假臭草EST—SSRs標記的開發

黃敏等

摘 要 從NCBI的dbEST數據庫中下載假臭草同族植物的EST序列，經EST序列處理及SSR位點查詢，首次設計了27對假臭草EST-SSRs引物，以海南省文昌市假臭草DNA為模板，采用單因素和L16（45）正交試驗對其EST-SSRs PCR反應體系進行優化。建立了假臭草EST-SSRs最佳20 μLPCR反應體系：Mg2+濃度為2.75 mmol/L，模板DNA用量為35 ng，Tag DNA聚合酶為2.25 U，dNTPs濃度為0.3 mmol/L，引物濃度為0.6 μmmol/L。并用14個不同來源的假臭草樣本對其體系進行驗證實驗，結果均能獲得穩定的、清晰明亮的擴增譜帶。假臭草EST-SSRs 標記的開發為深入研究其遺傳多樣性提供了基礎。

關鍵詞 假臭草 ；EST-SSRs ；引物設計 ；優化

分類號 Q754 ；S451

Abstract In this study， we download ESTs form dbEST database and first designed 27 primer pairs for Praxelis clematidea after EST pretreatment and SSR locus identification. The sample were collected from Wenchang City in Hainan province as DNA template， and the optimization and establishment of EST-derived SSR-PCR reaction system for Praxelis clematidea was carried out by single factor test and orthogonal experiment design of L16（45）. The result was indicated that the optimal EST-SSRs PCR reaction system （20 μL） was contained 2.75 mmol/L Mg2+， 35 ng DNA template， 2.25 U Tag DNA polymerase， 0.3 mmol/L dNTPs and 0.6 μmol/L primer. This system was tested by 14 Praxelis clematidea from different places， which stable and clear polymorphic bands were acquired. Accordingly， the development of EST-SSRs can be used for the genetic diversity research of Praxelis clematidea.

Keywords Praxelis clematidea ； EST-SSRs ； primer design ； optimization

假臭草（Praxelis clematidea R. M. King & H. Robinson）是菊科（Composite）假臭草屬（Praxelis）植物[1]，原產南美洲，傳入中國后曾一直被誤認為藿香薊（Ageratum conyzoides linn.）或熊耳草（Ageratum houstonianum Miller）[2-3]。假臭草適應性強，對土壤養分有較強的吸收力，種子具冠毛，易于傳播和對其它植物受體有化感作用，對中國華南入侵生境破壞嚴重[4-5]。假臭草EST-SSRs分子標記的開發，為其遺傳多樣性研究及其近緣種的鑒定提供了基礎。

EST（Expressed sequence tags）是通過對由mRNA逆轉錄成的cDNA克隆測序得到的一部分序列，代表著一定條件下基因組的部分轉錄信息[6]，是一段完整的或部分的基因表達序列，相比SSR而言，EST-SSRs在近緣種間具有更高的通用性和保守性[7]。EST-SSRs分子標記是基于PCR的標記手段，PCR結果受到Tag聚合酶﹑Mg2+濃度、DNA模板濃度、dNTPs濃度及引物濃度的相互影響，因此，ESR-SSRs標記的開發必須建立穩定可靠的PCR反應體系。假臭草EST-SSRs標記的開發未見報道，本研究的主要目的為：（1）利用EST-SSRs的可通用性特征[7-8]，以假臭草近緣種的EST序列設計EST-SSRs引物；（2）采用單因素試驗設計對PCR反應體系中五因素（Tag DNA聚合酶、Mg2+濃度、DNA模板、dNTPs及引物濃度）設置不同的水平梯度，篩選出最適濃度范圍；（3）基于單因素結果，設計L16（45）正交試驗，建立假臭草EST-SSRs標記的最佳PCR反應體系。

1 材料和方法

1.1 材料

假臭草樣品來源于海南省和廣東省不同市縣，見表1。采摘新鮮葉片，硅膠封裝，轉至-20℃冰箱保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 假臭草基因組DNA的提取與檢測

采用改良的CTAB法提取假臭草基因組DNA[9]。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，ND-2000超微量紫外分光光度計測出基因組DNA母液濃度（ng/μL）和純度（A260/A280），并將母液用滅菌ddH2O稀釋為10 ng/μL的工作液，-20℃保存備用。

