用阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征動物模型研究vaspin與胰島素信號通路的相關性*

莊向華， 倪一虹， 劉元濤， 孫愛麗， 孫福敦， 姜冬青， 李曉博， 陳詩鴻

(山東大學第二醫院內分泌科，山東 濟南 250033)

阻塞型睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome, OSAHS)是一種發病率較高，有潛在危險性的慢性疾病，可引起心、腦、血管多組織多器官的損害，其確切的發生機制尚不清楚。肥胖、機體脂肪含量增多在OSAHS的發生中具有重要的作用。脂肪組織可分泌許多脂肪因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、脂聯素(adiponectin, APN)、瘦素(leptin)、vaspin等，一方面以自分泌、旁分泌的形式調節脂肪細胞的生理功能，另一方面通過血循環作用于遠處組織。Vaspin是一種新發現的脂肪因子，可參與糖脂代謝。Zvonic等[1]研究人脂肪組織vaspin mRNA表達發現與肥胖、胰島素抵抗和糖代謝的參數相關。目前關于vaspin的基礎和臨床研究剛剛開始，脂肪因子vaspin功能及表達調控的分子機制有待進一步研究。既往研究結果發現OSAHS患者體內vaspin參與了糖脂代謝紊亂，并推測OSAHS并發胰島素抵抗和高vaspin水平低有關。本實驗旨在建立理想的模擬睡眠呼吸暫停綜合征的慢性間歇性缺氧大鼠模型，從mRNA和蛋白水平分析OSAHS中脂肪因子vaspin與胰島素信號途徑中關鍵因子的相關性。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

雄性Wistar大鼠22只，購于山東大學醫學院實驗動物中心，體重160～200 g，標準飼料、專人單籠飼養，明暗周期為12 h，自由取食和飲水，室溫18～25 ℃，相對濕度55%～80%。實驗期間，不控制飲水，墊料消毒，每日更換。適應性飼養1周后，隨機分為對照(control)組(n=12)，給予大鼠食用的標準飼料在常規環境中繼續飼養；慢性間歇低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)組(n=10)，參照王璋等[2]的方法加以改進，每天9:00～17:00將大鼠放入間歇性低氧艙內，關閉艙門，向間歇性低氧艙循環充入氮氣和壓縮空氣，每一循環為60 s，即30 s充入氮氣，隨之30 s充入壓縮空氣，由測氧儀監測間歇性低氧艙中的氧濃度，調節氣體流量，使每一循環間歇性低氧艙內的最低氧濃度達到4%～6%，然后再逐漸恢復至21%。測氧儀檢測結果提示：艙內氣體氧濃度(fraction of inspired oxygen，FiO2)在低氧氣體輸入后逐漸減低至7%～8%，在此水平持續約5～7 s，然后隨著空氣的輸入FiO2逐漸升至20%～21%，此實驗共持續8周。安靜環境下，將大鼠放入鼠袋內，待其安靜后應用尾套管法檢測大鼠尾動脈壓。每次測量3次，取3次數值的平均值。8周后2組大鼠空腹12 h，頸動脈取血測定血糖，并分離血清于 -70 ℃保存用于生化指標檢測；取血結束后處死動物，留取脂肪標本 -70 ℃保存備用。

2 實驗方法

2.1動脈血氣檢測 在預實驗中隨機選取4只大鼠間歇低氧條件下的動脈血氧飽和度變化情況。方法為：先將大鼠用苯巴比妥鈉(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，放入間歇缺氧艙中，進入麻醉狀態后，將其腹部朝上固定于解剖臺上，局部消毒后，切開腹部皮膚，2只在缺氧艙內氧濃度降至最低點30 s內直視下抽取腹主動脈血，應用動脈血樣行血氣分析，另外2只大鼠在循環充氣過程中當缺氧艙內氧濃度恢復至21%時同樣方法抽取。

