JNK/MCP-1信號通路在姜黃素抗糖尿病神經病理性疼痛中的作用*

鄭昌健， 胡 涵， 曹 紅， 李 軍

(溫州醫科大學附屬第二醫院麻醉科，疼痛醫學研究所，浙江 溫州 325027)

糖尿病是威脅人類健康的常見疾病，糖尿病神經病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是糖尿病最常見的慢性并發癥之一，臨床上以自發痛、誘發痛、痛覺過敏、痛覺超敏以及異常性疼痛為特征，嚴重影響患者生活質量[1]。c-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase, JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族成員之一。趨化因子是一類能趨化細胞定向移動的小分子分泌蛋白，屬于細胞因子中的最大家族，單核細胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)屬于趨化因子CC亞家族，相關研究表明JNK/MCP-1信號通路是神經病理性疼痛的重要發生機制。姜黃素作為姜科植物中的一種酚性色素，具有抗炎、抗氧化等作用[2]。JNK/MCP-1信號通路在2型糖尿病神經病理性疼痛中的機制尚未見報道，本實驗觀察姜黃素對2型DNP痛閾的影響以及其減輕痛覺過敏的機制是否與JNK/MCP-1信號通路有關。

材 料 和 方 法

1 材料

姜黃素、玉米油和鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購于Sigma；p-JNK多克隆抗體購于Cell Signaling Technology；兔抗MCP-1(H-190)購于Novus；2390型Electronic von Fery 觸覺測痛儀及II Tc336型甩尾足底測試儀購自IITC；兔二步法試劑盒及DAB顯色劑購自北京中杉金橋公司。

2 動物模型制備和實驗分組

雄性SD大鼠，體重160～180 g，清潔級，由溫州醫學院實驗動物中心提供，適應環境3 d后給予高脂高糖飼料(67%普通飼料+10%豬油+20%蔗糖+2%膽固醇+1%膽酸鈉)。保持室溫在20～25 ℃，濕度在40%～60%，于第0周、第8周分別測體重、血糖，并取尾靜脈血測血清胰島素和胰島素敏感性。飼養8周后大鼠禁食12 h，再給予35 mg/kg 1% STZ溶液單次腹腔注射。3 d后測定大鼠尾靜脈血糖，血糖穩定且≥16.7 mmol/L者入選，若血糖未達標，則再次追加STZ，3 d后測定大鼠尾靜脈血糖。14 d后測大鼠痛閾，降低到基礎值的85%以下者為2型糖尿病神經病理性痛大鼠模型組，否則剔除。采用隨機數字表法，將2型糖尿病神經病理性痛大鼠隨機分為(n=27)：2型糖尿病神經病理性痛組(DNP組)，不做任何處理；2型糖尿病神經病理性痛+姜黃素100 mg·kg-1·d-1組(Cur組)；2型糖尿病神經病理性痛+溶劑玉米油4 mg·kg-1·d-1組(DSC組)；2型糖尿病神經病理性痛+JNK抑制劑(10 μL/d、0.5 g/L)組(DJ組)；2型糖尿病神經病理性痛+抑制劑溶劑(10% DMSO 10 μL/d)對照組(DJS組)；2型糖尿病神經病理性痛+姜黃素(100 mg·kg-1·d-1)+MCP-1激動劑(10 μL/d、1 mg/L)組(DM組)。另取27只喂以普通飼料的大鼠作為正常對照組(C組)。各組連續給藥14 d。

3 方法

3.1胰島素敏感性指數(insulin sensitivity index，ISI)測定 在第8周時對照組和模型組大鼠，禁飲禁食12 h后測定其血糖值，同時通過尾靜脈取血，利用胰島素ELISA試劑盒測定其血清胰島素水平。按照公式 1/空腹血糖×空腹計算胰島素敏感性指數，此計算出的數值為非正態分布，故采用其自然對數進行計算。