1.2.2 EST-SSRs標記引物的設計和篩選

目前為止，NCBI（National Center for Biotechnology Information）的dbEST數據庫中沒有公布假臭草EST序列，根據EST-SSRs標記的可通用性特征，分別下載了假臭草同族植物勝紅薊（A. conyzoides）、薇甘菊（Mikania micrantha）和甜葉菊（Stevia rebaudiana）的EST序列設計引物（截止2013年6月）。對下載的EST序列進行預處理：保留長度100～700 bp（5′～3′）的EST序列，用DNA Star軟件去除序列中的載體、重復和PolyA/T序列[10-11]，獲得最低冗余度的EST序列。SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）軟件查找EST中的SSR位點（http：//www.gramene.org /gramene/search es/ssrtool），SSR位點篩選的標準為：含二﹑三﹑四﹑五﹑六核苷酸基元的最小重復數依次為8﹑6﹑5﹑4和3次。用Primer Premer 5.0軟件設計EST-SSRs引物，引物設計的主要參數為：（1）退火溫度為50～60℃；（2）引物長度為18～24 bp，20 bp最佳；（3）PCR產物長在100～500 bp；（4）GC%含量為40%～60%[12]。首次設計了27對EST-SSRs引物（表2），送往上海生工生物工程有限公司合成。以擴增譜帶清晰明亮、具有多態性為標準，對27對引物進行篩選，篩選的反應體系為：20 μL PCR反應體系中，Mg2+濃度為2.5 mmol/L，模板DNA用量為20 ng，Tag DNA聚合酶為1.5 U，dNTPs濃度為0.25 mmol/L，引物濃度為0.6 μmol/L，PCR擴增反應程序：94℃。預變性5 min，然后按94℃變性50 s，53℃退火40 S，72℃延伸70 S，40次循環；72℃延伸5 min[13]。根據實驗結果，篩選得出最優的引物作為PCR反應體系的引物。endprint

1.2.3 EST-SSRs標記PCR反應的單因素試驗

分別對模板Mg2+、dNTPs、引物、Tag酶及DNA模板進行梯度試驗，篩選最佳適宜濃度范圍。Mg2+濃度試驗中設0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 mmol/L 10個梯度；dNTPs濃度試驗中設0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mmol/L 8個梯度；引物濃度設0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol/L 8個梯度；Tag酶濃度設0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 U/20μL 11個梯度；DNA模板量設10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、80、100 ng/20μL 12個梯度。PCR反應程序同1.2.2。

1.2.4 EST-SSRs標記PCR反應因素水平的正交試驗設計

基于1.2.3篩選出的EST-SSRs標記PCR反應體系中模板DNA、Tag酶、Mg2+、引物及dNTPs濃度五因素的適宜濃度范圍，運用正交輔助軟件構建L16（45）正交試驗表，設計模板DNA、Mg2+、引物、dNTPs及Tag酶五因素和不同濃度的4水平正交試驗（表3）。根據表3，制備總體積為20 μL的PCR反應體系，除了表中的五因素外，加入2.0 μL 10×PCR buffer，不足20 μL用滅菌dd H2O補足，PCR反應程序同1.2.2。

1.2.5 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染

對單因素試驗和正交試驗設計的PCR擴增產物進行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，DL2000為Marker，220 V電壓下電泳2 h。電泳完后，用蒸餾水清洗凝膠2次，放入500 mL的0.1%硝酸銀染色液中浸泡10 min，取出凝膠并再次用蒸餾水清洗2次，放入500 mL的顯影液中顯影。銀染結果用數碼相機拍照保存。

1.2.6 數據處理

根據擴增條帶的敏感性與特異性即條帶強弱及雜帶的多少作1～16分記分，分數越高，表示敏感性、特異性越好[14]。3次重復獨立打分，根據得分計算各因素同一水平的試驗值之和（Ki）和該水平下的數據平均值（ki），并計算同一因素不同水平間的極差R。每一因素水平下的數據平均值ki反映了因素各水平間對PCR反應體系的影響情況，PCR反應體系優化時，應選取ki最大值對應的最適濃度水平。

2 結果與分析

2.1 CTAB法提取假臭草基因組DNA

從瓊脂糖凝膠電泳圖（圖1）可以看出，提取的假臭草基因組DNA的電泳條帶單一，清晰明亮，點樣孔無滯留，ND-2000超微量紫外分光光度計檢測結果顯示DNA的A260/A230比值為1.8～1.9，A260/A230比值為2.2～2.4，滿足EST-SSRs標記需求。

