自噬對HIV-1 gp120V3環介導的海馬神經元L型鈣離子通道電流的影響*

汪軍兵， 林麗清， 江明亮， 陸大祥， 陳桂玲， 行妍妍， 董 軍 △

(1廣州市番禺區中心醫院，廣東 廣州 511400； 暨南大學醫學院 2病理生理學教研室， 3國家中醫藥管理局病理生理學三級科研實驗室，廣東 廣州 510632 )

自噬(autophagy)是細胞內某些胞質成分通過一系列嚴格調控的途徑，最后被溶酶體內蛋白酶降解，釋放出大分子物質再循環的過程。巨自噬[1](macroautophagy)是指胞質成分被囊泡樣雙層膜結構的自噬體包裹后，再與溶酶體融合成自噬溶酶體進行降解，此種類型在自噬的3種方式中最為多見，本文提及的自噬均指巨自噬。有關自噬的信號轉導通路較為復雜，其中研究得最多的是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)依賴性信號通路。

HIV-1 gp120是人類免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus 1, HIV-1)表達于病毒表面的包膜糖蛋白，HIV-1 gp120V3環是其5個可變區之一，是HIV-1病毒輔助受體的特異性和細胞嗜性的主要決定因子，參與組成輔助受體結合位點，而且V3環還參與gp120與輔助受體結合過程并在其中起主要作用[2]。艾滋病感染者中40%～60%會發展為HIV相關神經認知障礙(HIV-associated neurocognitive disorder, HAND)，其機制至今尚未完全闡明。HIV-1 gp120是神經元損傷的一個重要因素，以HIV-1 gp120作用于神經元是研究HAND損傷機制的一個常用細胞模型。

在哺乳動物的中樞神經系統中至少存在6類電壓門控鈣離子通道，L型Ca2+通道是其中之一，它是導致細胞鈣離子內流的主要因素[3]。本室前期研究已經證實[4]，HIV-1 gp120V3環可引起原代培養的海馬神經元凋亡，且參與L型Ca2+通道電流的改變；然而，關于mTOR依賴性自噬信號轉導通路對HIV-1 gp120V3環介導的海馬神經元L型鈣離子通道電流的影響尚未見報道。

本實驗以HIV-1 gp120作用于原代培養的海馬神經元，同時加入mTOR依賴的信號轉導通路的抑制劑及激動劑，以全細胞膜片鉗記錄L型Ca2+通道電流，旨在研究自噬中mTOR依賴性信號轉導通路對HIV-1 gp120V3環介導的海馬神經元L型鈣離子通道電流的影響，從而為臨床上HAND的防治提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

gp120V3環購自Raybiotech；3-MA購自Sigma；rapamycin購自StressMarq；Neurobasal 培養基及B27購自Gibco；多聚賴氨酸購自Sigma。電極外液組成： NaCl 120，CsCl 5，TEA-Cl 10，BaCl210，HEPES 10，MgCl21，TTX 0.0005。電極內液組成：CsCl 120，MgCl22，Na2ATP 5，HEPES 10，glucose 11，EGTA 11。

2 細胞培養和實驗分組

取新生24 h內SD乳鼠，用裝有75%乙醇的噴壺噴滿乳鼠全身，無菌環境下開顱分離雙側海馬，置預冷PBS 液中洗滌3遍去除血液，然后轉入20 mL小玻璃瓶中，眼科剪剪碎，再轉入無菌100 mL輸液瓶中，加入相當于海馬組織總體20倍左右的DMEM/F12液與0.25%胰蛋白酶混合液(1∶1)，置37 ℃培養箱消化15 min，中間吹打2次，每次20 s，再加入胎牛血清1 mL終止消化，分別用200目和400目不銹鋼篩網過濾去除組織塊，吸取濾過液， 4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清，加完全培養液重懸細胞，收集懸液，取5 μL懸液以1∶1體積加入臺盼藍染色，觀察細胞存活狀態，調整細胞濃度5×108/L，種植于經10 % 多聚賴氨酸包被的petri皿內，4 h全量換液，更換為含2% B27的Neurobasal培養基繼續培養(Neurobasal培養基-2%B27條件培養基可抑制膠質細胞分裂生長，促進海馬神經元生長成熟)，之后每3 d半量換液1次，取培養7 d 的海馬神經元用于實驗。

實驗分為2個平行實驗組，即空白對照組、gp 120V3組、自噬阻斷劑3-MA組和gp120V3+3-MA組；空白對照組、gp120V3組、自噬激動劑rapamycin組和gp120V3+rapamycin組。

