瓦勒變性坐骨神經段對大鼠BMSCs向SCs分化的影響*

趙富生， 武 庚， 武 楊， 金秀東， 張際緋， 李月珍△

(1牡丹江醫學院， 2牡丹江醫學院紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011)

外周神經損傷修復和神經殘端支配區功能重建一直是臨床面對的難題。周圍神經損傷后其遠端神經纖維全長及近端長度不等的髓鞘和軸突發生瓦勒變性，隨后，施萬細胞(Schwanns cells, SCs) 呈現幼稚化而重新獲得分裂增殖能力，參與清除軸突潰變碎片，并在基底膜管內形成Bunger帶，形成新的髓鞘。此外，SCs 還分泌神經生長因子(neural growth factor, NGF) 等多種活性物質，引導軸突再生，促進神經功能的恢復[1-2]。研究表明，分離培養瓦勒變性大鼠坐骨神經的SCs并原位移植于半橫切脊髓中，SCs在損傷局部可形成細胞橋接區，引導軸突再生，促進脊髓功能恢復[3-4]。但自體SCs來源有限，異體SCs移植存在免疫排斥反應，限制了SCs的臨床應用。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一類具有多向分化潛能的成體干細胞，具有很強的自我更新能力。在體外不同細胞因子或特定環境誘導下，BMSCs可分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、肌肉細胞、神經細胞和星形膠質細胞等多種細胞[5-6]。外周神經瓦勒變性后可分泌多種生長因子，其活性可持續2～3周，能否為BMSCs體外分化提供適宜的神經微環境目前尚不清楚。為此，本實驗將瓦勒變性坐骨神經段與大鼠 BMSCs聯合培養，探討變性坐骨神經段所形成的體外微環境與誘導BMSCs向SCs分化的關系，為臨床應用BMSCs治療外周神經損傷提供理論依據。

材 料 與 方 法

1 動物和材料

SPF級1月齡SD大鼠50只，雌雄不限，體重90～120 g，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供[合格證號為SCXK(黑)2012-010]。

胰蛋白酶、H-DMEM、FBS(Gibco)；BMSCs 培養液(廣州賽業生物科技有限公司)；CD29、CD44和CD90 兔抗大鼠單克隆抗體(Prarmingen)；兔抗大鼠S-100多克隆抗體(上海麥莎生物有限公司)；PKH26 細胞連接試劑盒、DAPI(Sigma)；ELISA 試劑盒(Uscnlife)；FITC標記的山羊抗兔 IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；TaKaRa One Step SYB? PrimeScript? RT-PCR Kit ( Perfect Real Time)試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；Transwell(聚碳酸酯膜，孔徑 3.0 μm，Corning)。

2 方法

2.1BMSCs 的培養及鑒定 取體重為(100±5)g的SD大鼠乙醚吸入麻醉后脫頸處死，置75%乙醇中浸泡約5 min，無菌條件下分離出股骨和脛骨，在無血清DMEM培養液中，除凈長骨表面軟組織。乙醇浸泡l min后，用無血清DMEM培養液洗去乙醇。剪除兩端骨密質暴露骨髓腔，用10 mL BMSCs 培養液沖洗骨髓腔，收集骨髓沖洗液，200 目無菌篩網過濾，以1×109/L細胞密度接種于50 mL培養瓶中，在5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養箱中進行原代培養，3 d后更換新鮮培養液，去除未貼壁細胞。以后每隔3 d換液，并觀察細胞生長情況。待原代培養細胞鋪滿整個培養瓶底面積的80%時，用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化貼壁細胞，按l∶2比例進行傳代培養，記作第1代(P1)，選取生長均一的第3代(P3)BMSCs進行后續實驗。取P3 BMSCs行免疫熒光染色檢測 CD29、CD44和CD90 表達。

