血清水通道蛋白4抗體測(cè)定對(duì)視神經(jīng)脊髓炎的診斷及預(yù)后判斷價(jià)值*

厲 向， 童巧文， 柯建明， 葉莉萍， 戚飛騰， 萬(wàn) 真， 夏君慧△

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，2第三臨床學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325000；3煙臺(tái)市毓璜頂醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室,山東 煙臺(tái) 264000)

視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一種特發(fā)性炎性脫髓鞘疾病，病變主要侵犯視神經(jīng)和脊髓，導(dǎo)致嚴(yán)重的視神經(jīng)炎和橫貫性脊髓炎[1]。與多發(fā)性硬化(mutiple screlosis，MS)在臨床上較難鑒別。常規(guī)治療MS的β干擾素反而加重NMO及其疾病譜系患者的病情[2]，故盡早進(jìn)行鑒別診斷尤為重要。Lennon等[3]在NMO患者血清中檢測(cè)出特異性自身抗體NMO-IgG，并且證實(shí)其靶抗原為水通道蛋白4 (aquaporin 4, AQP4)， 有力地支持了NMO是有別于MS的自身抗體免疫性水通道病，此后越來(lái)越多的證據(jù)表明AQP4抗體參與到NMO的病理過(guò)程[4-5]。本研究以穩(wěn)定表達(dá)人增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-AQP4 (EGFP-AQP4)的人胚腎上皮細(xì)胞(human embryonic kidney epithelial 293, HEK293)為底物，建立檢測(cè)血清AQP4抗體的CBA法，旨在討論血清AQP4抗體檢測(cè)對(duì)NMO患者的診斷、鑒別診斷及預(yù)后判斷的價(jià)值，并探討開(kāi)展臨床應(yīng)用的可行性。

材 料 和 方 法

1 對(duì)象

回顧調(diào)查2010年1月至2013年12月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院或門(mén)診就診并隨訪的206例患者，包括48例NMO、33例脊髓炎(transverse myelitis, TM)[包括26例長(zhǎng)節(jié)段脊髓炎(脊髓MRI提示病灶大于3個(gè)脊髓節(jié)段)(longitudinally extensive transverse myelitis, LETM)和7例復(fù)發(fā)性脊髓炎(relapse longitudinally extensive transverse myelitis, rLETM)]、30例視神經(jīng)炎(optic neuritis, ON)[其中包括25例雙眼視神經(jīng)炎(simultaneous bilateral optic neuritis, BON)和5例復(fù)發(fā)性視神經(jīng)炎 (recurrent isolated optic neuritis, RION)]、52例MS及16例其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病(other neurological disease, OND)。OND包括7例腦梗死、2例帕金森病、3例頭痛和6例腦出血患者。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，所有患者均由兩位資深的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師確定診斷。入選標(biāo)準(zhǔn)：NMO組患者及其譜系疾病患者均采用Wingerchuk等[6]2006年修改版診斷標(biāo)準(zhǔn)(除血清AQP4抗體陽(yáng)性外)。MS組患者均符合2010年McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。所有患者近期未進(jìn)行免疫抑制劑或者激素治療。

2 方法

2.1臨床資料收集 通過(guò)對(duì)患者進(jìn)行病史回顧及隨訪獲得的臨床資料分析包括性別、起病年齡、臨床表現(xiàn)、病程、首發(fā)索引事件、診斷為NMO的時(shí)間、年復(fù)發(fā)率、嚴(yán)重視神經(jīng)炎[功能評(píng)分 (function score，F(xiàn)S)>5分]和最近1次EDSS評(píng)分。輔助檢查：包括腦脊液、視覺(jué)誘發(fā)電位(visual evoked potential，VEP)檢查、抗核抗體(antiunuolear antibodies，ANA)自身抗體檢測(cè)、頭顱和脊髓MRI檢查。清晨空腹采集所有患者靜脈血，離心留取血清，保存于-80 ℃冰箱備用。