3 全細胞記錄

玻璃毛坯經P97微電極拉制儀經三步法拉制成尖端直徑為2～3 μm的電極，沖灌電極內液。去培養液，以電極外液輕洗去雜質，換上電極外液，將皿置于倒置顯微鏡載物臺上，20倍物鏡找到胞體光亮飽滿的神經元，沖灌玻璃微電極并將其安裝在放大器探頭的電極夾持器上，在電壓鉗模式下用微操縱器引導玻璃微電極靠近細胞，在電極入液后始終給予5 ～6 cm H2O的正壓，以防尖端堵塞。將微電極尖端調整至胞體正上方，然后在持續正壓的同時讓電極尖端緩慢靠近細胞，利用特定的測試方波判斷細胞的封接狀態。待電極尖端接觸細胞表面時，顯示的方波會因封接阻抗增大而產生相應變化，輕輕給予電極內負壓，形成高阻封接(1 GΩ)，此時形成貼附式膜片(cell-attached patch)，正確補償電容后穩定1 min，再給予負壓吸破電極尖端的細胞膜，此處細胞內、外液相通，補償電容電流和串聯電阻，形成全細胞膜片鉗(whole-cell patch)，穩定3～5 min進行記錄。實驗中的串聯阻抗在進行補償時可由放大器面板直按讀出，并被補償65%～75%。電流信號經Ag/AgCl電極引導，數據經Digtal 1320A轉換器記錄，采樣頻率為5 kHz，濾波頻率為1 kHz。記錄時，將高阻封接的細胞電位鉗制在-50 mV持續300 ms，階躍10 mV的10個去極化電壓鉗制記錄L-型Ca2+通道電流-電壓曲線。實驗中鉗制電壓和電路電阻隨時被檢測，只有基線、鉗制電壓和電路電阻穩定的數據才被納入分析數據。

4 統計學處理

數據應用Clamfit 10.2軟件和SPSS 13.0軟件進行數據處理和作圖，所得電流利用膜電容標化后以電流密度(pA/pF)表示，繪制I-V曲線。計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用完全隨機設計單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 自噬抑制劑3-MA對gp120V3環作用的海馬神經元L-型鈣離子通道電流的影響

由電壓步階產生的內向L型鈣離子通道電流在原代海馬神經元培養7 d后被記錄，從-50 mV～+40 mV的電壓步階產生的L型Ca2+通道電流在空白對照組、gp120V3(1 mg/L)組、3-MA(5 mmol/L)組和gp120V3+3-MA組經膜電容標化后峰值電流密度(pA/pF)平均值分別為-9.63±1.43、-16.06±1.57、-19.15±2.21和-22.55±2.08；gp120V3組及3-MA組與空白對照組比較，有顯著差異(P<0.05),說明加入gp120V3環或加入3-MA均可使海馬神經元的L型鈣離子通道電流增強；gp120V3+3-MA組與gp120V3組比較，有顯著差異(P<0.05)，提示加入3-MA抑制自噬后可使受gp120V3環作用的海馬神經元的L型鈣離子通道電流增強，見圖1。

2 自噬激動劑rapamycin對gp120V3環作用的海馬神經元L型鈣離子通道電流的影響

由電壓步階產生的內向L型鈣離子通道電流在原代海馬神經元培養 7 d后被記錄，從-50 mV～+40 mV的電壓步階產生的L型鈣離子通道電流在空白對照組、gp120V3(1 mg/L組)、rapamycin(2 μmol/L)組和gp120V3+rapamycin組經膜電容標化后峰值電流密度(pA/pF)為9.63±1.43 、-16.06±1.57、-5.68±0.48和-7.46±0.83，gp120V3組及rapamycin組與空白對照組比較，有顯著差異(P<0.05),說明加入gp120V3環可使海馬神經元的L型鈣離子通道電流增強，加入rapamycin可使海馬神經元的L型鈣離子通道電流減弱；gp120V3+rapamycin組與gp120V3組比較，差異顯著(P<0.05)，提示加入自噬激動劑rapamycin后可使受gp120V3環作用的海馬神經元的L型鈣離子通道電流減弱，見圖2。

Figure 2. The effect of autophagic excitor rapamycin on the peak current amplitude of hippocampal neurons treated with gp120V3 loop. A： voltage steps of L-type calcium channel; B： the average peak current amplitude in different groups; C： I-V curves of peak current density in different groups; D： bar chat of peak current density in different groups. Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs gp120V3 group.