2.2瓦勒變性坐骨神經段制備及實驗分組 取40只SD大鼠，戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，無菌條件下暴露左側坐骨神經，于坐骨切跡遠側5 mm處切斷坐骨神經，以5/0 尼龍線結扎兩斷端，并將近端神經斷端埋植于股二頭肌中，防止兩斷端粘連，然后逐層縫合肌肉，淺筋膜和皮膚，肌注青霉素1×104U，連續3 d。術后第7天，重新暴露大鼠術側坐骨神經和對側正常坐骨神經，分別切取10 mm近端變性坐骨神經和10 mm對側正常坐骨神經，體式顯微鏡下剝離神經外膜，剪成1 mm小段，在Transwell雙層培養體系內與BMSCs 進行雙層聯合培養。實驗分為3組：將瓦勒變性坐骨神經段與BMSCs在Transwell 內進行雙層聯合培養(A組)——收集P3 BMSCs進行PKH26 標記，用10%FBS-BMSCs培養液調細胞濃度為1×107cells/L，取2 mL加入下室，補10%FBS-BMSCs培養液至2.5 mL,將瓦勒變性坐骨神經段置Transwell上層，加1 mL 10% FBS-BMSCs培養液，37 ℃、5% CO2孵育箱中培養; 將正常坐骨神經段與BMSCs在Transwell 內聯合培養，方法同上(B組)；BMSCs單獨培養，培養基為10% FBS-BMSCs培養液(C組)。

2.3BMSCs 總RNA提取 聯合培養第0、1、4、7、11、14天，取各組BMSCs，加Trizol液1 mL/well，吹打后收集到無RNA酶的EP管中，振蕩室溫放置5 min；加0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；吸取上清，置于新的無RNA酶的EP 管，加等體積異丙醇，渦旋混勻，室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離10 min；留沉淀，加1 mL 75% 乙醇，顛倒數次，4 ℃、7 500 r/min 離心5 min；去上清，快速離心后吸干乙醇，室溫下敞蓋放置3 min，加20 μL DEPC水溶解，檢測RNA的 濃度、純度和質量。

2.4BMSCs形態學觀察 倒置相差顯微鏡下觀察聯合培養后各組 BMSCs 形態變化。聯合培養第7天，用免疫熒光染色鑒定BMSCs分化。取各組BMSCs，PBS 洗滌3次，每次5 min；4% 多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌3次，每次5 min；加1% Triton X-100，37 ℃孵育10 min，PBS洗滌3次，每次5 min；山羊血清封閉60 min；加兔抗大鼠S-100(1∶200)多克隆抗體 4 ℃過夜，PBS 洗滌3次，每次5 min；加 FITC標記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌3次，每次5 min；DAPI(5 mg/L)核染色，熒光顯微鏡觀察BMSCs分化情況。隨機取10個非重疊視野計數陽性細胞，計算陽性表達率。

2.5BMSCs生長曲線的測定 聯合培養第0、1、4、7、11、14天，取各組BMSCs，去除培養液，PBS 洗滌3次，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，以細胞計數板進行細胞計數，計算平均值，以細胞數為縱坐標，時間為橫坐標繪制BMSCs生長曲線。

2.6ELISA 法檢測NGF的含量 聯合培養第0、1、4、7、11、14天，分別收集各組6個培養孔中培養液1 mL 裝于EP 管中，1 000 r/min 離心5 min，取上清液裝于另一EP 管中，置-20 ℃冰箱保存。按照 ELISA試劑盒操作步驟，檢測培養液上清中NGF含量。

2.7S-100 mRNA表達的檢測 按照One Step SYBR PrimeScript? RT-PCR Kit (Perfect Real Time)試劑盒說明程序檢測聯合培養第0、1、4、7、11、14 d各組BMSCs S-100 mRNA表達。Real-time RT-PCR反應體系為50 μL：包括2×One Step SYBR? RT-PCR Buffer Ⅲ 25 μL，TaKaRa ExTaq? HS 1 μL，PrimeScript? RT Enzyme Mix Ⅱ 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ROX Reference DyeⅡ 1 μL，RNA 4 μL，ddH2O 16 μL，每個樣品設置3個復孔。反應條件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，1個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環，于7500 Fast Real-Time PCR 儀上進行基因擴增，擴增完畢后進行熔解曲線分析?；虮磉_變化倍數采用2-ΔΔCt法進行比較，管家基因β-actin作為內參照。引物設計和合成利用Premier 5.0軟件設計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列如下：S-100上游引物為5’-GTCCACACCCAGTCCTCTCTGGAG-3’，下游引物為5’-CCGGAGGCTCCTGGTCACCTTTTG-3’；β-actin上游引物為5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物為5’-TGTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3’。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0 統計軟件處理，組間比較運用單因素方差分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 BMSCs培養及鑒定