3.2痛閾測定 在STZ注射前測定大鼠的機械縮足痛閾(mechanical withdrawal threshold, MWT)和熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)作為痛閾的基礎值，在STZ注射2周后和各給藥組的第3、7、14天測定機械縮足痛閾和熱縮足潛伏期。

3.3機械縮足痛閾的測定 將大鼠置于底為金屬篩網(1 cm×1 cm)的透明有機玻璃箱(22 cm×22 cm×22 cm)中，玻璃箱被架高于實驗臺面 50 cm。待大鼠在箱中適應15 min后，用IITC-2390 型Electronic von Fery觸覺測痛儀垂直刺激大鼠雙后趾，單次刺激時間≤ 1 s，刺激間隔10 s。記錄測試時大鼠出現抬足或舔足行為時的刺激強度值，測5次取平均值即為其MWT。

3.4熱縮足潛伏期測定 用IITC336甩尾足底測試儀于上述各時點測定TWL。將大鼠置于3 mm厚的玻璃板上，使用熱輻射照射其后趾相應部位，記錄從照射到縮爪回避的時間，每只大鼠雙足各測5次，每次間隔5 min，取后3次的平均值即為其TWL。

3.5標本取材和處理 分別于注藥后3 d、7 d、14 d隨機選取3只各組的大鼠取其腰膨大和L4～6背根神經節(dorsal root gan-glion；DRG)，并放入超低溫冰箱中備用于Western blotting實驗。另取3只各組大鼠麻醉后經心臟插管灌注4%多聚甲醛，取L4～6節段脊髓及DRG，固定后石蠟包埋，切片。

3.6Western blotting 利用BCA蛋白測試盒測出總蛋白。按照35 μg、15 μL每孔上樣，10%聚丙烯凝膠電泳濃縮膠40 V，分離膠100 V分離，切膠后將相應分子量條帶上的目的蛋白和內參照蛋白在300 mA條件下轉到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，再分別加入JNK抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶1 000)中，4 ℃孵育過夜，次日取出條帶用TBST洗膜3次，每次5 min，Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育2 h后用TBST洗膜(同前)、ECL曝光，采用AlphaEasefcTMSoftware進行分析，以目的蛋白/GAPDH的灰度比值作為目的蛋白表達的相對強度。

3.7ELISA測定目的蛋白 組織勻將用BCA試劑盒測定總蛋白，按照每孔200 mg的量與ddH2O配成100 μL總體積，稀釋10倍后按照ELISA 說明書上的操作順序進行操作。根據標準曲線計算實際濃度，以ng/L表示。所有A值都應減除空白值后再行計算。以標準品濃度為橫坐標，A值為縱坐標，做出標準曲線。根據樣品A值計算相應MCP-1含量，再乘以稀釋倍數。

4 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示。2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以最小顯著差異法(LSD)行兩兩比較。用 SPSS 17.0統計軟件處理，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠血糖、胰島素敏感指數變化情況

與對照組比較，模型組大鼠的血糖在第8周后升高，但差異無統計學意義，未達到糖尿病診斷標準；空腹血糖濃度明顯升高(P<0.05)，但沒達到糖尿病診斷標準；空腹胰島素濃度明顯升高(P<0.05)。胰島素敏感性指數明顯下降(P<0.05),見表1。

表1 對照組和模型組血糖、胰島素和ISI的比較

2 各組MWT和TWL的變化

與基礎值相比，DNP組、Cur組、DSC組、DJ組、DJS組和DM組在STZ注藥的2周后MWT和TWL出現明顯降低；與DNP組相比，Cur組和DJ組在分別給予姜黃素和JNK抑制劑7 d后MWT和TWL開始升高(P<0.05)。DM組在給予MCP-1激動劑后MWT和TWL明顯下降(P<0.05)，但與Cur組對比沒有統計學意義。DSC組、DJS組與DNP組相比差異無顯著,見表2。

表2 各組大鼠不同時點TWL和MWT的變化

3 Western blotting檢測脊髓背角和DRG中p-JNK的表達

與對照組相比，DNP組、Cur組、DSC組、DJ組、DJS組和DM組p-JNK表達升高(P<0.05)；與DNP組相比，Cur組、DJ組、DM組在分別給予姜黃素和JNK抑制劑7 d、14 d時表達下降(P<0.05)。DSC組、DJS組與DNP組相比差異不顯著,見圖1、2。

Figure 1. p-JNK expression in DRG detected by Western blotting.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs C group; #P<0.05 vs DNP group.