2.2 引物篩選

依據擴增條帶的敏感性、特異性和數量，篩選出srSSR716作為PCR反應體系的最佳引物。

2.3 EST-SSRs標記PCR反應體系的單因素試驗分析

2.3.1 Mg2+濃度對EST-SSRs標記的PCR擴增影響

Mg2+不同水平梯度試驗結果顯示（圖2-A），當Mg2+濃度為0.75～2.25 mmol/L時，有2條擴增譜帶，條帶清晰但卻有一定的彌散和拖尾現象；當Mg2+濃度為2.25～3.00 mmol/L時，有3條擴增普帶，條帶清晰明亮，彌散和拖尾現象不明顯，因此，假臭草EST-SSRs PCR反應 體系中Mg2+濃度的適宜濃度范圍為2.25～3.00 mmol/L。

2.3.2 dNTPs濃度對EST-SSRs標記的PCR擴增影響

dNTPs參與新鏈DNA的合成，直接影響PCR的產量。由圖2-B所示，當dNTPs濃度為0.05 mmol/L時，PCR產物產量少，擴增譜帶不清晰，DNA條帶較弱；當dNTPs濃度為0.05～0.20 mmol/L時，擴增譜帶的清晰度與濃度的大小呈正相關性；當dNTPs濃度為0.25～0.40 mmol/L時，擴增譜帶清晰完整，但隨著dNTPs濃度的增大，DNA條帶并沒有顯著的變化。因此，假臭草EST-SSRs PCR反應體系中dNTPs濃度的適宜濃度范圍為0.25～0.40 mmol/L。

2.3.3 引物濃度對EST-SSRs標記的PCR擴增影響

由圖2-C可以看出，PCR的產量與引物濃度呈正相關性，當引物濃度為0.1～0.2 μmol/L時，擴增譜帶較弱，不清晰；當引物濃度為0.3～0.4 μmol/L時，隨著濃度的增加，擴增譜帶變得清晰明亮；當引物濃度為0.5～0.7 μmol/L時，擴增譜帶清晰明亮，但并沒有隨著濃度的增加而呈現出明顯的變化；當引物濃度為0.8 μmol/L時，擴增譜帶開始出現彌散現象。因此，假臭草EST-SSRs PCR反應體系中引物濃度的適宜濃度范圍為0.4～0.8 μmol/L。

2.3.4 Tag DNA聚合酶用量對EST-SSRs標記的PCR擴增影響

Tag酶的用量影響PCR擴增的效率。由圖2-D 可見，Tag酶用量過低時，PCR擴增效率低下，當Tag酶用量為0.50～2.00 U時，有擴增譜帶出現，但同一Tag酶用量下，DNA條帶間清晰不一；當Tag酶用量為2.25～3.00 U時，擴增譜帶清晰度隨Tag酶用量的增加而增大。因此，假臭草EST-SSRs PCR反應體系中Tag DNA聚合酶用量的適宜濃度范圍為2.25～3.00 U。

2.3.5 模板DNA量對EST-SSRs標記的PCR擴增影響endprint

模板DNA的質量和用量影響PCR結果的敏感性和擴增效率。由圖2-E所示，當模板DNA用量為10、15、20 ng/20μL 時，擴增譜帶有缺失的現象，相比其他用量而言，DNA條帶較弱；當模板DNA用量為40、45、50、60、80、100 ng/20μL時，隨著模板DNA用量的增加，PCR結果的敏感性降低，出現非特異性DNA條帶，且存在彌散現象；當模板DNA用量為25、30、35 ng/20 μL 時，擴增譜帶清晰明亮。因此，假臭草EST-SSRs PCR反應體系中模板DNA量的適宜濃度范圍為25～35 ng/20 μL。

2.4 EST-SSRs標記PCR反應體系的正交試驗設計分析

實驗數據結果顯示，EST-SSRs標記PCR反應體系中5個因素的最佳反應水平為A4B3C3D1E2（表4），并不在正交組合表中出現，但與組合9和組合15接近。

2.5 PCR最佳反應體系的穩定性驗證

根據正交設計數據分析及PCR擴增產物電泳結果（圖3），結合經濟原則，選擇組合15為最優反應體系，對海南和廣東地區的14個假臭草樣本進行PCR擴增的結果（圖4）顯示，擴增譜帶清晰明亮，穩定性好，具有多態性。

