宮內感染致腦損傷對仔鼠認知發育和海馬神經發生的影響*

江佩芳， 朱 濤， 楊翠微， 高 峰， 顧偉忠， 袁天明， 俞惠民△

(1浙江大學醫學院附屬兒童醫院神經內科，浙江 杭州 310003； 2浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院ICU，浙江 杭州 310016)

妊娠期宮內感染導致的胎兒炎癥反應綜合征是造成早產和早產兒腦白質損傷(white matter damage, WMD)的最常見原因，是兒童認知功能發育障礙的一個重要危險因素[1]。WMD臨床病理特點主要是腦白質出現彌漫的反應性星形細胞膠質化、成髓鞘少突膠質細胞損傷和腦室周圍白質軟化(periventri-cular leukomalacia, PVL)[2]。它將會影響神經系統發育，造成語言、視覺、空間、記憶和注意力等認知功能損害。因此，宮內感染與兒童認知功能發育密切相關。

炎癥反應猶如一把雙刃劍，其過程中釋放的一些細胞因子可以增加血腦屏障通透性，引起腦水腫，加重腦損傷，抑制神經發生[3]。還有一些細胞因子可以刺激神經發生，促進神經干細胞增殖。研究發現缺氧缺血能誘導海馬神經前體細胞增殖，神經干細胞向損傷區域遷移，分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞；并功能性整合到海馬神經環路中，促進神經軸突、樹突發育，以及突觸生成和功能性修飾[4]。雖然缺氧缺血可以誘導海馬神經發生，但是宮內感染與神經發生的相關性研究未見報道。我們旨在確證宮內感染致仔鼠腦損傷對認知發育和海馬神經發生的影響，為這類患兒的病理學和治療學研究提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

清潔級健康成年Sprague-Dawley孕鼠(胎齡15 d)，購自浙江省醫學科學院實驗動物中心，體重400～450 g，按隨機數字表法分為造模組(8只)和對照組(7只)。繁殖后的2組新生雄性大鼠按隨機數字表法分為宮內感染組(35只)和對照組(35只)。實驗期間，室溫控制在(24±1) ℃，濕度控制在60%左右，大鼠自由飲食、飲水，晝夜周期12 h/12 h(光照時間為8：00-20：00)。實驗過程中人道主義對待實驗動物，盡量減少實驗動物使用量，設法在處死實驗動物時使其少受痛苦。

2 方法

2.1宮內感染模型制備 參照本課題組先前的成功造模方法[5]，取胎齡15 d 的Sprague-Dawley孕鼠15只，隨機分為2組：(1) 造模組(n=8)予腹腔內注射2%戊巴比妥鈉2 mL/kg，麻醉后于左右兩側宮頸內各注射大腸桿菌(E.coli)稀釋液0.2 mL，術后置于清潔籠內，常規喂養；(2) 對照組(n=7)于麻醉后左右兩側宮頸內各注射無菌生理鹽水0.2 mL。

根據文獻[6]的標準，凡宮內感染組鼠的子宮及胎盤內血管充血、水腫，并見大量中性粒細胞浸潤者判斷為宮內感染。

待孕鼠自然分娩(胎齡約20 d)，2組雄性仔鼠按隨機數字表法分為宮內感染組(E.coli)和對照組(control)。

2.2Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮DMS-2系統由浙江大學紫金港動物房中心實驗室提供，包括一個圓形不銹鋼水池，直徑為120 cm，高60 cm。池壁上標有4個不同符號，將水池等分為4個象限，代表4個入水點。目標象限的中央放置一高度50 cm直徑10 cm的圓形隱藏平臺，平臺低于水面1 cm，水溫保持在(22±0.5) ℃。預先在水池中注入清水，加入炭素墨水使池水變為不透明的黑色以隱藏平臺并便于攝像。迷宮上方安置帶有顯示系統的攝像機，計算機自動跟蹤計時并同步記錄大鼠的游泳軌跡，Morris水迷宮數據采集和分析軟件記錄相關數據及圖像結果。整個實驗期間水池、光源、鼠籠等實驗室各物件的位置保持不變，實驗在隔音的房間內進行。

2.2.1迷宮適應訓練和游泳能力檢驗 正式開始實驗前1 d，撤去平臺，選擇池壁一固定點，讓大鼠面向池壁入水，自由游泳2 min，并錄下游泳軌跡。目的是讓大鼠適應環境，并對大鼠游泳能力進行初步檢驗，對明顯異常者予以剔除。