Figure 2. p-JNK expression in dorsal cord detected by Western blotting.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs C group; #P<0.05 vs DNP group.

4 ELISA法測定大鼠脊髓背角和DRG中MCP-1表達

與對照組相比，DNP組、Cur組、DSC組、DJ組、DJS組和DM組MCP-1表達升高(P<0.05)；與DNP組相比，Cur組、DJ組在分別給予姜黃素和JNK抑制劑7 d、14 d時表達下降(P<0.05),DM組表達顯著增高(P<0.05)。DSC組、DJS組與DNP組相比差異無顯著,見圖3、4。

Figure 3. MCP-1 expression in DRG detected by ELISA.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs C group; #P<0.05 vs DNP group.

Figure 4. MCP-1 expression in dorsal cord detected by ELISA.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs C group; #P<0.05 vs DNP group.

討 論

糖尿病神經病理性疼痛是糖尿病的一種常見并發癥，主要表現為異常性疼痛、觸誘發痛和痛覺過敏[3-4]。高糖、糖基化終末產物增加等因素所導致的氧化應激和線粒體功能損害，進而導致神經細胞和施旺細胞的凋亡[5-7]，在DNP中起著重要作用。近年來對1型糖尿病所致的神經病變的研究已經取得一定進展，但2型糖尿病所致的神經病變的機制尚未明確。

JNK是MAPK家族成員。又稱為“應激激活蛋白激酶”， 趨化因子是一類能趨化細胞定向移動的小分子分泌蛋白，屬于細胞因子中的最大家族。MCP-1屬于趨化因子CC亞家族。MCP-1主要通過受體CCR2實現其生物學效應，趨化因子受體可以激活不同的信號轉導通路，例如MAPK途徑、蛋白激酶C途徑、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K))途徑[8]，從而導致不同的生物學效應。

神經損傷主要通過初級感覺神經元產生自發電位(異位沖動)和脊髓背角突觸傳遞效率的持續性增強(LTP)導致病理性疼痛，研究表明TNF-α在神經病理性疼痛中起著重要作用，神經損傷可以激活JNK使轉錄因子c-Jun磷酸化從而促使細胞釋放MCP-1、TNF-α等炎癥介質，通過作用于脊髓背角及背根神經節上的趨化因子受體(CCR2)、腫瘤壞死因子受體(TNFR1、TNFR2)，導致初級神經元上Na1.3和Na1.8過度表達引起異位沖動[9-11]。同時TNF-α還可以通過激活JNK從而激活瞬時受體電位香草酸亞型及興奮性受體NAMD通道，引起胞內Ca2+升高，導致鈣/鈣調素依賴的蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ)自身磷酸化，從而使其發生自身激活，激活后的CaMKⅡ磷酸化突觸后靶蛋白α-氨基羥甲惡唑丙酸、突觸素Ⅰ、微管相關蛋白，使脊髓背角神經元敏感化和痛覺增強，參與LTP產生和維持[12],導致痛覺過敏。