3 討論與結論

3.1 EST-SSRs引物的設計

引物的設計是一個復雜的問題：涉及目的條帶的長度大小（如大片段的cDNA，小片段的點突變基因及其側翼序列）；模板DNA的復雜程度[11]；引物設計的軟件（Premier Primer、Oligo、Dnastar、Primer-BLAST等）[16]；以及主要參數的差異（引物長度、Tm值、GC%含量、預產物長度），都會導致引物設計結果的變化。

3.2 假臭草EST-SSRs標記PCR反應體系優化

單因素設計僅對PCR反應體系進行優化，不能檢測PCR反應體系中各因素間的交互作用，可能會導致亞優化結果的產生[17]，而正交設計試驗可以彌補這一缺點，可以了解各因素間的內在規律，找到最佳的水平組合。另外，EST序列中缺乏內含子序列，EST-SSRs標記的對象是基因組DNA，因此，基因組DNA中未識別的內含子剪接位點會干擾引物與模板的結合，導致擴增失敗，引物結合位點之間的內含子會導致擴增產物過長，或者擴增失敗[8]，如圖4中顯示，HWC的擴增產物過長。在類群間，內含子位點是相對保守的，同時可以通過與模式植物，如擬南芥或水稻的基因組序列校準提高引物的效率。

本實驗中Mg2+濃度對PCR擴增的特異性和產量具有顯著影響，PCR反應體系中的Tag DNA聚合酶需要 Mg2+來激活，適量的Mg2+濃度可以提高Tag酶的活性，濃度過高則抑制Tag酶的活性，過低則無法徹底激活Tag酶的活性[18]。dNTPs作為PCR反應的原料，其濃度的大小直接影響PCR的產量，濃度過低，擴增譜帶較弱甚至無帶，過高則與Tag酶發生競爭性抑制，爭奪Mg2+，抑制PCR反應[19]。從單因素試驗結果來看，引物濃度超過一定值后，隨著濃度的增加，PCR結果并沒有明顯的變化，相對于PCR反應體系中其他4個因素而言，引物的優化應偏向于經濟角度考慮[20]。Tag酶的用量直接影響PCR的擴增效率，酶量過多，不僅增加實驗成本，同時也會提高錯配率，引起非特異性擴增，用量過低則導致酶與引物無法完美的結合。模板DNA的質量和用量影響PCR的敏感性和擴增效率，圖2-E所示，模板DNA用量不同，其擴增結果有顯著差異，用量過多時，擴增譜帶出現彌散和變弱的現象。正交直觀分析結果顯示的最佳PCR反應體系并不在正交組合中，但與組合9和組合15接近，然而與組合15相比，組合9中對Tag酶和引物的需求量較多，從經濟角度考慮，節約成本，最終選擇組合15為假臭草EST-SSRs標記的PCR最優反應體系，即在20 μL的反應體系中，Mg2+濃度為2.75 mmol/L，模板DNA用量為35 ng，Tag DNA聚合酶為2.25 U，dNTPs 濃度為0.3 mmol/L，引物濃度為0.6 μmol/L。與甘蔗[21]、茄子[22]以及薔薇科植物[23]相比，假臭草EST-SSRs PCR最優反應體系中的Tag酶用量偏高，這可能是由于研究對象以及樣品處理方式的差異所導致的。

3.3 EST-SSRs標記的可通用性研究

目前，關于EST-SSRs標記的可通用性研究已取得了一定的成果。Malay等[24]研究發現，葦狀羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）的EST-SSRs引物在11種禾本科植物間產生清晰的擴增譜帶，可用于羊茅屬和黑麥草屬的遺傳研究。 Gasic等[23]研究蘋果EST-SSRs引物在50種薔薇科植物間的通用性，其通用能力為25%（杏子）～59%（梨），其中11對引物可進一步用于薔薇科植物間的通用性研究。小麥[25]、茄子[22]等也有EST-SSRs通用性研究的相關報道。本研究開發的EST-SSRs標記在14個假臭草樣本的穩定性驗證結果同樣表明，使用勝紅薊、薇甘菊和甜葉菊EST序列建立起來的EST-SSRs標記也可用于研究近緣種假臭草的遺傳多樣性。

致 謝 感謝國家標本平臺教學標本子平臺資助（http：//mnh.scu.edu.cn/）。

參考文獻

[1] Wu Z Y， Raven P H， Hong D Y. Flora of China[M]. Beijing， China： Science Press， 2011. 1 513-1 514.

