AT1受體自身抗體對糖尿病腎病大鼠腎臟細胞凋亡及JNK表達的作用*

徐春艷， 趙林雙

(廣州軍區武漢總醫院內分泌科，湖北 武漢 430070)

血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibody，AT1-AA)屬于G蛋白偶聯受體家族，是針對AT1受體(AT1receptor，AT1R)的特異性抗體，具有類似血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)的生物學效應。自AT1-AA首次在先兆子癇患者體內被發現[1]以來，又先后證實其與難治性高血壓患者蛋白尿發生率有關[2]，并參與了原發性腎小球疾病過程[3]，成為獨立于高血壓之外的致腎臟損害的因素。本課題組前期研究發現，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)患者血清AT1-AA陽性率明顯高于糖尿病患者和正常對照者[4]，提示AT1-AA與DN發病過程有關，但其致DN腎臟損害的具體機制尚不清楚。

研究顯示，DN時腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system, RAS)的活化可引起腎臟內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，并可通過JNK凋亡途徑誘導腎臟細胞凋亡[5-6]。AT1R是RAS的關鍵因子，也是AT1-AA發揮效應的特異性受體，但其能否介導AT1-AA而致DN腎臟ERS反應，目前未見報道。因此，我們通過本研究探討DN大鼠血清AT1-AA與腎臟ERS及其相關的JNK凋亡信號通路的關系，以進一步了解AT1-AA致DN腎臟細胞凋亡的分子機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

36只4周齡雄性SD大鼠，購自武漢大學動物實驗中心，實驗動物合格證編號為42000500001559。飼養環境：室溫20～24 ℃，相對濕度40%～60%，自由攝食飲水，12 h交替照明。

2 主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma)；TUNEL試劑盒(Promega)；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78， GRP78)抗體(Bioworld);磷酸化c-Jun N末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)抗體(Santa Cruz)；β-actin抗體、羊抗小鼠Ⅱ抗、羊抗兔Ⅱ抗和兔抗小鼠Ⅱ抗(武漢博士德生物工程有限公司)。全自動生化儀(BECKMAN COULTER UniCelDxC 800)；HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統(廣州軍區武漢總醫院醫學實驗科提供)。

3 主要方法

3.1模型大鼠的建立 所有大鼠適應性喂養1周后隨機選取6只為正常對照(NC)，選取30只進行造模處理。NC組大鼠以普通飼料食喂養，造模大鼠以高糖高脂飼料喂養。造模大鼠于高糖高脂喂養4周時腹腔注射1%的STZ溶液(35 mg/kg)，NC組注射等量的檸檬酸緩沖液。72 h后測尾靜脈血糖，隨機血糖>16.7 mmol/L認為糖尿病大鼠模型建立成功，繼續高糖高脂喂養，每周復測血糖，持續觀察12周至其自然進展至DN階段[7]。 將模型建立成功大鼠統一歸為模型組(model組)。

3.2血清AT1-AA的測定及分組 大鼠稱重，給予10%水合氯醛(2 mL/kg)腹腔麻醉，腔靜脈取血，收集血清，分裝后-20 ℃保存。AT1R抗原肽片段的氨基酸序列為5’-IHRNVFFIENTTNITVCAFHYESQNSTL-3'(由華中科技大學附屬協和醫院心血管研究室人工合成并饋贈)。ELISA法測定血清AT1-AA 的A值[8]，根據AT1-AA測定結果，隨機選擇DN大鼠納入DN組，并分AT1-AA陽性DN(AT1-AA positive DN，APD)和AT1-AA陰性DN(AT1-AA negative DN，AND)亞組。

3.3血、尿生化指標的檢測 實驗結束前1 d，用代謝籠收集大鼠24 h尿液并記錄尿量，4 ℃保存。應用全自動生化儀檢測尿肌酐(urine creatinine，UCr)和尿微量白表達(urine microalbumin，UMA)；同時檢測血糖(blood glucose，BG)、血肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，計算肌酐清除率(creatinine clearance rate，CCr)。

3.4TUNEL染色測定腎臟細胞凋亡 制備腎組織石蠟切片，常規脫水，嚴格按試劑盒說明進行TUNEL染色，DAB顯色。光鏡下觀察，凋亡細胞呈棕褐色。應用MIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統計數凋亡細胞，計算凋亡率。

