扶腎降濁方含藥血清對腎小管間質損害大鼠成纖維細胞TGF-β1/Smads信號轉導通路的影響*

李春雨， 蘇瑋蓮， 魏曉露， 李國霞

(天津醫科大學國際醫學院，天津 300070)

腎小管間質損害是腎小球腎炎由炎癥啟動進展至腎小球硬化的中間環節，腎小球腎炎進展至腎小球硬化，大多已不可逆轉，而對其中間環節即腎小管間質損害進行早期有效干預則可大大延緩腎小球腎炎進展，對防治慢性腎臟疾病具有重要意義[1-2]。扶腎降濁方在臨床廣泛用于慢性腎臟疾病的治療，多年的臨床實踐表明，總有效率達82.5%[3]。動物實驗表明，扶腎降濁方能改善慢性腎功能衰竭大鼠的常規生化指標，延緩腎衰的病理進程[4]。但對腎小管間質損害的保護作用機制尚不十分清楚。本文采用血清藥理學的研究方法，基于轉化生長因子-β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)/Smads信號轉導通路，從體外細胞實驗角度，探討扶腎降濁方對系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, MsPGN)腎小管間質損害的保護作用機制。

材 料 和 方 法

1 藥物與試劑

扶腎降濁方組成：山茱萸12 g，生黃芪30 g，白花蛇舌草30 g，丹參30 g，鬼箭羽30 g，益母草30 g，實驗所用中藥制劑為天津中醫藥大學中藥學院按既定工藝制備的配方顆粒，每克含生藥4.06 g，批號：20120810；葡萄球菌腸毒素B由軍事醫學科學院微生物流行病研究所提供；完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑為Sigma產品；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)為Amresco產品；Trizol reagent、反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自天根生化科技有限公司；全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、Western blotting檢測試劑盒和ECL化學發光底物試劑盒均購自南京凱基生物科技發展有限公司。

2 動物

雄性Wistar大鼠20只，體重(150±10)g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所提供，合格證號為SCXK(軍)2009-003。

3 儀器

Leica DMI 4000B倒置熒光顯微鏡(德國徠卡公司)；電泳儀(大連競邁生物科技有限公司)；DH-2000凝膠圖像采集分析系統(Heraeus)；ABI 7500型實時熒光定量基因擴增儀(美國應用生物系統公司)。

4 方法

4.1含藥血清制備 6只Wistar大鼠隨機分為：扶腎降濁方組(3只)和空白對照組(3只)。扶腎降濁方組以生藥51.5 g/kg劑量(成人劑量的15倍)灌胃給藥，每日2次，空白對照組給予等體積生理鹽水。連續3 d，于末次給藥后1 h腹主動脈取血，靜置30 min，3 000 r/min 離心20 min分離血清，56 ℃水浴30 min滅活補體，0.22 μm濾膜除菌，-20 ℃保存備用。

4.2病理狀態間質成纖維細胞培養 復制MsPGN大鼠動物模型[5-6]：6只Wistar大鼠隨機分為：模型組(3只)和空白對照組(3只)，自實驗第1天起，模型組大鼠以BSA水溶液配成隔日灌胃1次，空白對照組大鼠給予等體積生理鹽水隔日灌胃1次，共12至20周。實驗的第1天模型組分點注射完全弗氏佐劑0.2 mL(含BSA 2 mg),第8天注射不完全弗氏佐劑0.2 mL(含BSA 2 mg)，實驗的第8、15天尾靜脈注射金黃色葡萄球菌腸毒素B(0.4 mg/kg,配成水溶液)各1次。空白對照組注射等體積生理鹽水。經病理組織學(Masson染色)證實本實驗MsPGN大鼠動物模型復制成功。取第12、16和20周的模型大鼠腎間質成纖維細胞進行培養，同時培養正常大鼠腎間質成纖維細胞作為空白對照。無菌條件下，將富含小管間質的腎組織剪碎成1 mm×1 mm×1 mm小塊，經PBS洗滌，胰蛋白酶消化，調整細胞密度至1.0×109/L后接種于含10%胎牛血清DMEM培養皿中，置37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，將細胞以密度1.2×109/L接種于6孔培養板，分為5組：空白對照組(正常間質成纖維細胞)、模型對照組和含藥血清低、中、高劑量組(分別為5%、10%和20%扶腎降濁方含藥血清)，每組設3個復孔，各組細胞繼續培養12 h，加入含藥血清(空白對照和模型對照組加入20%對照血清)作用48 h后進行相關指標檢測。