[2] Veldkamp J F. Eupatorium catarium， a new name for Eupatorium clematideum Griseb.， non Sch.Bip. （Compositae）， a south American species naturalized and spreading in SE Asia and Queensland， Australia， Singapore[J]. Gardens'Bulletin， 1999， 51（1）： 119-124.endprint

[3] Corlett R T， Shaw J C. Praxelis clematidea yester-day South American， today Hong Kong， tomorrow the world[J]. Memoirs of the Hong Kong Natural History Society， 1995， 20： 235-236.

[4] 吳海榮，胡學難，鐘國強. 外來雜草假臭草的特征特性[J]. 雜草科學， 2008（3）：69-71.

[5] 王真輝，安 峰，陳秋波. 外來入侵雜草-假臭草[J]. 雜草科學，2006（4）：19-21.

[6] Poncet V， Rondeau M， Cayrel A， et al. SSR mining in coffee tree EST databases： potential use of EST-SSRs as markers for the Coffea genus[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2006， 276（5）： 436-449.

[7] Varshney R K， Graner A， Sorrells M E. Genic microsatellite markers in plants： features and applications[J]. Trends in biotechnology， 2005， 23（1）： 48-55.

[8] Ellis J R， Burke J M. EST-SSRs as a resource for population genetic analyses[J]. Heredity， 2007， 99（2）： 125-132.

[9] Murray M G， Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic acids research， 1980， 8（19）： 4 321-4 326.

[10] Ong W D， Voo C L Y， Kumar S V. Development of ESTs and data mining of pineapple EST-SSRs[J]. Molecular Biology Reports， 2012， 39： 5 889-5 896.

[11] Brandle J E， Richman A， Swanson A K， et al. Leaf ESTs from Stevia rebaudiana：a resource for gene discovery in diterpene synthesis[J]. Plant Molecular Biology， 2002， 50（4-5）： 613-622.

[12] Han Z G， Wang C B， Song X L， et al. Characteristics， development and mapping of Gossypium hirsutum derived EST-SSRs in allotetraploid cotton[J].Theoretical and Applied Genetics， 2006， 112： 430-439.

[13] 李鈞敏，董 鳴，鐘章成. 入侵植物薇甘菊種群的遺傳分化[J]. 植物生態學報，2007，31（4）：680-688.

[14] 何正文，劉運生，陳立華，等. 正交設計直觀分析法優化PCR條件[J]. 湖南醫科大學學報， 1998， 23（4）： 403-404.

[15] Rozen S， Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers [M] //Bioinformatics methods and protocols. Humana Press， 1999： 365-386.

[16] 張新宇，高燕寧. PCR引物設計及軟件使用技巧[J]. 生物信息學，2004，2（4）：15-18.

[17] Niens M， Spijker G T， Diepstra A， et al. A factorial experiment for optimizing the PCR conditions in routine genotyping[J]. Biotechnology and applied biochemistry， 2005， 42（2）： 157-162.endprint

[3] Corlett R T， Shaw J C. Praxelis clematidea yester-day South American， today Hong Kong， tomorrow the world[J]. Memoirs of the Hong Kong Natural History Society， 1995， 20： 235-236.

[4] 吳海榮，胡學難，鐘國強. 外來雜草假臭草的特征特性[J]. 雜草科學， 2008（3）：69-71.

[5] 王真輝，安 峰，陳秋波. 外來入侵雜草-假臭草[J]. 雜草科學，2006（4）：19-21.

[6] Poncet V， Rondeau M， Cayrel A， et al. SSR mining in coffee tree EST databases： potential use of EST-SSRs as markers for the Coffea genus[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2006， 276（5）： 436-449.

[7] Varshney R K， Graner A， Sorrells M E. Genic microsatellite markers in plants： features and applications[J]. Trends in biotechnology， 2005， 23（1）： 48-55.

