柱花草莖段組織培養(yǎng)研究

單國燕等

摘 要 以‘熱研2號柱花草莖段為外植體，研究不同激素種類及組合對試管苗誘導、增殖和生根的影響。結果表明：將帶芽莖段接種在MS+6-BA 5.0 mg/L+GA3 0.5 mg/L的培養(yǎng)基中腋芽誘導率最高可達90%；最佳不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，其分化率達100%；最佳生根培養(yǎng)基為MS+IBA 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L。綜上所述，該研究結果改變了叢生芽的產(chǎn)生途徑，縮短了分化時間，提高了增殖速度，是快速繁殖柱花草苗的有效方法。

關鍵詞 柱花草 ；莖段 ；組織培養(yǎng)

分類號 S541

Abstract In this experiment， the stems of Stylosanthes guianensis cv， Reyan2 were used as a material and the effects of hormones and their combinations on the propagation and rooting of the plantlets were also studied. The results showed that the highest frequency of shoot formation was obtained when explants（stem with buds） were cultured on MS+6-BA 5.0 mg/L+GA3 0.5 mg/L， the inducement rate of valid buds reached to 90%； The best adventitious bud proliferation medium was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L and the differentiation rate was up to 100%； The best rooting medium was MS+IBA 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L. This research changed the way of producing tufted multiple shoot， shortened the time of differentiation， and raised the speed of proliferation， It is the available way to quickly propagate the Stylosanthes.

Keywords Stylosanthes ； stem ； tissue culture

柱花草屬（Stylosanthes spp.）包括44個種和亞種，廣泛分布于中南美洲、北美洲、非洲、東南亞和印度等地。適于生長在南北緯30°之間，平均生長周期為63～190 d[1-3]。中國于1962年首次自馬來西亞引種柱花草到海南島，作為橡膠園的覆蓋作物[4]。柱花草還是優(yōu)良的熱帶豆科牧草，其莖葉產(chǎn)量高，草品質(zhì)好（干物質(zhì)中粗蛋白質(zhì)含量達15%以上）。柱花草耐旱、耐酸性瘦土，廣泛用于改良天然草地，作為放牧及制作草粉，同時還可用作果園等的覆蓋作物、保持水土和提高土壤肥力等。

國外在20世紀60年代就開展了柱花草的組織培養(yǎng)研究[5-6]，大多是用無菌苗的子葉和幼莖作為外植體進行誘導和培養(yǎng)，然而通過莖尖和莖段培養(yǎng)誘導叢生苗國內(nèi)外鮮有報道，且沒有圖片顯示其再生體系的建立過程。莖段培養(yǎng)是一項在作物上應用較為廣泛的生物技術，具有取材方便、分化時間縮短、增殖倍數(shù)提高、再生植株能保持母本的優(yōu)良性狀等優(yōu)點，在生產(chǎn)中具有很大的潛在應用價值。但在柱花草莖段培養(yǎng)過程中，真菌和細菌污染都十分嚴重，有時甚至高達100%，導致培養(yǎng)失敗，因此，本研究以中國大面積推廣種植的優(yōu)良品種‘熱研2號柱花草莖段為外植體，對影響其組織培養(yǎng)的外植體消毒方法和激素配比等重要因素進行研究，為柱花草的莖段培養(yǎng)提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 外植體

實驗所用材料為‘熱研2號柱花草中上部帶芽莖段，取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶牧草研究中心。‘熱研2號柱花草是中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)牧研究所選育的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、耐病品種，目前它在中國柱花草栽培品種中推廣面積最大。

1.1.2 試劑

實驗所用試劑有：多菌靈、百菌清、殺毒釩、羧卞青霉素鈉、噻孢霉素、鏈霉素、四環(huán)素、6-BA（6-芐基腺嘌呤）、KT（激動素）、NAA（萘乙酸）、GA3（赤霉素）和IBA（吲哚丁酸）。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理及消毒