BMSCs原代培養第3天，細胞呈不規則形或多角形，貼壁生長；培養第7天，BMSCs 數量顯著增多，細胞呈長梭形均勻分布。傳代后BMSCs 生長更加迅速，細胞體積較原代大，形態趨于一致，呈束狀或漩渦狀排列。免疫熒光鑒定BMSCs呈CD44、CD29和CD90 表達陽性，見圖1。

Figure 1. Identification of rat BMSCs by immunofluorescence staining (×200).

2 BMSCs與坐骨神經段聯合培養的相關檢測

2.1BMSCs的形態學觀察 聯合培養第1天，各組BMSCs大部分貼壁，呈梭形或多角形。聯合培養第3 d，A組部分BMSCs形態開始變化，原寬大的BMSCs變小變圓。聯合培養第7天，A 組大部分BMSCs 胞體回縮，呈圓形或錐形，兩端伸出突起，形態類似SCs細胞。B、C組僅有小部分BMSCs形態發生類似改變，這表明瓦勒變性坐骨神經段可有效促進BMSCs向SCs樣細胞分化，見圖2。

Figure 2. Morphological observation of BMSCs in each group at 7 d after co-culture (×100).A: group A;B: group B;C: group C.

2.2BMSCs的分化鑒定 聯合培養第7天，熒光顯微鏡下可見，A 組大部分BMSCs呈綠色熒光，細胞呈雙極形、多極形或錐形，形態類似SCs細胞；PKH26 標記的BMSCs均呈紅色熒光，S-100 表達陽性的BMSCs 呈紅色、綠色疊加的桔色熒光。B組少部分BMSCs 呈紅色、綠色疊加的桔色熒光，C組極少數BMSCs 呈紅色、綠色疊加的桔色熒光，見圖3。A 組BMSCs 的S-100陽性表達率為31.1%±2.9%，B組和C組BMSCs 的S-100陽性表達率分別為16.2%±1.7% 和0.42%±0.07%，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。該結果表明，來源于瓦勒變性坐骨神經的神經段能有效誘導BMSCs表達SCs標記蛋白S-100。

Figure 3. Differentiation of BMSCs detected by immunofluorescence staining at 7 d after co-culture (×100). A: group A; B: group B; C: group C.

2.3BMSCs的生長曲線 各組BMSCs生長曲線均近似“S”形，見圖4。聯合培養第0、1、2、3天各組BMSCs生長緩慢，第6～9天進入對數生長期，第11天達到最高峰，此后各組細胞增殖變緩，進入平臺期。A組BMSCs增殖速度明顯快于B、C組，B組BMSCs增殖速度快于C組，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，由此可見瓦勒變性坐骨神經段明顯促進BMSCs增殖。

2.4NGF含量的檢測 ELISA 法檢測發現，A組培養液上清中NGF含量于聯合培養后逐漸增多，呈時間依賴性，于聯合培養第7天達高峰，隨后呈下降趨勢。B、C 組NGF含量隨時間延長有所增加，但顯著低于A組。聯合培養第4、7、11、14天，A 組NGF含量明顯高于B、C 組，同時，B組高于C組，各組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

Figure 4. Growth curve of BMSCs in each group at different time points after co-culture. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs group C; #P<0.05 vs group B.

表1 聯合培養不同時點各組養液上清的NGF含量

2.5S-100 mRNA表達的檢測 聯合培養第0、1天，各組BMSCs中S-100 mRNA表達無明顯差異；聯合培養第4、7、11、14天，A組 BMSCs 中S-100 mRNA表達顯著高于B、C組，B組亦高于C組，各組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖5。這表明瓦勒變性坐骨神經段在較短的時間內即可刺激BMSCs中S-100 mRNA表達增加。

Figure 5. S-100 mRNA expression of BMSCs at different time points after co-culture. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs group C; #P<0.05 vs group B.