3.5Western blotting技術測定腎組織GRP78和p-JNK蛋白表達 提取大鼠腎組織總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。10%的SDS-PAGE分離蛋白，PVDF膜印跡，5%脫脂奶粉封閉，GRP78抗體(1∶600)、p-JNK抗體(1∶3 000)或β-actin抗體(1∶400)浸泡，4 ℃過夜,分別加入辣根過氧化物酶HRP標記的Ⅱ抗(1∶50 000)孵育2 h,滴加ECL底物液，暗視中X光片壓片、顯影、定影，應用凝膠成像系統分析膠片灰度值比值，進行蛋白的定量分析。

4 統計學處理

數據采用SPSS 19.0軟件進行分析。計數資料以構成比表示，采用2檢驗；計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Model組和NC組大鼠一般情況比較

實驗結束時，造模大鼠5只死亡，1只未成模，成模率為96.7%，死亡率為16.7%。與NC組大鼠比較，model組大鼠體重明顯減輕，而血糖及腎臟肥大指數均明顯升高，見表1。

表1 NC組和model組大鼠血糖、體重和腎肥大指數的比較

2 大鼠血清AT1-AA陽性率結果及亞組分組

Model組大鼠血清AT1-AA陽性率為62.5%，較NC組16.7%明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。根據AT1-AA結果，在24只Model組大鼠中隨機選取8只AT1-AA陽性和4只AT1-AA陰性大鼠納入DN組，其中AT1-AA陽性DN為APD亞組，AT1-AA陰性DN為AND亞組。

3 APD和AND亞組大鼠腎功能生化指標結果比較

與NC組比較，APD亞組大鼠的BUN和24 h UMA水平明顯升高(均P<0.01)，CCr顯著降低(P<0.05)；與APD亞組大鼠比較，前述各生化指標在AND亞組大鼠中變化程度相對較輕，見表2。

表2 各亞組大鼠腎功能生化指標結果比較

4 AT1-AA對DN組大鼠腎臟細胞凋亡的影響

DN組大鼠腎臟細胞凋亡率(16.65±5.01)較NC組大鼠(0.38±0.24)顯著增高(P<0.01)，其中腎小管上皮細胞和腎小球足細胞均有凋亡，但以腎小管上皮細胞凋亡為主。進一步觀察發現，APD亞組大鼠腎臟細胞凋亡率(20.05±1.71)明顯高于AND亞組(13.24±4.93)(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. Apoptosis of renal cells in all groups under optical microscope by TUNEL staining assay (×400). Apoptotic cells were brown as indicated by the arrows. Mean±SD. n=4～12. ** P<0.01 vs NC group; ##P<0.01 vs AND sub-group.

5 DN組和NC組大鼠腎組織GRP78及p-JNK蛋白表達比較

Western blotting結果顯示，DN組大鼠腎組織GRP78和p-JNK的表達分別為0.750±0.030和0.603±0.048，而NC組大鼠為0.334±0.001和0.209±0.003，2組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 2. The protein levels of GRP78 and p-JNK in DN group and NC group. Mean±SD. n=6～12.**P<0.01 vs NC group.

6 APD和AND亞組大鼠腎組織GRP78及p-JNK蛋白表達比較

進一步研究發現，APD亞組GRP78的表達(0.774±0.026)較AND亞組(0.728±0.003)明顯升高(P<0.05)；且APD亞組p-JNK的表達(0.643±0.026)亦高于AND亞組(0.562±0.018)(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. The protein levels of GRP78 and p-JNK in APD and AND sub-groups. Mean±SD. n=4～8. #P<0.05, ##P<0.01 vs AND sub-group.

討 論

DN是糖尿病危險而嚴重的微血管并發癥，其發病率呈逐年上升趨勢，已成為人類健康的重要威脅。但因DN是多因素綜合作用的結果，發病機制十分復雜，至今仍未完全明確。本課題組前期大量臨床研究發現，G蛋白偶聯受體自身抗體相關的自身免疫反應參與了DN的發病過程，并與DN患者蛋白尿水平關系密切[9]，因而認為自身免疫機制在DN病程中也起了重要作用。其中，AT1-AA通過與RAS的關鍵因子AT1R胞外第二環肽上的氨基酸序列特異性結合而發揮AngⅡ樣激動效應，且該激動效應不隨時間而脫敏。目前普遍認為，各種組織損傷和生理紊亂所致隱蔽抗原暴露，機體自身免疫應答反應激活，均可使機體AT1-AA產生增多[10]。而在DN狀態下，高糖毒性和RAS活化等因素可能通過循環或局部組織AngⅡ濃度升高或胞內信號通路變化而致AT1R的構象和密度改變，進而引起血清AT1-AA生成增多，但AT1-AA與DN腎臟結構損害的關系及作用機制，目前未見報道。