2.2細(xì)胞株構(gòu)建及基因轉(zhuǎn)染 參照Lennon等[3]文獻(xiàn)中的AQP4轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞株方法。應(yīng)用總RNA提取試劑盒提取成人腦組織總RNA行RT-PCR，以特異性引物擴(kuò)增AQP4基因。上游引物：5’-CGCAGATCTGCCACCATGAGTGACAGACCCACAGC-3’，內(nèi)含BglII酶切位點(diǎn)；下游引物：5’- CCGGTACCGGTACTGAAGACAATACCTC-3’，內(nèi)含KpnⅠ酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pEGFP-N1(由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)科所蔣磊博士惠贈(zèng))上，構(gòu)建pEGFP-N1-AQP4重組質(zhì)粒，雙酶切和基因測(cè)序、基因比對(duì)鑒定。接種HEK293細(xì)胞(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù))，24 h后細(xì)胞融合達(dá)90%，采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染。將pEGFP-N1+AQP4轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。采用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)AQP4的細(xì)胞株。

2.3血清AQP4抗體檢測(cè) 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的重組質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞消化后鋪板培養(yǎng)過(guò)夜，融合達(dá)50%左右。PBS漂洗后，予4%多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞30分鐘。后加入5%驢血清室溫封閉1 h。使用5%驢血清稀釋待測(cè)血清，稀釋比例分別為1∶20、1∶200、1∶600、1∶1 800和1∶3 600，與細(xì)胞共孵育，濕盒中4 ℃過(guò)夜。PBS漂洗后加入1∶400稀釋的熒光標(biāo)記驢抗人IgG(Abcam)，室溫避光孵育2 h。PBS漂洗后加DAPI(Sigma)染細(xì)胞核。置于熒光顯微鏡(Leica)下觀察細(xì)胞株，如圖1。結(jié)合以往研究[8-9]，我們選定稀釋濃度大于20倍時(shí)顯示陽(yáng)性的結(jié)果認(rèn)為AQP4檢測(cè)陽(yáng)性，設(shè)定最小滴度為20倍。

Figure 1. Detection of specific AQP4 expression at the HEK293-AQP4/EGFP cells (×100). AQP4-expressing cells were incubated with detected serum and donkey antiserum specific for IgG. The colocalization of the surface-expressed AQP4(green) and the anti-IgG antibody(red) indicates that the antibodies are against AQP4. The merge shows that AQP4 was expressing on the surface of cell.

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行分析。非正態(tài)分布計(jì)量資料和計(jì)數(shù)資料用中位數(shù)(最小值，最大值)表示, 2個(gè)獨(dú)立樣本比較采用秩和檢驗(yàn)。2個(gè)樣本率的比較用Pearson2檢驗(yàn)， 若T<5時(shí)，采用Fisher確切概率法。評(píng)價(jià)抗AQP4抗體對(duì)NMO的診斷價(jià)值，做受試者工作特征曲線(receive operating characteristic curve，ROC)進(jìn)行比較。繪制Kaplan-Meier曲線分析血清AQP4抗體陽(yáng)性患者進(jìn)展為NMO的累計(jì)概率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組AQP4抗體陽(yáng)性率及滴度比較

患者的分組及各組AQP4抗體陽(yáng)性率、抗體滴度見(jiàn)表1、圖2。NMO組、TM組、ON組陽(yáng)性率明顯高于MS組(P<0.05)。其中rLETM組、RION組陽(yáng)性率與NMO組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LETM組陽(yáng)性率亦高于MS組(P<0.05)。而B(niǎo)OD組陽(yáng)性率與MS組無(wú)顯著差異。OND組均為陰性。AQP4抗體滴度較高的患者基本集中于NMO組，其滴度分布與各組相比均具有顯著差異(P<0.05)。

2 AQP4抗體診斷NMO的ROC曲線分析

以Wingerchuk等[6]2006年修改版診斷標(biāo)準(zhǔn)(除血清AQP4抗體陽(yáng)性)為金標(biāo)準(zhǔn)，繪制評(píng)價(jià)血清AQP4抗體對(duì)NMO診斷的特異性和敏感性的ROC曲線分析，見(jiàn)圖3。AQP4抗體曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.91，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AQP4抗體滴度以大于20倍為陽(yáng)性，其敏感性為87.5%，特異性為85.4%。

表1 各組別血清AQP4抗體滴度及陽(yáng)性率比較

Figure 2. AQP4 antibody titers according to clinical phenotype.