討 論

自噬具有雙重功能，當自噬在對不同形式的細胞應激作出反應時可被快速上調，這種快速的自噬誘導可以通過清除細胞內受損的細胞器、毒性代謝分子及細胞內的病原體，并通過產生維持細胞重要功能所必需的細胞內構件，以利于細胞的生存，但自噬的持續性激活也可導致細胞最終發生自噬性細胞死亡[5]。

在自噬的信號轉導通路中，mTOR信號通路是研究得最多的一條，它包括AMPK/mTOR和ERK/ mTOR和PI3K-Ⅰ/ mTOR，但這3類均要通過信號分子mTOR。AMPK可抑制mTOR，對自噬起增強作用，ERK和Ⅰ型PI3K激動mTOR，對自噬起抑制作用[6]。Rapamycin是自噬激動劑，它可與靶點mTOR結合抑制其活性，從而增強自噬。3-MA是Ⅲ型PI3K的抑制劑。Ⅲ 型PI3K位于mTOR信號轉導通路下游，它與beclin 1形成復合物參與自噬體的形成，對自噬起到促進作用，故3-MA可抑制自噬，是科研實驗中廣泛使用的一種自噬阻斷劑[7]。

HIV-1 gp120是HIV-1的一種包膜糖蛋白，可致神經元凋亡[8]，但對神經元自噬的影響報道較少。Zhou等[9]以gp120作用于神經母細胞瘤SK-N-SH細胞6 h，發現細胞自噬增強。

HIV-1 gp120既可引起海馬神經元自噬增強，亦可導致海馬神經元凋亡，這其中自噬與凋亡的關系還未研究清楚。Qin等[10]將自噬和凋亡的標記物共同標記在同一神經元或膠質細胞上，發現自噬與凋亡同時存在，但損傷后不同時間內自噬與凋亡陽性細胞數不同，傷后短時間以自噬為主，隨時間延長則以凋亡為主。

在本實驗中，加入gp120V3環后乳鼠海馬神經元細胞膜上的L型Ca2+通道電流增強。結果顯示與正常對照組相比，3-MA使L型Ca2+通道電流增強，而rapamycin使L型Ca2+通道電流減弱，說明在正常生理情況下，通過對mTOR信號轉導通路進行抑制或激動可使海馬神經元L型Ca2+通道電流發生改變。同時結果還顯示 gp120V3+3-MA組較gp120V3組L型Ca2+通道電流增強，gp120V3+rapamycin組較gp120V3組L型Ca2+通道電流減弱，說明海馬神經元在HIV-1 gp120V3環作用的環境下，通過對mTOR信號轉導通路進行抑制或激動亦使L型Ca2+通道電流發生改變。

本實驗從電生理角度證明，自噬可能參與了HIV-1 gp120V3環介導的海馬神經元L型鈣離子通道電流的改變。為臨床上對自噬進行干預，即通過改變自噬狀態來保護海馬神經元，從而防治HAND提供理論依據。

[參 考 文 獻]

[1] Crotzer VL, Blum JS. Autophagy and intracellular surveillance: Modulating MHC class II antigen presentation with stress[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(22):7779-7780.

[2] Cormier EG, Dragic T. The crown and stem of the V3 loop play distinct roles in human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein interactions with the CCR5 coreceptor[J]. J Virol, 2002, 76(17):8953-8957.

[3] Kapur A, Yeckel MF, Gray R, et al. L-Type calcium channels are required for one form of hippocampal mossy fiber LTP[J]. J Neurophysiol, 1998, 79(4):2181-2190.

[4] Tang HM, Pan R, Fang WL, et al. Curcumin ameliorates hippocampal neuron damage induced by human immunodeficiency virus-1[J]. Neural Regen Res, 2013, 8(15):1368-1375.

[5] Shi R, Weng J, Zhao L, et al. Excessive autophagy contributes to neuron death in cerebral ischemia[J]. CNS Neurosci Ther, 2012，18(3):250-260.

[6] Meijer AJ, Codogno P. Regulation and role of autophagy in mammalian cells[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(12):2445-2462.

[7] Petiot A, Ogier-Denis E, Blommaart EF, et al. Distinct classes of phosphatidylinositol 3-kinases are involved in signaling pathways that control macroautophagy in HT-29 cells[J]. J Biol Chem, 2000, 275(2):992-998.

[8] Gong Z, Yang LJ, Tang HM, et al. Protective effects of curcumin against gp120 V3 loop-induced neuronal injury in rats[J]. Neural Regeneration Res, 2012, 7(3):171-175.

[9] Zhou T, Xu L, Dey B, et al. Structural definition of a conserved neutralization epitope on HIV-1 gp120[J]. Nature, 2007, 445(7129)：732-737.

[10]Qin AP, Zhang HL, Qin ZH. Mechanisms of lysosomal proteases participating in cerebral ischemia-induced neuronal death[J]. Neurosci Bull, 2008, 24(2): 117-123.