腎臟細胞凋亡在DN腎功能惡化過程中起重要作用，是DN腎損害的重要機制。本研究采用高糖高脂飲食聯合小劑量STZ腹腔注射，然后繼續高糖高脂喂養，任糖尿病大鼠自然進展為DN階段而得到的DN模型，是目前公認的接近人類2型DN自然病程和代謝特點的大鼠模型。實驗中，TUNEL染色檢測DN大鼠腎臟細胞凋亡并定位發現，AT1-AA陽性DN大鼠腎臟細胞凋亡率明顯高于AT1-AA陰性DN大鼠，表明AT1-AA在DN大鼠腎臟細胞凋亡過程中起到一定作用。大量腎臟細胞凋亡可直接導致尿蛋白水平顯著增加，腎功能明顯降低，這是本研究中AT1-AA陽性和陰性DN大鼠腎功能生化指標差異顯著的原因，但AT1-AA致腎臟細胞凋亡的具體分子機制還需進一步探索。

內質網是蛋白質合成、加工和Ca2+儲存及信號轉導的重要場所，可通過ERS對各種因素所致的應激反應起調節作用[11]。早期ERS能激活未折疊蛋白反應，減少蛋白質合成，增加蛋白質折/疊降解來維持細胞內環境的穩定，在該反應過程中，內質網中的分子伴侶GRP78起著主要的調控作用而成為ERS的標志性蛋白[12]。然而過度ERS會通過其相關的3條凋亡途徑：CHOP/GADD153基因激活轉錄，JNK磷酸化和caspase-12活化，促進應激受損細胞的凋亡[13]。其中，JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族的重要成員，可在各種應激刺激(如高糖，氧化應激，G蛋白偶聯受體激活等)作用下磷酸化而活化。p-JNK主要通過調控轉錄因子c-Jun的活性，上調促凋亡蛋白Bim、Bax等的表達引起細胞凋亡[14]。

研究發現，DN大鼠腎臟ERS反應與腎小管細胞的凋亡有關[15]，且高糖可激活足細胞內ERS相關的多條凋亡途徑，引起足細胞的損傷和凋亡[16]，均表明過度ERS在DN腎臟細胞凋亡過程中起著重要作用。研究證實，AngⅡ能上調心肌細胞GRP78的表達，并介導心肌細胞的凋亡，而AT1R特異性拮抗劑可降低DN大鼠腎組織GRP78及p-JNK蛋白的表達，抑制JNK途徑介導的腎臟細胞凋亡[6]。已知AT1-AA與AngⅡ均可通過AT1R而激活下游信號分子，并能經相似的信號通路發揮效應，故假設DN發電時，血清中持續存在的高滴度AT1-AA通過AT1R激活腎臟ERS反應，并活化JNK凋亡信號通路，使p-JNK凋亡蛋白的水平增高，促進腎臟細胞凋亡。但關于血清AT1-AA與腎臟ERS反應的研究，目前尚少。

本實驗中，我們利用Western blotting技術對DN組和NC組大鼠腎臟GRP78和p-JNK蛋白進行定量分析。結果顯示，DN組大鼠前述蛋白水平較NC組大鼠顯著升高，提示DN組大鼠腎臟發生了ERS反應，并激活了ERS相關的凋亡信號通路，與國內外的報道一致。為明確AT1-AA對DN大鼠腎臟ERS的影響，我們進一步研究了AT1-AA陽性和陰性亞組DN大鼠的Western blotting結果，發現AT1-AA陽性DN大鼠ERS標志蛋白GRP78和凋亡蛋白p-JNK的表達均不同程度高于AT1-AA陰性DN大鼠。據此我們認為，DN大鼠血清AT1-AA與腎臟ERS關系密切，AT1-AA可調控ERS標志蛋白GRP78的轉錄，且持續存在的AT1-AA的病理性刺激，又能激活ERS相關的JNK凋亡通路；與AT1-AA陰性DN大鼠比較，AT1-AA陽性大鼠腎組織p-JNK蛋白表達上調，腎臟細胞凋亡增加，也說明AT1-AA能通過ERS的JNK凋亡途徑促進腎臟細胞凋亡，證實了我們的假設。

綜上所述，血清AT1-AA的腎臟損害作用與其所致的腎臟細胞凋亡有關；AT1-AA可誘導DN大鼠腎臟ERS反應，并上調p-JNK凋亡蛋白的表達，通過JNK通路促進腎臟細胞凋亡。這些研究結果可為進一步完善DN的免疫機制及通過干擾ERS中的自身免疫環節來防治DN提供全新的理論支持。

[參 考 文 獻]

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