Figure 3. ROC curve of serum AQP4 antibody for diagnosing NMO.

3 NMO組AQP4陽(yáng)性患者及陰性患者臨床特征比較

NMO組AQP4陽(yáng)性組及陰性組的臨床資料如表2所示。NMO組患者共48例，其中AQP4陽(yáng)性患者為42例，陰性患者為6例。通過(guò)對(duì)臨床特征進(jìn)行比較，可見(jiàn)AQP4陽(yáng)性患者中男性6例，女性36例，構(gòu)成比約1∶6；陰性患者中男性3例，女性3例，構(gòu)成比為1∶1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NMO組AQP4陽(yáng)性患者發(fā)病年齡為16～63歲，中位數(shù)發(fā)病年齡為37.5歲，陰性患者發(fā)病年齡為14～32歲，中位數(shù)發(fā)病年齡為31.5歲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NMO組AQP4陽(yáng)性患者確診為NMO時(shí)間為0～96個(gè)月，中位數(shù)時(shí)間為12個(gè)月，陰性組確診為NMO時(shí)間為1～102個(gè)月，中位數(shù)時(shí)間為28個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NMO組AQP4陽(yáng)性患者中嚴(yán)重視神經(jīng)炎者(FS>5分)有13例，陰性組有2例，2組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而就年復(fù)發(fā)率、首發(fā)索引事件、腦脊液(cerebros-pinal fluid，CSF)表現(xiàn)、ANA抗體陽(yáng)性率、EDSS評(píng)分及脊髓病變大于3個(gè)椎體節(jié)段的比例而言，NMO組AQP4陽(yáng)性患者與陰性患者比較均無(wú)明顯差異(P>0.05)。AQP4抗體陽(yáng)性NMO患者有83.3%(35/42)在初次發(fā)病24個(gè)月后被確診為NMO。而AQP4陰性NMO患者僅33.3%(2/6)在初次發(fā)病24個(gè)月后被確診為NMO(P<0.05)。

表2 NMO組血清AQP4抗體陽(yáng)性患者及陰性患者臨床特征比較

4 AQP4抗體與發(fā)展為NMO的關(guān)系

應(yīng)用Kaplan-Meier曲線分析188例血清AQP4抗體陽(yáng)性和陰性的NMO、ON、TM和MS患者從首次發(fā)作進(jìn)展為NMO的累積概率生存函數(shù)，見(jiàn)圖4。該曲線顯示AQP4抗體陽(yáng)性組曲線明顯低于抗體陰性組，提示AQP4抗體陽(yáng)性患者進(jìn)展為NMO的累積概率明顯高于抗體陰性的患者(P<0.05)。

Figure 4. The Kaplan-Meier curve for the accumulated survival rate of AQP4 antibody for the progress to NMO

討 論

NMO與MS臨床癥狀有相似，盡管腦脊液寡克隆帶、影像學(xué)有所不同，但因?yàn)槿狈^為特異性的生物學(xué)標(biāo)志，鑒別診斷仍有困難。NMO-IgG及特異性靶抗原AQP4的發(fā)現(xiàn)，標(biāo)志著NMO作為一種新的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫系統(tǒng)性疾病而獨(dú)立于MS。AQP4抗體被認(rèn)為通過(guò)以下途徑參與病理過(guò)程：(1)參與血腦屏障的破壞；(2)啟動(dòng)炎癥免疫反應(yīng)，激活補(bǔ)體和細(xì)胞因子，導(dǎo)致血管周圍的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；(3)介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷及脫髓鞘作用[10]。隨著AQP4抗體的發(fā)現(xiàn)與檢測(cè)，一些發(fā)病機(jī)制與NMO類似的非特異性炎性脫髓鞘疾病(如LETM、rLETM、RION等)的AQP4抗體陽(yáng)性率也較高。2006年Wingerchuk等[6]將血清NMO-IgG納入NMO的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并提出了視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(NMO spectrum disorders, NMOSD)這一概念。