對照（CK）：選擇生長健壯的植株，切取5 cm左右的外植體莖段，每3個芽分別剪成一段，用肥皂水浸泡7～8 min，流水沖洗20 min。將洗凈的外植體在超凈工作臺上進行常規(guī)消毒：75%酒精浸泡1 min，1 g/L升汞消毒10 min，最后用無菌水沖洗4～5次。處理1：1 g/L多菌靈，處理2：1 g/L多菌靈+1 g/L百菌清+1 g/L殺毒釩；處理3：1 g/L多菌靈+800 mg/L的羧卞青霉素鈉；處理4：1 g/L多菌靈+500 mg/L的噻孢霉素；處理5：1 g/L多菌靈+500 mg/L的羧卞青霉素鈉+250 mg/L的噻孢霉素；處理6：1 g/L多菌靈+800 mg/L的羧卞青霉素鈉+500 mg/L的噻孢霉素；處理7：1 g/L多菌靈+800 mg/L的羧卞青霉素鈉+500 mg/L的噻孢霉素+50 mg/L鏈霉素+25 mg/L四環(huán)素。外植體在處理1～7溶液中，置于130 r/min搖床上振蕩2.5 h，然后在超凈工作臺上常規(guī)消毒。

1.2.2 不同激素配比試驗endprint

芽誘導培養(yǎng)實驗：將柱花草莖段接種在不同的芽誘導培養(yǎng)基上，以MS為基本培養(yǎng)基，附加1、2、3、4、5、10 mg/L的6-BA，1、1.5、2 mg/L的KT，0.5、1、2 mg/L的NAA，0.5、1 mg/L的GA3，共12個處理，每個處理重復4次。2周后統(tǒng)計芽誘導率，期間觀察誘導出的芽的生長狀況。

芽增殖培養(yǎng)實驗：將誘導培養(yǎng)基上已萌發(fā)的嫩芽切下，轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基上。以MS為基本培養(yǎng)基，附加0.5、1、2、4 mg/L的6-BA，1、1.5 mg/L的KT，0.5、1 mg/L的NAA，0.5 mg/L的GA3，共8個處理，每個處理重復4次。20 d后統(tǒng)計嫩芽的分化率和苗長勢。

生根培養(yǎng)實驗：剪取約5 cm的帶葉和芽的增殖莖段用于生根培養(yǎng)實驗。設IBA添加濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L，IAA添加濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L，共4個處理，每個處理重復4次。

1.2.3 培養(yǎng)條件

MS培養(yǎng)基（附加蔗糖30 g/L，瓊脂粉7 g/L，pH 5.8），溫度25～28℃，光照強度1 500～2 000 lx，光照時間14 h/d。每瓶接種1個帶芽莖段，20 d后統(tǒng)計污染和生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

定期觀察柱花草的莖段生長狀況并記錄拍照，計算主要統(tǒng)計指標：污染率/%=污染的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%，誘導率/%=誘導出不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%，分化率/%=分化的外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%。

2 結果與分析

2.1 不同殺菌劑與抗生素處理及濃度對污染控制的效果

殺菌劑和抗生素的不同處理及濃度對柱花草污染控制的效果見表1。由表1可以看出，柱花草的莖段培養(yǎng)非常容易受細菌和真菌的污染，在對照中，常規(guī)消毒對柱花草污染的控制完全不起作用，如預處理1～4中，無論是單獨使用多菌靈，還是多菌靈和百菌清、殺毒釩、羧卞青霉素、鈉塞孢霉素中的1種或2種配合使用，柱花草莖段培養(yǎng)的污染率都為100%。從處理5（1 g/L多菌靈+500 mg/L的羧卞青霉素鈉+250 mg/L的噻孢霉素）開始，其污染率開始降低到56.0%，可見羧卞青霉素鈉和噻孢霉素對柱花草的真菌污染和細菌污染都有一定的抑制作用；繼續(xù)增加羧卞青霉素鈉和噻孢霉素的使用濃度，污染率也隨之降低到46.0%，所以800 mg/L的羧卞青霉素鈉和500 mg/L的噻孢霉素是較好的使用濃度；在處理6中再添加50 mg/L鏈霉素和25 mg/L四環(huán)素，污染率降低至36.0%，因此，處理7（1 g/L多菌靈+800 mg/L的羧卞青霉素鈉+500 mg/L的噻孢霉素+50 mg/L鏈霉素+25 mg/L四環(huán)素）對柱花草污染率的控制具有非常顯著的抑制作用。