這些都說明JNK/MCP-1信號通路在神經病理性疼痛的發病機制中發揮著重要作用。我們的研究顯示正常情況下大鼠的脊髓和DRG中的p-JNK和MCP-1表達很少，但在STZ誘導后p-JNK、MCP-1表達明顯升高，JNK抑制劑可以明顯下調MCP-1的表達，但MCP-1激動劑不能使JNK表達升高，提示JNK/MCP-1的激活在糖尿病神經病理性疼痛的發生和發展中起著重要作用。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚性色素。姜黃素具有多方面藥理作用，如抗炎、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤及抗微生物等作用。近年來研究表明，姜黃素具有強大的抗氧化應激作用。相關研究表明，姜黃素可以抑制AP-1、NF-κB等核內因子的轉位從而減少MCP-1的釋放，從而起到緩解DNP的作用，同時姜黃素可以通過抑制TNF-α、IL-6等炎癥物質的釋放[2，13]，來達到治療DNP的目的。

本實驗發現姜黃素可明顯減輕2型糖尿病神經病理性痛大鼠痛覺過敏，且可使p-JNK和MCP-1表達相比糖尿病組發生明顯下降，同時JNK抑制劑組中MCP-1出現下降，MCP-1激動劑組并沒有出現JNK的增高，這些說明MCP-1可能是JNK的一個下游因子，故推測姜黃素治療糖尿病神經病理性疼痛的機制可能與JNK/MCP-1信號通路有關系。抑制該通路可能成為治療2型糖尿病神經病理性痛的一個新的研究方向。

[參 考 文 獻]

[1] Van Acker K, Bouhassira D, De Bacquer D, et al. Prevalence and impact on quality of life peripheral neuropathy with or without neuropathic pain in type 1 and type 2 diabetic patients attending hospital outpatients clinics[J]. Diabetes Metab, 2009, 35(3):206-213.

[2] Sharma S, Kulkarni SK, Aqrewala JN, et al. Curcumin attenuates thermal hyperalgesia in a diabetic mouse model of neuropathic pain[J]. Eur J Pharmacol, 2006, 536(3):256-261.

[3] Boulton AJ, Malik RA, Arezzo JC, et al .Diabetic somatic neuropathies[J]. Diabetes Care, 2004, 27(6):1458-1486.

[4] Baron R. Peripheral neuropathic pain: From mechanism to symptom[J]. Clin J Pain, 2000, 16(4):S12-S20.

[5] Pop Busui R, Sima A, Stevens M. Diabetic neuropathy and oxidative stress[J]. Diabetes Metab Res Rev, 2006, 22(4):257-273.

[6] Kim JE, Kim AR, Chung HY, et al.Invitroperoxynitrite scavenging activity of diarylheptanodids fromCurcumalonga[J]. Phytotherap Res, 2003, 17(5):481-484.

[7] Yowtak J, Lee KY, Kim HY, et al. Reactive oxygen spcies contribute to neuropathic pain by reducing spinal GABA release[J]. Pain, 2011, 152(4):844-852.

[8] Tanaka T, Minami M, Nakagawa T. Enhanced production of monocyte chemoattractant protein-1 in the dorsal root ganglia in a rat model of neuropathic pain: possible involvement in the development of neuropathic pain[J]. Neurosci Res, 2004, 48(4):463-469.

[9] Wood JN, Boorman JP, Okuse K, et al. Voltage-gated sodium channels and pain pathways[J]. J Neurobiol, 2004, 61(1):55-71.

[10] Lai J, Glod MS, Kim CS, et al.Inhibition of neuropathic pain by decreased expression of the tetrodotoxin-resistant sodium channel NaV1.8[J]. Pain, 2002, 95(1-2):143-152.

[11] Gao YJ, Zhang L, Samad OA, et al. JNK-induced MCP-1 production in spinal cord astrocytes contributes to central sensitization and neuropathic pain[J]. J Neurosci, 2009, 29(13):4096-4108.

[12] Lin YL, Zhou LJ, Hu NW, et al. Tumor necrosis factor-alpha induces long-term potentiation of C-fiber evoked field potentials inspinal dorsal horn in rats with nerve injury[J]. Neuropharmacology, 2007, 52(3):708-715.

[13] 何伶俐，曹 紅， 賀端端，等. 姜黃素對大鼠神經病理性痛的影響[J]. 中華麻醉學雜志, 2008, 28(9):790-793.