[8] Ellis J R， Burke J M. EST-SSRs as a resource for population genetic analyses[J]. Heredity， 2007， 99（2）： 125-132.

[9] Murray M G， Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic acids research， 1980， 8（19）： 4 321-4 326.

[10] Ong W D， Voo C L Y， Kumar S V. Development of ESTs and data mining of pineapple EST-SSRs[J]. Molecular Biology Reports， 2012， 39： 5 889-5 896.

[11] Brandle J E， Richman A， Swanson A K， et al. Leaf ESTs from Stevia rebaudiana：a resource for gene discovery in diterpene synthesis[J]. Plant Molecular Biology， 2002， 50（4-5）： 613-622.

[12] Han Z G， Wang C B， Song X L， et al. Characteristics， development and mapping of Gossypium hirsutum derived EST-SSRs in allotetraploid cotton[J].Theoretical and Applied Genetics， 2006， 112： 430-439.

[13] 李鈞敏，董 鳴，鐘章成. 入侵植物薇甘菊種群的遺傳分化[J]. 植物生態學報，2007，31（4）：680-688.

[14] 何正文，劉運生，陳立華，等. 正交設計直觀分析法優化PCR條件[J]. 湖南醫科大學學報， 1998， 23（4）： 403-404.

[15] Rozen S， Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers [M] //Bioinformatics methods and protocols. Humana Press， 1999： 365-386.

[16] 張新宇，高燕寧. PCR引物設計及軟件使用技巧[J]. 生物信息學，2004，2（4）：15-18.

[17] Niens M， Spijker G T， Diepstra A， et al. A factorial experiment for optimizing the PCR conditions in routine genotyping[J]. Biotechnology and applied biochemistry， 2005， 42（2）： 157-162.endprint

[3] Corlett R T， Shaw J C. Praxelis clematidea yester-day South American， today Hong Kong， tomorrow the world[J]. Memoirs of the Hong Kong Natural History Society， 1995， 20： 235-236.

[4] 吳海榮，胡學難，鐘國強. 外來雜草假臭草的特征特性[J]. 雜草科學， 2008（3）：69-71.

[5] 王真輝，安 峰，陳秋波. 外來入侵雜草-假臭草[J]. 雜草科學，2006（4）：19-21.

[6] Poncet V， Rondeau M， Cayrel A， et al. SSR mining in coffee tree EST databases： potential use of EST-SSRs as markers for the Coffea genus[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2006， 276（5）： 436-449.

[7] Varshney R K， Graner A， Sorrells M E. Genic microsatellite markers in plants： features and applications[J]. Trends in biotechnology， 2005， 23（1）： 48-55.

[8] Ellis J R， Burke J M. EST-SSRs as a resource for population genetic analyses[J]. Heredity， 2007， 99（2）： 125-132.

[9] Murray M G， Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic acids research， 1980， 8（19）： 4 321-4 326.

[10] Ong W D， Voo C L Y， Kumar S V. Development of ESTs and data mining of pineapple EST-SSRs[J]. Molecular Biology Reports， 2012， 39： 5 889-5 896.

[11] Brandle J E， Richman A， Swanson A K， et al. Leaf ESTs from Stevia rebaudiana：a resource for gene discovery in diterpene synthesis[J]. Plant Molecular Biology， 2002， 50（4-5）： 613-622.

[12] Han Z G， Wang C B， Song X L， et al. Characteristics， development and mapping of Gossypium hirsutum derived EST-SSRs in allotetraploid cotton[J].Theoretical and Applied Genetics， 2006， 112： 430-439.

[13] 李鈞敏，董 鳴，鐘章成. 入侵植物薇甘菊種群的遺傳分化[J]. 植物生態學報，2007，31（4）：680-688.

[14] 何正文，劉運生，陳立華，等. 正交設計直觀分析法優化PCR條件[J]. 湖南醫科大學學報， 1998， 23（4）： 403-404.

[15] Rozen S， Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers [M] //Bioinformatics methods and protocols. Humana Press， 1999： 365-386.

[16] 張新宇，高燕寧. PCR引物設計及軟件使用技巧[J]. 生物信息學，2004，2（4）：15-18.

[17] Niens M， Spijker G T， Diepstra A， et al. A factorial experiment for optimizing the PCR conditions in routine genotyping[J]. Biotechnology and applied biochemistry， 2005， 42（2）： 157-162.endprint