2.2.2定位航行實驗 用于檢測大鼠的近期學習記憶能力。2組28日齡大鼠(n=10)連續接受5 d訓練，每天將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中，每次實驗以120 s為限，記錄動物尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期(escape latency, EL)，以爬上平臺所需時間作為學習和記憶成績。若設定時間內未找到平臺，計算機停止跟蹤，記錄時間為120 s，未找到平臺的動物由實驗者將其引上平臺。每次訓練間隔30 s，即做好一次訓練后讓大鼠在平臺上休息停留30 s后再繼續下一次訓練。當天訓練完成后，迅速將動物洗凈擦干，置于加熱器旁，以防動物低體溫。計算每天2組大鼠4次逃避潛伏期的平均值。

2.2.3遠期記憶保持實驗 定位航行實驗結束后，休息5 d，即水迷宮的第10天，再對全部大鼠進行一次水迷宮測試，方法同前，測試其遠期記憶保持能力。

2.3標本制備 2組仔鼠隨機分組，每組每時點5只。從8：00開始給1 d齡大鼠腹腔注射5-溴-2’-脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine, BrdU； 50 mg/kg, Sigma)，每天2次，連續注射3 d，標記海馬S期先祖細胞，以反映齒狀回細胞的增殖情況。另外于生后1 d齡開始連續腹腔注射相同劑量BrdU 7 d，待28 d齡時行細胞存活分析。大鼠斷頭處死，取出腦組織先進行大體解剖學觀察，再將腦組織置于4%多聚甲醛中固定24～48 h后石蠟包埋，固定后冠狀切面連續切片每隔3張取1張切片組成1套，每套切片約5張，每片厚4 μm，然后對上述切片進行TUNEL和免疫組化分析。

2.4TUNEL分析 對2組標本進行TUNEL染色，實驗操作參照試劑說明書進行。石蠟切片經二甲苯脫蠟，乙醇水化，置3% H2O2中孵育15 min，蛋白酶K消化液作用20 min，加入TUNEL反應混合物，于37 ℃烤箱中孵育60 min，滴加轉化劑POD，于37 ℃烤箱中孵育30 min，DAB顯色20 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察切片中細胞形態，TUNEL染色陽性的凋亡細胞呈棕色。倒置顯微鏡下隨機取5個視野觀察陽性細胞并計數，取平均值，計算出細胞凋亡指數(apoptosis index，AI)=(凋亡細胞數÷細胞總數)×100%。

2.5Caspase-3免疫組化分析 按照SABC免疫組化試劑盒進行操作。切片蒸餾水新鮮配制3%H2O2室溫10 min，PBS洗3次。滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min甩去多余液體不洗。滴加1∶100稀釋的Ⅰ抗，37 ℃1 h，4 ℃過夜。復溫l h，PBS洗3次，滴加生物素化Ⅱ抗，37 ℃ 20 min，PBS洗3次。滴加SABC，37 ℃ 30 min，PBS洗4次，DAB顯色。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹酯封片。陰性對照用PBS代替Ⅰ抗。倒置顯微鏡下隨機取5個視野觀察陽性細胞并計數，取平均值。

2.6BrdU免疫組化 切片常規脫蠟、透明至水化。切片置于0.01 mol/L枸櫞酸鈉溶液(pH 6.0)高溫高壓抗原修復1 min，0.025% PBST(含Triton X-100)漂洗3次。3% H2O2室溫下消化10 min以滅活內源性過氧化物酶，0.025% PBST漂洗3次。羊血清37 ℃封閉20 min。以小鼠抗BrdU抗體(1∶50, Santa Cruz)37 ℃孵育1 h；0.025% PBST漂洗3次。滴加Envision 檢測試劑，37 ℃孵育1 h；0.025% PBST漂洗3次。室溫下DAB顯色，鏡控2 min。蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。胞漿內呈棕黃色染色為BrdU陽性細胞，選取海馬DG區，200倍視野下計數每0.01 mm2面積中BrdU陽性細胞數量，每張切片計數5個視野，取平均值。

3 統計學處理

實驗數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析。細胞增殖分析、TUNEL分析和caspase-3免疫組化分析采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)，以Tukey法進行組間的兩兩比較；定位航行實驗和遠期記憶保持實驗采用重復測量方差分析(one-way repeated measures ANOVA)，以Tukey法進行組間的兩兩比較；細胞存活分析采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 宮內感染致仔鼠腦損傷的大體解剖學觀察

空白對照組雙側大腦對稱，飽滿，腦組織表面血管清晰，腦區結構完整。宮內感染組雙側大腦對稱，腦組織輕度萎縮，表面血管增粗、紊亂，腦區結構完整，未見壞死、液化、空洞現象，見圖1。

Figure 1. Effect of intrauterine infection on anatomy observation of brain.