討 論

1850年，Waller[7]最早報道了周圍神經損傷后，損傷遠端的神經纖維全長及近端長度不等的髓鞘和軸突崩解破壞，即瓦勒變性。瓦勒變性過程中，SCs 呈現幼稚化而重新獲得分裂增殖能力，參與清除軸突潰變碎片，并在基底膜管內形成Bunger帶，形成新的髓鞘；同時SCs 還分泌多種神經生長因子和表面黏附分子引導再生軸突延伸，促進軸突再髓鞘化過程。因此，SCs在神經纖維損傷修復過程中，發揮著極為重要的作用[8-10]。但SCs屬于外周神經終末細胞，體外培養增殖速度緩慢，臨床中難以獲取足量SCs[11]。此外，SCs具有抗原性，異種移植會發生免疫排斥反應，因而極大地限制了SCs的臨床應用。為此，本研究設計了瓦勒變性大鼠坐骨神經段與BMSCs共培養體系，探討變性坐骨神經段形成的體外神經微環境能否誘導BMSCs 向SCs分化，并觀察在分化過程中BMSCs形態、分泌功能的變化，旨在為臨床應用BMSCs治療外周神經損傷提供實驗依據。

BMSCs為一種成體干細胞，具有很強的自我更新及多向分化潛能。研究發現[12-13]，BMSCs 在體外不同細胞因子或特定誘導環境作用下可分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、肌肉細胞和神經細胞等多種細胞。此外，BMSCs 來源豐富、易于獲取、可自體移植，有效避免了排斥反應及倫理爭議[14-15]，因此近年來BMSCs成為組織工程理想的種子細胞。Babe等[16]研究發現，利用化學復合物(丁羥基茴香醚、氫化可的松、福斯高林、胰島素、KCl、維甲酸)和細胞因子(EGF、HGF、VEGF)作為刺激因素均可在體外誘導BMSCs向神經元樣細胞分化，但分化比例有所不同。夏長所等[17]建立了以富含血小板血漿為基礎的誘導BMSCs分化為SCs的培養體系，誘導9～11 d 后，發現BMSCs分化為SCs樣細胞。我們前期研究發現，SCs 與BMSCs培養體系中BMSCs在SCs形成的體外微環境誘導作用下可分化為神經元和少突膠質細胞[18]。但該培養體系由于從坐骨神經分離、培養SCs時程較長，需大約3～4周才能獲取高純度SCs，從而導致臨床中錯過了應用BMSCs治療外周神經損傷的最佳時機。因此，本研究采用瓦勒變性坐骨神經段與BMSCs聯合培養，有效地縮短了獲取種子細胞的周期，為臨床外周神經損傷的治療贏得了寶貴時間。該體系將變性坐骨神經段與PKH26標記的BMSCs聯合培養于同一雙層小室中，坐骨神經段位于小室上層，下層接種BMSCs，中間有微孔網膜相隔，神經段分泌的生物活性物質可以通過網孔作用于BMSCs。Torres等[19]研究發現，取成年大鼠坐骨神經切成長約2 mm的神經段，在199完全培養基中培養1、4、7、14 d后制備坐骨神經條件培養液。用該培養液作用體外培養的大鼠視網膜細胞72 h，可有效促進視網膜細胞的存活、增殖和分化，并增加視網膜細胞的黏附能力。本研究室前期研究結果也表明[3-4]，切斷大鼠坐骨神經使其在體內預變性，然后通過改變培養液血清濃度和神經段移植的方法，約3周即可從變性坐骨神經段分離培養出高純度SCs。這些研究表明，瓦勒變性坐骨神經段在體外培養2～3周仍具有活性，可影響BMSCs的分化。PKH26 是一種帶有長脂肪族末端的紅色熒光染料，可與BMSCs膜上的脂類區域穩定結合，不會從已標記細胞向未標記細胞轉移，并且隨著細胞分裂，標記物也幾乎等份地分配給2個子細胞[20]。因此，可通過標記的紅色熒光來確定分化細胞的來源和計算細胞分化率。