4.3Real-time PCR Trizol法提取總RNA，按照試劑盒說明書進行cDNA合成。以反轉錄產物為模板，引物序列見表1，進行real-time PCR反應。反應體系為20 μL：2×Super Real PreMix Plus 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，模板(反轉錄產物)1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 7.4 μL。反應條件：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性10 s；50～60 ℃退火/延伸30 s；循環40次。反應結束后自動生成熔解曲線，結果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt法對目的基因進行相對定量分析[7-9]。

表1 引物序列

4.4Western blotting 蛋白變性后在10% SDS-PAGE中分離，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Ⅰ抗4 ℃搖床振蕩孵育過夜，第2天回收Ⅰ抗，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入Ⅱ抗，室溫搖床振蕩孵育2 h，ECL化學發光法顯影，Gel-Pro 3.2軟件對結果進行灰度分析。

5 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，用單因素方差分析法進行組間比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 扶腎降濁方含藥血清對腎間質成纖維細胞TGF-β1/Smads信號通路mRNA表達的影響

MsPGN大鼠腎小管間質損害后體外培養腎間質成纖維細胞，模型組與對照組比較，TGF-β1和Smad3 mRNA表達上調(P<0.05)，Smad7 mRNA表達下調(P<0.05)。隨著造模周期的延長，5%扶腎降濁方含藥血清在第20周以及10%含藥血清在第16和20周以及20%含藥血清在第12、16和20周均可明顯下調成纖維細胞TGF-β1和Smad3 mRNA表達(P<0.05)，上調Smad7 mRNA表達(P<0.05)，但無明顯的時間依賴性，見表2～4。

表2 扶腎降濁方含藥血清對腎間質成纖維細胞TGF-β1 mRNA表達的影響

表3 扶腎降濁方含藥血清對腎間質成纖維細胞Smad3 mRNA表達的影響

表4 扶腎降濁方含藥血清對腎間質成纖維細胞Smad7 mRNA表達的影響

2 扶腎降濁方含藥血清對腎間質成纖維細胞TGF-β1/Smads信號通路蛋白表達的影響

MsPGN大鼠腎小管間質損害后體外培養間質成纖維細胞，模型組與對照組比較，TGF-β1和Smad3蛋白表達上調(P<0.05)，Smad7蛋白表達下調(P<0.05)。5%、10%和20%扶腎降濁方含藥血清在第12、16和20周能明顯下調成纖維細胞TGF-β1和Smad3蛋白表達(P<0.05)，上調Smad7蛋白表達(P<0.05)，但無明顯的時間依賴性，結果見圖1～3。

Figure 1. Expression of proteins in renal interstitial fibroblasts in 12 weeks detected by Western blotting.1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3.△P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs model group.

討 論

TGF-β1是腎小球硬化和腎小管間質纖維化的關鍵因素，TGF-β1可直接促進腎小管細胞和間質纖維細胞合成膠原、纖維連接蛋白和層黏連蛋白；介導腎素血管緊張素、血小板生長因子、結締組織生長因子的致纖維化作用。急慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病、腎移植排斥反應、多囊腎和間質性腎炎等纖維化進程均與TGF-β1的高表達有關。因此，有效地切斷TGF-β1的信號通路，是中止或減輕腎纖維化進程的關鍵環節[10]。Smads蛋白是TGF-β家族信號從受體到核的細胞內轉導分子，TGF-β1通過其Ⅰ型和Ⅱ型受體完成信號轉導，以激活其下游Smads信號分子的磷酸化，隨后引起核轉位，進而調控基因的表達。Smads家族中Smad2～4、Smad6和Smad7參與TGF-β的信號轉導[11]。Smad3是目前所知唯一TGF-β1受體的胞內激酶底物，介導了TGF-β1的胞內信號轉導。Smad7是具有負反饋調節TGF-β1功能的細胞分泌因子，是TGF-β1特有的內源性抑制因子，其表達的調控是阻斷腎小球TGF-β1效應的關鍵環節[12-13]。我們前期研究發現，扶腎降濁方干預腎小管間質損害造成的腎組織TGF-β1/Smads/ILK信號轉導通路基因和蛋白表達異常，負性調節腎小管上皮細胞間質轉分化，減少炎細胞的浸潤與減輕腎小管間質和腎小球損傷，延緩腎小管間質損害病程的進展。本研究探討了扶腎降濁方含藥血清對病理狀態間質成纖維細胞TGF-β1/Smads信號轉導通路mRNA和蛋白表達的影響，以期進一步從體外細胞實驗角度闡明該方對腎小管間質損害的保護作用機制。

Figure 2. Expression of proteins in renal interstitial fibroblasts in 16 weeks detected by Western blotting.1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group;*P<0.05 vs model group.