2 宮內感染對仔鼠海馬神經細胞凋亡的影響

TUNEL染色分析顯示宮內感染組TUNEL陽性細胞數較對照組顯著增加(P<0.05)，另一凋亡標志物caspase-3染色顯示caspase-3陽性細胞數較對照組顯著增加(P<0.05)，見圖2。

3 宮內感染對仔鼠認知功能的影響

3.1游泳能力的檢測 正式開始實驗前1 d，撤去平臺，選擇池壁一固定點，讓大鼠面向池壁入水，自由游泳2 min，并錄下游泳軌跡。各組大鼠第l d通過測試，全部大鼠游泳能力均正常。

3.2定位航行實驗 宮內感染組游泳軌跡較對照組雜亂，重復測量方差分析顯示組別因素(group)、時間因素(day)以及時間和組別(day*group)的交互作用均具有統計學意義(P<0.01)。同一時間組間比較結果顯示，宮內感染組第1天到第4天的逃避潛伏期均顯著延長(P<0.05)，第5天2組的逃避潛伏期無統計學差異(P>0.05)，說明宮內感染可以影響仔鼠的近期學習記憶能力，見圖3、表1。

3.3遠期記憶保持實驗 遠期記憶保持實驗從第10 d開始，宮內感染組游泳軌跡較對照組雜亂，重復測量方差分析顯示組別因素(group)、時間因素(day)以及時間和組別(day*group)的交互作用均具有統計學意義(P<0.01)。宮內感染組逃避潛伏期較對照組顯著延長(P<0.05)，說明宮內感染可以影響仔鼠的遠期學習記憶能力，見圖4、表2。

Figure 3. Effect of intrauterine infection on offspring’s learning and memory ability. Figure shows the trace of place-navigation test from control group and E. coli group at different time points.

表1 2組大鼠定位航行試驗的逃避潛伏期比較

Figure 4. Effect of intrauterine infection on offspring’s long-term memory ability. Figure shows the trace of long-term memory test from control group and E. coli group at different time points.

表2 2組大鼠遠期記憶保持實驗的逃避潛伏期比較

4 宮內感染對仔鼠海馬神經發生的影響

細胞增殖分析表明宮內感染組仔鼠于3、7和14日齡時海馬齒狀回BrdU陽性細胞數較對照組顯著增加(P<0.05)，于7日齡時達高峰。細胞存活分析顯示28日齡時宮內感染組與對照組仔鼠海馬齒狀回BrdU陽性細胞數無統計學差異(P>0.05)，見圖5。

Figure 5. Effect of intrauterine infection on proliferation and survival of newborn cells in the dentate gyrus. The cells with BrdU (brown stained) that clearly localized in the nucleus were counted as BrdU-labeled cells. A: representative microphotographs of BrdU-labeled cells and quantification of BrdU-labeled cells during postnatal 28 days in the control and E. coli rats； B：representative microphotographs of BrdU-labeled cells and quantification of total BrdU-labeled cells at postnatal day 28 in the control and E. coli rats. Scale bars=200 μm. *P<0.05 vs control.