2.2血清學指標檢測 大鼠尾靜脈取血，離心后分離血清，將血清樣品放入低溫冰箱中保存，供以后測定時使用。血糖測定采用葡萄糖氧化酶法，使用強生穩豪型One Touch Ultra Easy 血糖儀測定(Life Scan)。血清總膽固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)水平應用Beckman DXC 800型生化自動分析儀測定。血清胰島素采用放射免疫法測定(Linco Research)。用內環境穩態模式評估計算胰島素抵抗指數(homeostic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)：HOMA-IR =空腹血糖(fasting plasma glucose， FPG； mmol/L)×空腹胰島素(fasting insulin, FINS; mU/L)/22.5。采用酶聯免疫吸附法測定血清vaspin和脂聯素(武漢 USCN Science生物有限公司)濃度，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.3Real-time PCR 方法檢測mRNA表達 應用實時熒光定量PCR檢測vaspin、Akt 和GAPDH mRNA的表達。采用Trizol試劑(Invitrogen)提取總RNA，取100 mg 左右的脂肪組織，按照說明書操作，RNA于紫外分光光度計定量后于-80 ℃儲存備用。采用反轉錄反應試劑盒合成cDNA，按照說明書操作。PCR反應條件：93 ℃ 3 min；93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40個循環； 72 ℃ 10 min。于每個循環延伸反應最后時刻收集熒光信號；熔解曲線設置：95 ℃ 1 s，60 ℃ 2 min，以0.2 ℃/s的升溫速度升溫至95 ℃，升溫時連續收集熒光信號。應用實時熒光定量PCR儀(ABI Prism 7500 Detection System) 檢測。PCR引物由上海生物工程公司合成，引物序列如下： vaspin的上游引物為5’-AGTCGGAAAACCCACAACAG-3’，下游引物為 5’-CGGTCTTGCCTTCCTCTATG-3’； Akt上游引物為5’-ACCTCTGAGACCGACACCAG-3’，下游引物為5’-AGGAGAACTGGGGAAAGTGC-3’； GAPDH的上游引物為5’-GCTGATGCCCCCATGTTTG-3’，下游引物為5’-GGGTGGTGGACCTCATGGC-3’。

2.4Western blotting蛋白水平表達 在冰凍緩沖液中研碎脂肪組織(50 mg)，提取蛋白，在4 ℃、 20 000 r/min條件下離心20 min，小心吸取上清，用BCA法測定蛋白濃度，確定上樣量。取50 mg蛋白在95 ℃溫度下變性5 min，SDS-PAGE分離蛋白并轉移到PVDF膜。封閉1 h，應用vaspin、 Akt 和p-Akt抗體(Santa Cruz)孵育，洗膜后加5 μL II抗(1∶2 000)與10 mL封閉緩沖液中充分混勻，加入PVDF膜。取出PVDF膜放入發光液，反復澆PVDF膜約5 min，取出PVDF膜，吸干過多液體，保鮮膜包裹PVDF膜，置于曝光盒中，顯影、定影。GAPDH作為內參照，用多功能數字圖像分析儀Kodak Digital Science ID軟件進行分析。

3 統計學處理

全部實驗數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0統計學軟件進行分析，偏態分布變量經對數轉換后進行比較，兩樣本均數比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 動物體重、血壓變化

實驗前后2組大鼠之間體重無顯著差異，實驗前2組大鼠尾動脈收縮壓無顯著差異。實驗后CIH組大鼠收縮壓明顯高于正常對照組。

2 血壓和血氧飽和度檢測

隨機選擇4只大鼠進行預實驗，結果顯示缺氧最低點時大鼠尾動脈血壓23.4 mmHg～32.8 mmHg，最低血氧飽和度范圍為40.8%～65.9%，恢復艙內氧濃度至2l%后，測得尾動脈血壓為74.5 mmHg～102.9 mmHg，動脈血氧飽和度為93.8%～98.9%，符合人類阻塞型睡眠呼吸暫停綜合征診斷標準。

3 血清學指標

實驗結束后抽血測FPG、FINS、TG、TC、APN和vaspin濃度。結果提示：與control組相比，CIH組大鼠的FPG、FINS、TG、TC、vaspin和HOMA-IR(P<0.01或P<0.05)水平顯著升高，APN水平顯著降低(P<0.05)，2組大鼠體重未見顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 2組大鼠體重及各實驗室指標

4 相關分析

血清vaspin與血糖、脂代謝和胰島素抵抗的相關分析，Pearson相關分析結果提示vaspin濃度與FINS、TG和HOMA-IR顯著相關(P<0.05)，與FPG和TC無明顯相關(P>0.05)。