隨著AQP4抗體參與NMO的發(fā)病機(jī)制研究成為熱點(diǎn)，關(guān)于NMO血清中AQP4抗體檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)大量開(kāi)展。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)比較各種檢測(cè)血清AQP4抗體的方法[11-12]，發(fā)現(xiàn)CBA法的敏感性為最高(72.4%～91%)，且保持100%的特異性，明顯優(yōu)于間接免疫熒光法、ELISA法等。該方法最初由Lennon等[3]在2005年采用，具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)CBA法采用人AQP4轉(zhuǎn)染至胚腎細(xì)胞系HEK293中，避免種屬的差異，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)應(yīng)用冰凍鼠小腦或腦干切片上測(cè)定抗體的IIF法；(2)CBA法表達(dá)全肽段的自然折疊的人類AQP4抗原，從而避免了在氨基酸序列上及結(jié)構(gòu)的差異影響，與人AQP4抗體特異性結(jié)合，而傳統(tǒng)的ELISA法應(yīng)用人工合成的AQP4蛋白或者多肽，導(dǎo)致蛋白空間結(jié)構(gòu)異常而無(wú)法特異性結(jié)合AQP4抗體[13]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CBA法是通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)AQP4的HEK293作為底物，來(lái)檢測(cè)血清AQP4抗體。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ROC曲線評(píng)價(jià)AQP4抗體水平的診斷效益顯示AQP4抗體對(duì)診斷NMO的敏感性為87.5%，特異性為85.4%，AUC達(dá)到0.91。AQP4抗體陽(yáng)性率與國(guó)內(nèi)及其它亞洲國(guó)家研究結(jié)果相似(73%～91%)[14-15]，提示血清AQP4抗體水平對(duì)診斷NMO具有較高的診斷效益。各組陽(yáng)性率比較顯示NMO組、rLETM組、RION組陽(yáng)性率明顯高于其它組，均在80%左右。Chan等[11]同樣應(yīng)用CBA法測(cè)定血清AQP4抗體，發(fā)現(xiàn)rLETM(75%)和RION(33%)的陽(yáng)性率均高于單次發(fā)病的TM(4%)和ON(14%)。結(jié)合80%～90%NMO患者由rLETM和RION發(fā)展而來(lái)[1， 6]，來(lái)看這兩類NMOSDs血清AQP4抗體陽(yáng)性發(fā)病形式的患者有較大可能轉(zhuǎn)化為NMO。而MS組存在2例患者血清AQP4抗體陽(yáng)性，1例患者為進(jìn)展型MS，另1例曾有視神經(jīng)受累。故需進(jìn)一步隨訪是否轉(zhuǎn)歸為NMO。

本實(shí)驗(yàn)在調(diào)查隨訪的浙南地區(qū)視神經(jīng)脊髓炎患者中，比較了AQP抗體陽(yáng)性與陰性患者的臨床特征。NMO組陽(yáng)性患者(1∶6)較陰性患者(1∶1)更傾向于女性，結(jié)果符合之前NMO研究的性別特征[16]。NMO組AQP4抗體陰性患者中位數(shù)發(fā)病年齡(31歲)較AQP4抗體陽(yáng)性(37.5歲)患者年輕，這與既往國(guó)內(nèi)外結(jié)果一致[15, 17]。類似研究[13, 16]發(fā)現(xiàn)AQP4抗體陽(yáng)性患者更傾向于出現(xiàn)嚴(yán)重視神經(jīng)炎(FS>5，即壞眼矯正視力小于0.1)。本實(shí)驗(yàn)NMO組AQP4抗體陽(yáng)性患者(13/36)存在嚴(yán)重視神經(jīng)炎的比例高于AQP4抗體陰性患者(P<0.05)，提示血清AQP4抗體與病情程度可能相關(guān)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)NMO組AQP4抗體陽(yáng)性患者確診為NMO的中位數(shù)時(shí)間(12個(gè)月)較陰性患者(28個(gè)月)明顯縮短，且2年內(nèi)診斷為NMO的血清AQP4陽(yáng)性患者明顯多于血清AQP4陰性患者。而Jarius等[17]針對(duì)高加索人種的多中心臨床研究發(fā)現(xiàn)AQP4抗體陰性患者確診為NMO所需時(shí)間較陽(yáng)性組短，考慮本實(shí)驗(yàn)與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同的原因可能是人種及地域、起病形式的不同及樣本量大小有關(guān)，需今后加大樣本量后回顧研究。而年復(fù)發(fā)率、首發(fā)索引事件、腦脊液結(jié)果、ANA抗體、EDSS評(píng)分和病變累及大于3個(gè)脊髓節(jié)段等指標(biāo)，NMO組AQP4陽(yáng)性患者與陰性患者比較，均無(wú)明顯差異。