為確定BMSCs 在瓦勒變性坐骨神經段的誘導作用下能否分化為SCs，以及BMSCs在分化過程中表達SCs標志物S-100 的情況，本研究通過免疫組化和real-time PCR檢測BMSCs在分化過程中S-100蛋白及mRNA的變化情況。S-100是一種由多基因編碼的分子量為9～13 kD的鈣離子結合蛋白，由S-100A和S-100B亞基組成3種形式：S-100AA、S-100BB和S-100AB，以同源或異源二聚體的形式發揮作用。其中S-100BB以高濃度特異地存在于中樞神經系統的膠質細胞和周圍神經系統的SCs以及它們的腫瘤中，常被用作SCs的標志物[21-23]。S-100蛋白參與各種鈣離子依賴性的細胞內的調節過程，例如蛋白磷酸化、細胞增殖以及細胞分化等過程[24]。在外周神經系統中，S-100蛋白主要分布在成熟SCs的細胞質內和細胞膜上，對軸突再生具有刺激和誘導作用[25]。本研究結果顯示，聯合培養過程中BMSCs形態發生明顯變化，聯合培養第7天，A 組可見大部BMSCs分胞體回縮，兩端伸出突起，形態類似SCs，而B組僅有小部分BMSCs 形態發生類似改變，C 組BMSCs 形態幾乎沒有發生變化。在聯合培養第7天，采用免疫熒光雙標技術對BMSCs 進行S-100鑒定。結果顯示，A 組BMSCs向SCs分化率明顯高于B組和C 組。為進一步明確聯合培養后不同時點BMSCs分化情況，研究中檢測了各組BMSCs中S-100 mRNA表達情況。結果示，A組BMSCs中S-100 mRNA表達水平顯著高于B組和C組，與免疫熒光鑒定結果相一致，提示瓦勒變性坐骨神經段形成的體外微環境可持續有效地促進BMSCs向SCs分化。為探討瓦勒變性坐骨神經段對BMSCs分泌功能的影響，我們選擇了NGF作為研究對象，在聯合培養不同時點對細胞培養液上清中NGF進行檢測。NGF是神經營養因子家族中最早發現的神經生長調節因子，對胚胎發育以及對神經嵴起源的神經元功能的維持具有重要作用[26-27]。作為神經系統中最重要的生物活性物質之一，NGF具有促進神經元分化和遷移、修復受損神經組織細胞、保護軸突和髓鞘炎性損壞的作用[28-30]。有文獻報道，NGF mRNA在神經受損后迅速增高，可持續高表達l～2周[31]。外周神經損傷后NGF主要來源于局部增殖的SCs[32]。Yuan等[33]和Yaghoobi等[34]研究發現，BMSCs在誘導分化后可表達一定量的NGF，并參與了BMSCs分化及其表型的維持過程，但NGF分泌量隨BMSCs傳代次數增加有所降低。本研究室前期研究結果表明，大鼠坐骨神經在未受到損傷情況下，神經段培養液上清中NGF含量很低，提示SCs合成NGF蛋白量很少。然而，在瓦勒變性坐骨神經段培養液中NGF含量明顯升高，為正常坐骨神經段的2.0倍，且可持續2～3周。因此，本研究通過檢測NGF含量，間接觀察瓦勒變性坐骨神經段在BMSCs向SCs分化中的作用。ELISA 檢測結果示，A組培養液上清中NGF含量在聯合培養后第4天明顯高于B、C組?？赡苡捎贐MSCs在分化過程中，源于BMSCs的SCs分泌大量NGF，同時也以反饋方式促進BMSCs分裂與增殖，分泌更多NGF，從而導致NGF含量增加。

綜上所述，瓦勒變性坐骨神經段形成的體外微環境可有效促進BMSCs向SCs樣細胞分化，在分化過程中變性坐骨神經段分泌的多種生物活性物質可能參與調控BMSCs的分化。有研究表明，外周神經瓦勒變性過程中可合成、分泌多種神經營養因子，包括NGF、腦源性神經營養因子、神經營養素、睫狀神經營養因子、堿性成纖維細胞生長因子和軸突生長誘導因子等[31，35]。這些因子的受體存在BMSCs 細胞膜上，與其結合后將信號轉導至細胞質或細胞核，對BMSCs分化起調節作用[36]。此外，變性坐骨神經段還可產生細胞外基質及細胞外黏附因子[37]。這些蛋白分子也可能介導變性神經段與BMSCs間的相互作用，誘導BMSCs 向SCs分化。但源于BMSCs的SCs樣細胞是否具有正常的生理功能尚待進一步深入研究。