2.2 不同激素配比對柱花草莖段腋芽萌動和抽芽的影響

莖段培養(yǎng)的目的是誘導莖段腋芽萌動抽芽，不同激素配比對柱花草莖段腋芽萌動和抽芽的影響見表2和表3。

2周后，觀察培養(yǎng)結果（表2）表明：①KT和GA3是影響柱花草莖段腋芽萌動的重要激素。2周內(nèi)都已經(jīng)有腋芽陸續(xù)抽出，當單獨或同時使用6-BA時，莖段很難誘導腋芽萌動抽芽，培養(yǎng)很長時間腋芽才有萌動，個別芽眼抽芽，但只抽葉柄，且芽弱；同量的6-BA配合低濃度KT能較好、較快地促進腋芽的萌動。②NAA對柱花草莖段腋芽萌動有抑制作用。在能很好誘導莖段萌動抽芽的配方中加入NAA后，莖段的萌動抽芽嚴重受抑制，2周內(nèi)，未見腋芽抽出。

3周后，觀察培養(yǎng)結果（表3）顯示：①處理7～12均有腋芽抽出，但抽芽時間比未添加NAA的組合要遲1周，并且芽誘導率也低于未添加NAA的組合。②雖然處理1的出芽時間和出芽數(shù)量在2周前優(yōu)于其他組合，但3周后，處理6的芽誘導率達90.0%，遠遠高于處理1的65.0%，并且芽長勢也明顯好于處理1（圖1）。由此推知，GA3是誘導柱花草莖段腋芽萌動的較好激素。誘導柱花草莖段萌動的最好激素組合是：MS+6-BA 5.0 mg/L+GA3 0.5 mg/L。

2.3 不同激素配比對柱花草莖段芽增殖的影響

在組織培養(yǎng)中，細胞分裂素和生長素的適當配比決定試管苗的生長與分化。提高細胞分裂素濃度有利于芽的產(chǎn)生，增加生長素濃度有利于組織和器官的生長。柱花草莖段增殖培養(yǎng)的目的是為了使苗既有較高的增殖速度又能保持較好的長勢，因此，本實驗設計了8種培養(yǎng)基，其增殖表現(xiàn)見表4。結果表明：①KT是影響柱花草莖段腋芽萌動的重要激素。當單獨使用6-BA時，萌芽抽出較慢，當在6-BA基礎上添加少量生長素（如NAA）后，萌動腋芽能很快抽出。②6-BA和KT配合使用的增殖效果，好于單獨使用1種分裂素的效果。③NAA是促進柱花草莖段萌動芽增殖的重要激素。當不使用NAA時，誘導萌動的腋芽很難抽枝增殖，當添加少量NAA時，能顯著提高抽枝能力。④能較好促進柱花草莖段芽增殖的培養(yǎng)基是B7號培養(yǎng)基（圖2）。

2.4 增殖莖段的生根情況

剪切約5 cm的帶葉和芽的增殖莖段插到生根培養(yǎng)基上。不同激素對柱花草增殖莖段生根的影響結果（表5）表明：①處理C2的生根效果最好（圖3）。②柱花草增殖莖段生根對NAA敏感，NAA濃度稍高或稍低都會引起大量落葉和莖段枯死，因此，生根培養(yǎng)基中使用的NAA濃度范圍較窄。③繼代前用高濃度NAA溶液浸泡處理能促進抽根。

3 討論與結論

3.1 提高柱花草莖段外植體的利用率是影響其組織培養(yǎng)效率的關鍵環(huán)節(jié)

柱花草莖段組織培養(yǎng)中遇到的主要問題是外植體的污染，因為柱花草為多年生半直立草本植物，莖被茸毛，且喜潮濕的熱帶氣候[7]，這些對微生物的生長繁殖十分有利。在野外采集的柱花草莖段一般帶菌較多，造成常規(guī)組織培養(yǎng)污染率很高，幾乎為100%。要建立柱花草莖段的組織培養(yǎng)體系，植物材料的消毒至關重要。因此，有效的消毒方法是提高外植體利用率的有效途徑，是柱花草莖段組織培養(yǎng)的關鍵環(huán)節(jié)。多種抗菌素的配合使用對柱花草莖段組織培養(yǎng)的污染有很好的抑制作用。endprint

3.2 不同種類的培養(yǎng)基對莖段腋芽萌發(fā)和生長的影響

植物萌發(fā)生長所需要的營養(yǎng)元素不一樣，其濃度也不一樣，因此選擇適合本品種的培養(yǎng)基是其正常生長增殖生根的關鍵[8]。在本實驗中，以莖段為外植體，從萌發(fā)率、增殖系數(shù)和生長狀況綜合考慮，A6培養(yǎng)基最適合柱花草莖段的啟動培養(yǎng)。