5 2組大鼠vaspin和Akt mRNA表達水平比較

Real-time PCR方法檢測大鼠脂肪組織vaspin和Akt的mRNA水平。與control組相比，CIH組大鼠脂肪組織vaspin的mRNA表達水平增加10%，Akt 的mRNA表達水平無明顯改變，見圖1。

6 2組大鼠脂肪組織vaspin和Akt蛋白表達的比較

CIH組大鼠腹部脂肪組織中vaspin蛋白水平較正常對照組大鼠顯著增加。2組大鼠脂肪組織中Akt的蛋白水平無明顯區別，而CIH組大鼠的p-Akt蛋白水平較control組明顯降低，見圖2。

Figure 2. Protein levels of vaspin, Akt and p-Akt in adipose tissue.Mean±SD.*P<0.05 vs control group.

討 論

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征是一種近20年來才被人們認識并引起重視的具有潛在危險的常見疾病[3]，其中最常見的是OSAHS。OSAHS主要表現為睡眠時反復上氣道塌陷導致打鼾、頻繁呼吸暫停及呼吸淺慢、低氧血癥、睡眠中斷，呼吸睡眠節律紊亂，反復出現呼吸暫停及覺醒；由于缺乏足夠的肺泡通氣導致反復發作的急性低氧血癥、高碳酸血癥。在睡眠時可發生急性呼吸衰碣，長期反復發作也可導致慢性呼吸衰竭、肺動脈高壓、肺心病、冠心病、腦動脈硬化癥等疾病，這些疾病之間通常存在一個共同的病理生理狀態，即胰島素抵抗(insulin resistance, IR)。

本研究的動物造模實驗中提示大鼠存在代謝紊亂，對比2組大鼠，CIH組大鼠的血壓、空腹血糖、空腹胰島素、甘油三酯、膽固醇、HOMA-IR和vaspin水平顯著高于正常對照組，而脂聯素水平顯著低于正常對照組；顯示CIH大鼠出現了機體代謝紊亂。近年來文獻報道模擬OSAHS患者低氧模式的慢性間歇低氧可導致大鼠持續性血壓升高，其機制可能有：(1)慢性間歇低氧可能通過激活腎素-血管緊張素系統而導致高血壓發生；(2)機體對乙酰膽堿和異丙腎上腺素舒血管反應降低；(3)慢性低氧導致腎素-血管緊張素-醛固酮活性增加等。我們用大鼠尾壓測量儀測量血壓，結果表明間歇低氧組大鼠的尾動脈血壓明顯高于正常對照組，說明慢性間歇低氧導致了大鼠持續性血壓升高。人群的研究顯示OSAHS患者中糖耐量異常發生幾率顯著高于正常對照組，普通人群中糖尿病的發病率約5%，而在50～59歲2型糖尿病中OSAHS發病率可高達17%。OSAHS患者存在胰島素的反應性下降和胰島素抵抗，最終導致高血糖。OSAHS動物模型亦發現2組動物的胰島素抵抗指數存在顯著差別，提示OSAHS與胰島素抵抗顯著相關。

脂肪細胞因子在OSHAS致胰島素抵抗中亦起到重要的作用。研究顯示脂肪因子參與了胰島素敏感性、脂質代謝、炎癥和免疫應答等過程，與肥胖、糖脂代謝異常等相關性疾病密切相關[6]。脂聯素是專一由脂肪細胞分泌的一種糖蛋白，是目前發現的明確具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、增加胰島素敏感性及改善胰島素抵抗等多種生物學效應的脂肪因子[4]。Zhang等[5]研究發現OSAHS組血清脂聯素水平較對照組明顯下降，在控制BMI、腰圍、頸圍和胰島素抵抗指數這些因素后，血清脂聯素水平與AHI呈明顯負相關，與動脈血氧飽和度呈正相關。我們的研究結果顯示，與正常對照組相比，CIH組大鼠脂聯素水平顯著降低，與既往研究結果一致，進一步證明了脂聯素在OSAHS患者中的意義。