討 論

學習記憶是大腦的高級功能，學習記憶及認知功能減退是腦損傷導致智力低下的一個重要標志。海馬結構完整性和突觸可塑性對空間學習記憶能力的正常發育非常重要[7]。研究認為新生期缺氧缺血性腦損傷主要累及皮層、海馬，出現神經元腫脹變性、大量核固縮、核碎片、空泡形成和排列紊亂，進而造成近期、遠期學習記憶功能缺陷，遺留神經系統后遺癥[8]。雖然缺氧缺血性腦損傷與認知功能缺陷的報道較多，但關于宮內感染造成腦損傷與認知發育的研究罕見報道。

本研究發現宮內感染可導致仔鼠腦組織萎縮，但腦區結構保持完整。結合前期研究發現宮內感染造成腦白質結構稀疏、呈篩網狀改變，少數出現凝固性壞死和囊狀病變。由此我們推斷腦白質可能是宮內感染腦損傷中最易受累的部位。星形膠質細胞是中樞神經系統的基本骨架，合成和分泌眾多的神經營養因子、趨化因子和細胞因子，參與中樞神經系統信息轉導與免疫反應[9]。輕度星形膠質細胞活化被證實有神經保護作用，而過度活化可導致星形膠質細胞凋亡，垂死的星形膠質細胞呈現神經毒性作用，進一步殺死鄰近細胞[10]。因此，我們推測星形膠質細胞在腦白質損傷的病理生理機制中扮演了重要角色，宮內感染后過度活化的星形膠質細胞可影響海馬神經元的營養支持及細胞功能，造成神經細胞體積縮小、數量減少并最終導致大腦萎縮。

宮內感染腦白質損傷的病理生理機制復雜，與認知發育障礙的相關機制尚未完全闡明，有學者認為細胞凋亡可能是系統性炎癥反應中的重要機制之一[11]。本研究發現宮內感染后仔鼠海馬神經元大量凋亡，結合前期研究發現宮內感染后仔鼠腦內細胞因子，一氧化氮合成及誘導型一氧化氮合酶表達增加，我們推斷宮內感染促發一系列炎癥級聯反應，誘發炎癥風暴，促進神經細胞凋亡。神經細胞凋亡導致海馬神經元數量減少、功能受累，海馬神經軸突、樹突發育不良、突觸生成受阻和功能性修飾受累[12]。所以，宮內感染后仔鼠的近期及遠期記憶保持能力均顯著下降，可能與神經細胞凋亡密切相關。

本研究還發現隨著游泳訓練時間延長，2組逃避潛伏期的差距逐漸縮短，提示宮內感染腦損傷后神經細胞可能存在一定的自身修復能力。多年來研究者們一直認為神經元不能再生，但隨著干細胞研究的深入，發現成年哺乳動物腦內存在具有多向分化潛能的神經干細胞和持續的神經發生現象，為補充因損傷、衰老而喪失的神經元或膠質細胞提供來源[13-14]。雖然炎癥損傷與神經發生的關系目前還不明確，但Bakirci等[15]報道在膿毒癥模型中發現了神經發生現象。本研究也發現宮內感染導致海馬神經元凋亡的同時也能促進神經發生。我們推測炎癥物質在炎癥亞急性期后作為神經營養因子，作用于神經發生微環境，調節神經干細胞增殖、遷移和分化，發揮神經保護作用，這種神經自身修復的潛能可能是腦白質損傷后認知功能障礙得到一定程度改善的重要物質基礎。但是我們發現早期增殖的細胞大部分不能持續存活，推測可能沒有適當的微環境刺激，神經發生得不到適當調節，這些增殖的神經干細胞互相競爭，一部分因營養耗竭而死亡，一部分不能正常分化為成熟的星形膠質細胞和神經元，這可能是宮內感染后仔鼠出現認知發育障礙后遺癥的重要原因。

雖然宮內炎癥反應造成腦損傷后可以促進神經發生，但是炎癥反應何時以何種強度刺激有利于神經發生，以及如何通過調控炎癥反應來影響損傷組織修復和神經功能恢復等問題還不明確。目前研究發現cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)是一種重要的核轉錄因子，在神經元再生、突觸形成及學習記憶等方面具有重要的調節作用，是細胞內多種信號通路的一種關鍵成分。動物實驗發現CREB基因敲除小鼠多死于圍生期，與中樞神經系統神經元大量缺失有關。研究還發現PI3K/Akt信號通路可參與調節神經干細胞的增殖、神經前體細胞遷移、分化以及突觸形成，保持神經干細胞的維持及其分化的平衡。但是PI3K/Akt信號通路與CREB是否共同參與宮內感染后的神經發生，這三者之間的關系目前尚未明確。因此，宮內感染后神經發生的相關分子機制研究是本課題組今后工作的研究方向。對這一過程的探討，無疑將為研究宮內感染后腦損傷患兒認知發育障礙的治療提供新的手段。

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