3.3 增殖培養(yǎng)

組織培養(yǎng)中用腋芽或不定芽增殖的途徑來擴大繁殖有利于保持遺傳的穩(wěn)定性，而且在培養(yǎng)多代后仍然保持著旺盛的增殖能力[9]。該實驗采用萌發(fā)枝條誘導出的不定芽增殖，結果獲得了較高數(shù)量的叢生芽。

3.4 激素種類及配比是影響柱花草莖段組織培養(yǎng)的重要因素

在基本培養(yǎng)基一致的情況下，適當調(diào)整激素的種類和用量，柱花草莖段誘導、增殖和生根的差異明顯，因此，激素種類及配比是影響柱花草莖段組織培養(yǎng)的重要因素。細胞分裂素是組織培養(yǎng)中誘導芽產(chǎn)生不可缺少的外源激素，其濃度對外植體誘導形成芽起著至關重要的作用，高水平的細胞分裂素傾向于誘導不定芽的形成，也使側芽增生迅速，結果產(chǎn)生大量過于細密的嫩莖，同時嫩莖的質(zhì)量下降，不利于下一步的生根移栽。

3.5 柱花草莖段組織培養(yǎng)為加速柱花草快繁技術提供了新途徑

國外柱花草的組織培養(yǎng)研究始于1976年，獲得成功的品種有：有鉤柱花草[10]、矮柱花草[11]、庫克柱花草[12]、圭亞那柱花草[13]等。其中胚根、胚軸和子葉的組織培養(yǎng)是研究較早較多的方向，但由于以這些材料為外植體的組織培養(yǎng)需要經(jīng)過愈傷誘導、脫分化愈傷誘導、芽增殖、根誘導等階段，整個過程周期長，增殖效率不高，同時，外植體采樣受生長期的影響，限制了柱花草組培苗在生產(chǎn)上的廣泛應用。而柱花草莖段的組織培養(yǎng)只有芽誘導、芽增殖和根誘導等階段，周期短，且外植體采樣不受時間的限制，其組織培養(yǎng)的成功能顯著提高組培苗在生產(chǎn)上的應用水平。通過本實驗結果證明，柱花草莖段組織培養(yǎng)效率高，從芽誘導到新抽枝條長到8～10 cm，只需60 d左右的時間，之后就可切取嫩枝繼續(xù)繼代增殖，誘導生根、成苗。這將是柱花草離體快繁的又一新途徑。

參考文獻

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[13] 唐湘梧. 熱帶牧草筆花豆生物工程技術研究[J]. 國外畜牧學. 草原與牧草，1989（1）：37-39.endprint

3.2 不同種類的培養(yǎng)基對莖段腋芽萌發(fā)和生長的影響

植物萌發(fā)生長所需要的營養(yǎng)元素不一樣，其濃度也不一樣，因此選擇適合本品種的培養(yǎng)基是其正常生長增殖生根的關鍵[8]。在本實驗中，以莖段為外植體，從萌發(fā)率、增殖系數(shù)和生長狀況綜合考慮，A6培養(yǎng)基最適合柱花草莖段的啟動培養(yǎng)。

3.3 增殖培養(yǎng)

組織培養(yǎng)中用腋芽或不定芽增殖的途徑來擴大繁殖有利于保持遺傳的穩(wěn)定性，而且在培養(yǎng)多代后仍然保持著旺盛的增殖能力[9]。該實驗采用萌發(fā)枝條誘導出的不定芽增殖，結果獲得了較高數(shù)量的叢生芽。

3.4 激素種類及配比是影響柱花草莖段組織培養(yǎng)的重要因素

在基本培養(yǎng)基一致的情況下，適當調(diào)整激素的種類和用量，柱花草莖段誘導、增殖和生根的差異明顯，因此，激素種類及配比是影響柱花草莖段組織培養(yǎng)的重要因素。細胞分裂素是組織培養(yǎng)中誘導芽產(chǎn)生不可缺少的外源激素，其濃度對外植體誘導形成芽起著至關重要的作用，高水平的細胞分裂素傾向于誘導不定芽的形成，也使側芽增生迅速，結果產(chǎn)生大量過于細密的嫩莖，同時嫩莖的質(zhì)量下降，不利于下一步的生根移栽。

