加入親和素a-e: 20,40,60,100,150μg /mL時溶液的熒光強(qiáng)度. pH：7.38, CdSe濃度：5 mM

圖5 在不同pH條件下將親合素加入量子點溶液后的熒光強(qiáng)度。a-e: 3.14，6.45，7.38，8.00，10.78. 親合素濃度：40 μg /mL，CdSe濃度：5 mM.

為了進(jìn)一步證實加入了親和素后CdSe量子點溶液發(fā)射光譜的變化是CdSe量子點與親和素分子通過靜電相互作用的結(jié)果, 調(diào)整CdSe-Avidin量子點溶液的pH值，測得熒光光譜，如圖5所示。親和素的等電點為10.5[6]，溶液pH值小于等電點時，親合素帶正電荷，當(dāng)pH值大于等電點時，親合素帶負(fù)電荷。當(dāng)所用PBS緩沖液的pH值為10.78時，發(fā)現(xiàn)加入了親和素的CdSe量子點溶液的發(fā)射峰位沒有發(fā)生變化，還在525 nm處。這是由于，當(dāng)溶液的pH為10.78時，親和素顯負(fù)電，與帶相同電荷的CdSe量子點相互排斥，所以兩者之間不會發(fā)生靜電相互作用，即熒光發(fā)射峰位不會發(fā)生變化；而當(dāng)溶液的pH為7.38和6.45時，發(fā)射峰位置稍有紅移，這是因為在此pH條件下，親和素顯正電，因此能通過靜電相互作用與帶負(fù)電荷的CdSe量子點結(jié)合，使得量子點尺寸增大。這也進(jìn)一步說明CdSe-Avidin量子點溶液發(fā)射光譜的變化確實是由CdSe量子點與親和素之間的結(jié)合反應(yīng)引起的。

由圖5可知，在不同PH條件下，親和素和量子點溶液的結(jié)合對量子點熒光強(qiáng)度有較大的影響。量子點本身是在弱堿性溶液中制備的，在酸性溶液中容易溶解，元素之間的結(jié)合力不強(qiáng)，而致使熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯減弱。在中性溶液和弱堿性溶液中量子點與親和素作用后，量子點表面缺陷得到修飾，其熒光強(qiáng)度稍有增加。而在強(qiáng)堿性溶液，由于溶液中存在過量的OH-離子，親和素對CdSe表面修飾作用不強(qiáng)，量子點顆粒缺陷增加，表面鈍化，熒光強(qiáng)度有所降低。

為了更進(jìn)一步考察CdSe納米粒子與親和素分子之間發(fā)生的作用及結(jié)合后粒子的形態(tài)，采用熒光倒置顯微鏡分別觀察了單獨的CdSe納米粒子及用CdSe納米粒子標(biāo)記后的親和素分子，所得到的熒光顯微鏡圖像如圖6所示，圖6(a)為CdSe納米微粒的倒置熒光顯微鏡圖。從圖中可以看出，納米粒子呈類球形，尺寸分布較為均一，粒徑小于10 nm。圖6(b)為CdSe-Avidin標(biāo)記物的倒置熒光顯微鏡圖，其形狀也近似呈球形，粒子直徑尺寸相對CdSe納米粒子明顯增大，表明CdSe與親合素的確發(fā)生了結(jié)合。顯微鏡結(jié)果和熒光光譜結(jié)果一致，親和素結(jié)合量子點后，粒徑增大。其中原理為穩(wěn)定劑L-半胱氨酸通過巰基的硫原子與CdSe量子點微粒表面的富鎘離子進(jìn)行結(jié)合，半胱氨酸分子中的氧原子參與了量子點表面的金屬離子配位作用，羧基在量子點中以羧酸鹽的形式存在[10]。從而量子點表面被半胱氨酸包覆帶負(fù)電荷，與帶正電荷的親合素通過靜電作用相結(jié)合。

圖6 CdSe量子點和CdSe-Avidin標(biāo)記物的倒置熒光顯微鏡圖

3 結(jié)論

實驗表明，在水溶液中制備CdSe量子點，并于親合素混合，可以成功的把CdSe量子點標(biāo)記到生物素上，再利用生物素-親和素系統(tǒng)，將制備的CdSe-Avidin標(biāo)記物與生物素化的抗體、核酸、受體結(jié)合，就可把量子點標(biāo)記到細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)上，進(jìn)行示蹤檢測和功能研究，為量子點的應(yīng)用提供一種通用的標(biāo)記物。

[1] 范萍. 水溶性量子點熒光探針的制備及其在食品分析檢測中的應(yīng)用[D]. 湘潭：湘潭大學(xué)，2013.

[2] 沈冉. 強(qiáng)熒光量子點的合成、性質(zhì)及其在生物標(biāo)記方面的應(yīng)用[D]. 合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué), 2013.

[3] 劉劍波. 量子點的制備、成像及其在化學(xué)生物分析中的應(yīng)用研究[D]. 長沙：湖南大學(xué)，2011.

[4] 李眾，祝欣，董朝青，等. 熒光量子點的水相合成及其在化學(xué)和生物分析中的應(yīng)用[J]，高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報，2010，(10).

[5] 周華健, 曹立新, 高榮杰, 等. 水溶性CdTe量子點熒光探針的制備表征及應(yīng)用[J]. 發(fā)光學(xué)報，2013, (7).

[6] 萬異, 林章碧, 陳奇丹, 等. 水相合成CdTe量子點標(biāo)記親和素前后光譜變化的研究[J]. 分析儀器, 2004, (3).

[7] Wang Q., J.N.Chen & H.X.Zhang,et al. Synthesis of Water Soluble Quantum Dots for Monitoring Carrier-DNA Nanoparticles in Plant Cells[J].JNanosci.Nanotechnol., 2011, (3).

[8] 林章碧，陳奇丹，張皓,等. 水相合成CdTe量子點標(biāo)記親和素前后光譜變化的研究[J]. 分析儀器, 2004, (3).

[9] 楊冬芝，孫世安, 陳啟凡，等. CdSe量子點與蛋白質(zhì)的作用研究[J]. 激光生物學(xué)報，2007，(5).

[10] 王瓊, 陳介南, 章懷云,等. 水溶性量子點制備條件的優(yōu)化及表面修飾[J]. 材料導(dǎo)報，2009，(10).

[編校：張芙蓉]

Spectroscopic Studies of Fluorescent Labeling of CdSe Quantum Dots Synthesized in Aqueous Solution

YANG Qin

(ChangshaAeronauticalVocationalandTechnicalCollege,ChangshaHunan410124)

The biotin avidin system (BAS) which has become a new technology is now widely used in such new technology as trace amounts of antigen, antibody qualitative analysis, quantitative detection and location observation research. The biomolecules avidin was labeled by CdSe nanoparticles synthesized in aqueous solution, and the combination and quantum dots were studied by fluorescence spectrophotometries. The peak intensity of emission spectrum of CdSe quantum dots bound to avidin point was significantly higher than that of independent CdSe quantum dots, and the peak position is slightly red shifted. The fact that the change of spectra is due to the binding of CdSe and avidin is further confirmed through experiments by changing pH values and avidin concentration of test solution. The results show that CdSe quantum dots can be well applied as biological tag.

quantum dots; CdSe; avidin; fluorescence spectra; biological tag

2014-10-18

楊琴(1981- )，女，湖南張家界人，講師，理學(xué)碩士，研究方向為分析化學(xué)。

O657

A

1671-9654(2014)04-058-05