[參 考 文 獻]

[1] Shimizu S, Kitada M, Ishikawa H, et al. Peripheral nerve regeneration by theinvitrodifferentiated-human bone marrow stromal cells with Schwann cell property[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 359(4):915-920.

[2] Perez M, Benitez SU, Cartarozzi LP, et al. Neuroprotection and reduction of glial reaction by cannabidiol treatment after sciatic nerve transection in neonatal rats[J]. Eur J Neurosci, 2013, 38(10):3424-3434.

[3] Zhang J, Zhao F, Wu G, et al. Functional and histological improvement of the injured spinal cord following transplantation of Schwann cells transfected withNRG1 gene[J]. J Anat Rec (Hoboken), 2010, 293(11):1933-1946.

[4] Zhang JF, Zhao FS, Wu G, et al. Therapeutic effect of co-transplantation of neuregulin 1-transfected Schwann cells and bone marrow stromal cells on spinal cord hemisection syndrome[J]. Neurosci Lett, 2011, 497(2):128-133.

[5] Neuhuber B, Gallo G, Howard L, et al. Reevaluation ofinvitrodifferentiation protocols for bone marrow stromal cells: disruption of actin cytoskeleton induces rapid morphological changes and mimics neuronal phenotype[J]. J Neurosci Res, 2004, 77(2):192-204.

[6] Huang J, Zhao L, Xing L, et al. MicroRNA-204 regulates Runx2 protein expression and mesenchymal progenitor cell differentiation[J]. Stem Cell, 2010, 28(2):357-364.

[7] Waller A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibres[J]. Phil Trans R Soc Lond, 1850, 140:423-429.

[8] Piirsoo M, Kaljas A, Tamm K, et al. Expression of NGF and GDNF family members and their receptors during peripheral nerve development and differentiation of Schwann cellsinvitro[J]. Neurosci Lett, 2010, 469(1):135-140.

[9] Ma Z, Wang J, Song F, et al. Critical period of axoglial signaling between neuregulin-1 and BDNF required for early Schwann cell survival and differentiation[J]. J Neurosci, 2011, 31(26):9630-9640.

[10] Tao HY, He B, Liu SQ, et al. Effect of carboxymethylated chitosan on the biosynthesis of NGF and activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway in the proliferation of Schwann cells[J]. Eur J Pharmacol, 2013, 702(1-3):85-92.

[11] Caddick J, Kingham PJ, Gardiner NJ, et al. Phenotypic and functional characteristics of mesenchymal stem cells differentiated along a Schwann cell lineage[J]. Glia, 2006, 54(8):840-849.

[12] Long X, Olszewski M, Huang W, et al. Neural cell differentiationinvitrofrom adult human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Stem Cells Dev, 2005, 14(1):65-69.

[13] 尹素娟，張榮華，朱曉峰，等. rhTGF-β1對SD大鼠MSCs骨向分化的影響及機制研究[J]. 中國病理生理雜志, 2014,30(3):460-466.

[14] Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, et al. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications[J]. Stem Cell, 2001, 19(3):180-192.

[15] Coyne TM, Marcus AJ, Woodbury D, et al. Marrow stromal cells transplanted to the adult brain are rejected by an inflammatory response and transfer donor labels to host neurons and glia[J]. Stem Cell, 2006, 24(11):2483-2492.

[16] Babe KS, Park JB, Kim HS, et al. Neuron-like differen-tiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J]. J Yonsei Med, 2011, 52(3):401-412.

[17] 夏長所, 陳玉華, 孫 康, 等. PRP在BMSCs向SC體外分化中的作用[J].中國修復重建外科雜志, 2009, 23(8):997-1001.