本研究發現，MsPGN大鼠發展為腎小管間質損害后，體外培養病理狀態間質成纖維細胞，TGF-β1/Smads信號轉導通路發生改變，其中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白表達上調，Smad7 mRNA和蛋白表達下調。隨著造模周期的延長，扶腎降濁方含藥血清能部分逆轉腎小管損害造成的上述mRNA和蛋白表達的異常，提示扶腎降濁方含藥血清可通過抑制TGF-β1和Smad3 mRNA和蛋白的過度表達，增加Smad7 mRNA和蛋白表達，可能是其發揮保護腎小管間質作用的機制，本研究為中醫藥防治慢性腎功能衰竭提供了新的思路。

Figure 3. Expression of proteins in renal interstitial fibroblasts in 20 weeks detected by Western blotting.1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group.Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group;*P<0.05 vs model group.

[參 考 文 獻]

[1] 劉春瑩,陳磊鑫,冷 偉,等. 復方腎復片對MsPGN大鼠腎小管間質損害的影響[J].現代中醫藥, 2013, 33(3):89-92.

[2] Huang C, Shen S, Ma Q, et al. Blockade of KCa3.1 ameliorates renal fibrosis through the TGF-β1/Smad pathway in diabetic mice[J]. Diabetes, 2013, 62(8): 2923-2934.

[3] 李國霞,黃文政,何永生. 扶腎降濁法治療慢性腎功能衰竭80例臨床觀察[J].山東中醫雜志, 2005, 24(4):207-209.

[4] 李國霞,黃文政,何永生. 扶腎降濁法對腎功能衰竭大鼠常規指標的影響[J].天津中醫藥, 2005, 22(2):108-110.

[5] 劉 震,周樹錄,譚建三，等. 大鼠系膜增生型腎小球腎炎模型的改進[J].華西醫科大學學報, 1996, 27(2):182-184.

[6] 李國霞,黃文政,朱小棣. 系膜增生性腎小球腎炎腎小管間質損害模型的建立及腎疏寧的保護作用[J].天津中醫藥, 2007, 24(4):325-327.

[7] 高巧艷,李明才,李燕子,等. IL-33/ST2信號通路在纖維化疾病中的作用[J].中國病理生理雜志, 2013, 29(9):1712-1717.

[8] 宋 囡,何文智,王智民,等. 左、右歸丸及其拆方對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響[J].中國病理生理雜志, 2013, 29(7):1268-1274.

[9] 張晨月,張 舒,吳 瑩,等. 犀角地黃湯合銀翹散對流感病毒感染的小鼠肺組織及大鼠肺微血管內皮細胞ICAM-1和VCAM-1表達的影響[J].中國病理生理雜志, 2013, 29(9):1685-1690.

[10] Ge YZ, Wu R, Lu TZ, et al. Combined effects ofTGFB1 +869 T/C and +915 G/C polymorphisms on acute rejection risk in solid organ transplant recipients: a systematic review and meta-analysis[J]. PLoS One, 2014, 9(4): e93938.

[11] Zhao TT, Zhang HJ, Lu XG,et al.Chaihuang-Yishen granule inhibits diabetic kidney disease in rats through blocking TGF-β/Smad3 signaling[J]. PLoS One, 2014, 9(3):e90807.

[12] Ryoo IG, Ha H, Kwak MK. Inhibitory role of the KEAP1-NRF2 pathway in TGFβ1-stimulated renal epithelial transition to fibroblastic cells: a modulatory effect on SMAD signaling [J]. PLoS One, 2014, 9(4):e93265.

[13] Pan MM, Zhang MH, Ni HF, et al. Inhibition of TGF-β1/Smad signal pathway is involved in the effect ofCordycepssinensisagainst renal fibrosis in 5/6 nephrectomy rats[J]. Food Chem Toxicol, 2013, 58(1): 487-494.