Vaspin屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，是由約395個氨基酸組成的具有疏水性N端的單肽。Vaspin與胰島素抵抗相關指標的相關性目前亦結論不一。在脂肪組織的體外培養研究中，給予vaspin后可逆轉肥胖小鼠體內與胰島素抵抗相關基因的表達，如瘦素、抵抗素、TNF-α和葡萄糖轉運載體4等。基因芯片檢測顯示，vaspin治療肥胖小鼠可逆轉50%的高脂肪或高糖飲食所誘導的基因表達，提示vaspin可通過調控脂肪組織中與胰島素抵抗相關基因的表達而改善胰島素敏感性。也有研究未發現重組人vaspin對培養的3T3-L1脂肪細胞具有葡萄糖代謝調節基因表達的作用以及對脂肪細胞葡萄糖攝取的影響作用，推測其原因可能是由于肥胖狀態下，vaspin發揮胰島素增敏作用依賴于其靶向絲氨酸蛋白酶的存在；但該絲氨酸蛋白酶存在于白色脂肪組織中，不存在于培養的脂肪細胞中。本研究結果顯示CIH組大鼠血清vaspin濃度增加，且其血清濃度與胰島素、HOMA-IR、SaO2水平相關，提示其與胰島素抵抗是相關的。而取脂肪組織進行實時熒光定量PCR檢測，結果提示vaspin mRNA表達水平在CIH大鼠的脂肪組織中較正常對照組大鼠明顯增加，應用Western blotting檢查，結果提示vaspin蛋白在脂肪組織表達亦呈升高趨勢。

磷酯酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)家族是生長因子超家族信號傳導過程中的重要分子，是一類特異性地催化磷酯酰肌醇3位羥基磷酸化，產生具有第二信使作用的肌醇脂物質的激酶。Akt通路主要負責由PI3K始動的生物信息的傳導, Akt處于這一通路的中心環節，它在細胞代謝、細胞周期調控、細胞生長凋亡等多種生物學過程中發揮著重要作用，與胰島素抵抗的發生發展密切相關。PI3K/Akt信號通路是胰島素的主要信號通路，我們選擇在PI3K/Akt信號通路中最重要的p-Akt和Akt作用研究靶點，探討在OSAHS中胰島素抵抗的特點。應用Western blotting方法檢測2組動物脂肪組織蛋白表達水平，提示在2組Akt蛋白表達無明顯差異，而p-Akt蛋白表達有顯著差異，實驗組的CIH大鼠p-Akt蛋白表達水平較正常對照組顯著下降，進一步支持我們造模的CIH大鼠存在顯著的胰島素抵抗，同時提示vaspin蛋白在胰島素信號途徑中可能存在潛在作用。

綜上所述，通過間歇性低氧制造的CIH大鼠中，存在典型的胰島素抵抗，同時2組動物中vaspin濃度以及蛋白表達存在差異。若今后能夠進一步明確vaspin的在OSAHS發病機制中的確切作用將有助于我們對于OSAHS的治療。另一方面，雖然基礎研究發現vaspin具有胰島素增敏作用，但臨床研究中vaspin與胰島素敏感性之間的關系尚存在分歧，今后尚需大樣本的臨床研究進一步證實。

[參 考 文 獻]

[1] Zvonic S, Lefevre M, Kilroy G, et al. Secretome of primary cultures of human adipose-derived stem cells: modulation of serpins by adipogenesis[J]. Mol Cell Proteomics, 2007, 6(1):18-28.

[2] 王 璋，司良毅，廖友斌. 大鼠睡眠呼吸暫停綜合征動物模型的建立[J]. 中國實驗動物學報, 2006, 14(1):40-43.

[3] 劉輝國, 林 玫, 管 頻, 等. 阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征外周血IGF-2 及其mRNA水平變化的初步研究[J]. 中國病理生理雜志, 2007,23(9): 1782-1785.

[4] 孫升云，黃 進，孟民杰，等. 山荷減肥顆粒對飲食誘導肥胖大鼠瘦素、脂聯素、抵抗素的影響[J]. 中國病理生理雜志，2009,25(6):1170-1174.

[5] Zhang XL, Yin KS, Wang H, et al. Serum adiponectin levels in adult male patients with obstructive sleep apnea hypopnea syndrome[J]. Respiration, 2006, 73(1):73-77.

[6] Carneiro G, Togeiro SM, Ribeiro-Filho FF, et al. Continuous positive airway pressure therapy improves hypoadiponectinemia in severe obese men with obstructive sleep apnea without changes in insulin resistance[J]. Metab Syndr Relat Disord, 2009, 7(6):537-542.