[18] 趙富生，武 庚，武 楊，等. 雪旺細胞對不同年齡大鼠 BMSCs分化的影響[J]. 中國修復重建外科雜志, 2011, 25(2):160-165.

[19] Torres PM, Guilarducci CV, Franco AS, et al. Sciatic conditioned medium increases survival, proliferation and differentiation of retinal cells in culture[J]. Int J Dev Neurosci, 2002, 20(1):11-20.

[20] 穆麗雅, 韓明子, 祁金鋒. 門靜脈和尾靜脈注入小鼠骨髓干細胞向肝臟遷移的比較[J]. 世界華人消化雜志, 2006, 14(14):1408-1411.

[21] Conrad AH, Albrecht M, Pettit-Scott M, et al. Embryonic corneal Schwann cells express some Schwann cell marker mRNAs, but no mature Schwann cell marker proteins [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2009,50(9):4173-4184.

[22] Finzsch M, Schreiner S, Kichko T, et al. Sox10 is required for Schwann cell identity and progression beyond the immature Schwann cell stage [J]. J Cell Biol, 2010,189(4):701-712.

[23] Bhatheja K, Field J. Schwann cells: origins and role in axonal maintenance and regeneration [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2006,38(12):1995-1999.

[24] Donato R. Functional roles of S100 proteins, calcium-binding proteins of the EF-hand type [J]. Biochim Biophys Acta,1999,1450(3):191-231.

[25] Spreca A, Rambotti MG, Rende M, et al. Immunocytochemical localization of S-100b protein in degenerating and regenerating rat sciatic nerves[J]. J Histochem Cytochem,1989, 37(4):441-446.

[26] Maisonpierre PC, Belluscio L, Friedman B, et al. NT-3, BDNF, and NGF in the developing rat nervous system: parallel as well as reciprocal patterns of expression[J]. Neuron, 1990, 5(4):501-509.

[27] Lindsay RM. Nerve growth factors (NGF, BDNF) enhance axonal regeneration but are not required for survival of adult sensory neurons[J]. J Neurosci, 1988, 8(7):2394-2405.

[28] Colafrancesco V, Villoslada P. Targeting NGF pathway for developing neuroprotective therapies for multiple sclerosis and other neurological diseases[J]. Arch Ital Biol, 2011,149(2):183-192.

[29] Ding J, Cheng Y, Gao S, et al. Effects of nerve growth factor and Noggin-modified bone marrow stromal cells on stroke in rats[J]. J Neurosci Res, 2011, 89(2):222-230.

[30] 畢 涌，洪 娟，林曉濱，等. 人β-NGF基因修飾的骨髓間充質干細胞對帕金森病大鼠行為學的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(3): 473-478.

[31] Yao D, Li M, Shen D, et al. Expression changes and bioinformatic analysis of Wallerian degeneration after scia-tic nerve injury in rat[J]. Neurosci Bull, 2013, 29(3):321-332.

[32] Shakhbazau A, Kawasoe J, Hoyng SA, et al . Early regenerative effects of NGF-transduced Schwann cells in peripheral nerve repair[J]. Mol Cell Neurosci, 2012, 50(1):103-112.

[33] Yuan J, Huang G, Xiao Z, et al. Overexpression of β-NGF promotes differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neurons through regulation of AKT and MAPK pathway[J]. Mol Cell Biochem, 2013, 383(1-2):201-211.

[34] Yaghoobi MM, Mahani MT. NGF and BDNF expression drop off in neurally differentiated bone marrow stromal stem cells[J]. Brain Res, 2008, 1203:26-31.

[35] Shakhbazau A, Kawasoe J, Hoyng SA, et al. Early rege-nerative effects of NGF-transduced Schwann cells in peri-pheral nerve repair[J]. Mol Cell Neurosci, 2012, 50(1):103-112.

[36] Terenghi G. Peripheral nerve regeneration and neurotrophic factors[J]. J Anat, 1999, 194(Pt 1):1-14.

[37] Wang DY, Huang YC, Chiang H, et al. Microcontact printing of laminin on oxygen plasma activated substrates for the alignment and growth of Schwann cells[J]. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2007, 80(2):447-453.