3.5 柱花草莖段組織培養(yǎng)為加速柱花草快繁技術提供了新途徑

國外柱花草的組織培養(yǎng)研究始于1976年，獲得成功的品種有：有鉤柱花草[10]、矮柱花草[11]、庫克柱花草[12]、圭亞那柱花草[13]等。其中胚根、胚軸和子葉的組織培養(yǎng)是研究較早較多的方向，但由于以這些材料為外植體的組織培養(yǎng)需要經(jīng)過愈傷誘導、脫分化愈傷誘導、芽增殖、根誘導等階段，整個過程周期長，增殖效率不高，同時，外植體采樣受生長期的影響，限制了柱花草組培苗在生產(chǎn)上的廣泛應用。而柱花草莖段的組織培養(yǎng)只有芽誘導、芽增殖和根誘導等階段，周期短，且外植體采樣不受時間的限制，其組織培養(yǎng)的成功能顯著提高組培苗在生產(chǎn)上的應用水平。通過本實驗結果證明，柱花草莖段組織培養(yǎng)效率高，從芽誘導到新抽枝條長到8～10 cm，只需60 d左右的時間，之后就可切取嫩枝繼續(xù)繼代增殖，誘導生根、成苗。這將是柱花草離體快繁的又一新途徑。

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[13] 唐湘梧. 熱帶牧草筆花豆生物工程技術研究[J]. 國外畜牧學. 草原與牧草，1989（1）：37-39.endprint

3.2 不同種類的培養(yǎng)基對莖段腋芽萌發(fā)和生長的影響

植物萌發(fā)生長所需要的營養(yǎng)元素不一樣，其濃度也不一樣，因此選擇適合本品種的培養(yǎng)基是其正常生長增殖生根的關鍵[8]。在本實驗中，以莖段為外植體，從萌發(fā)率、增殖系數(shù)和生長狀況綜合考慮，A6培養(yǎng)基最適合柱花草莖段的啟動培養(yǎng)。

3.3 增殖培養(yǎng)

組織培養(yǎng)中用腋芽或不定芽增殖的途徑來擴大繁殖有利于保持遺傳的穩(wěn)定性，而且在培養(yǎng)多代后仍然保持著旺盛的增殖能力[9]。該實驗采用萌發(fā)枝條誘導出的不定芽增殖，結果獲得了較高數(shù)量的叢生芽。

3.4 激素種類及配比是影響柱花草莖段組織培養(yǎng)的重要因素

在基本培養(yǎng)基一致的情況下，適當調(diào)整激素的種類和用量，柱花草莖段誘導、增殖和生根的差異明顯，因此，激素種類及配比是影響柱花草莖段組織培養(yǎng)的重要因素。細胞分裂素是組織培養(yǎng)中誘導芽產(chǎn)生不可缺少的外源激素，其濃度對外植體誘導形成芽起著至關重要的作用，高水平的細胞分裂素傾向于誘導不定芽的形成，也使側芽增生迅速，結果產(chǎn)生大量過于細密的嫩莖，同時嫩莖的質(zhì)量下降，不利于下一步的生根移栽。

3.5 柱花草莖段組織培養(yǎng)為加速柱花草快繁技術提供了新途徑

國外柱花草的組織培養(yǎng)研究始于1976年，獲得成功的品種有：有鉤柱花草[10]、矮柱花草[11]、庫克柱花草[12]、圭亞那柱花草[13]等。其中胚根、胚軸和子葉的組織培養(yǎng)是研究較早較多的方向，但由于以這些材料為外植體的組織培養(yǎng)需要經(jīng)過愈傷誘導、脫分化愈傷誘導、芽增殖、根誘導等階段，整個過程周期長，增殖效率不高，同時，外植體采樣受生長期的影響，限制了柱花草組培苗在生產(chǎn)上的廣泛應用。而柱花草莖段的組織培養(yǎng)只有芽誘導、芽增殖和根誘導等階段，周期短，且外植體采樣不受時間的限制，其組織培養(yǎng)的成功能顯著提高組培苗在生產(chǎn)上的應用水平。通過本實驗結果證明，柱花草莖段組織培養(yǎng)效率高，從芽誘導到新抽枝條長到8～10 cm，只需60 d左右的時間，之后就可切取嫩枝繼續(xù)繼代增殖，誘導生根、成苗。這將是柱花草離體快繁的又一新途徑。

參考文獻

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