我們回顧調(diào)查并隨訪188例NMO、ON、TM和MS等非特異性炎性脫髓鞘疾病患者，記錄其首次發(fā)作時(shí)間及臨床表現(xiàn)，并檢測(cè)其血清AQP4抗體，應(yīng)用Kaplan-Meier曲線分析AQP4抗體陽(yáng)性和陰性的患者從首次發(fā)作進(jìn)展為NMO的累積概率生存函數(shù)。曲線提示AQP4抗體陽(yáng)性患者進(jìn)展為NMO的累積概率明顯高于抗體陰性的患者，并且AQP4陽(yáng)性患者進(jìn)展為NMO的速度更快。故若首發(fā)出現(xiàn)ON或者LETM的患者同時(shí)合并血清AQP4抗體陽(yáng)性，提示具有短期內(nèi)進(jìn)展為NMO的高危風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪證實(shí)，及時(shí)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制治療。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所采用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)AQP4抗體可行有效，對(duì)于診斷NMO有較高敏感性和特異性。AQP4抗體陽(yáng)性NMO患者更易出現(xiàn)嚴(yán)重視力損害，AQP4抗體陽(yáng)性患者更快進(jìn)展為NMO。可以提倡AQP4抗體檢測(cè)作為鑒別NMO和其它脫髓鞘疾病的臨床生物指標(biāo)，有助于對(duì)NMO的早期診斷和轉(zhuǎn)歸預(yù)后預(yù)測(cè)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Wingerchuk DM, Lennon VA, Lucchinetti CF, et al. The spectrum of neuromyelitis optica [J]. Lancet Neurol, 2007, 6(9):805-815.

[2] Palace J, Leite MI, Nairne A, et al. Interferon beta treatment in neuromyelitis optica: increase in relapses and aquaporin 4 antibody titers[J]. Arch Neurol, 2010, 67(8):1016-1017.

[3] Lennon VA, Kryzer TJ, Pittock SJ, et al. IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel[J]. J Exp Med，2005, 202(4):473-477.

[4] Papadopoulos MC, Verkman AS. Aquaporin 4 and neuromyelitis optica[J]. Lancet Neurol, 2012, 11(6):535-544.

[5] Saini H, Rifkin R, Gorelik M, et al. Passively transferred human NMO-IgG exacerbates demyelination in mouse experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. BMC Neurol, 2013, 13:104.

[6] Wingerchuk DM, Lennon VA, Pittock SJ, et al. Revised diagnostic criteria for neuromyelitis optica[J]. Neurol, 2006, 66(10):1485-1489.

[7] Polman CH, Reingold SC, Banwell B, et al. Diagnostic criteria for multiple sclerosis: 2010 revisions to the McDonald criteria[J]. Annals Neurol, 2011, 69(2):292-302.

[8] Takahashi T, Fujihara K, Nakashima I, et al. Anti-aquaporin-4 antibody is involved in the pathogenesis of NMO: a study on antibody titr[J]. Brain, 2007, 130(Pt 5):1235-1243.

[9] De Vidi I, Boursier G, Delouche N, et al. Strategy for anti-aquaporin-4 auto-antibody identification and quantification using a new cell-based assay[J]. Clin Immunol, 2011, 138(3):239-246.

[10]Saikali P, Cayrol R, Vincent T. Anti-aquaporin-4 auto-antibodies orchestrate the pathogenesis in neuromyelitis optica[J]. Autoimmunity Rev, 2009, 9(2):132-135.

[11]Chan KH, Kwan JS, Ho PW, et al. Aquaporin-4 autoantibodies in neuromyelitis optica spectrum disorders: comparison between tissue-based and cell-based indirect immunofluorescence assays[J]. J Neuroinflammation, 2010,7:50.

[12]葉 靜,廖張?jiān)? 孫 慧，等. 視神經(jīng)脊髓炎特異性抗體三種檢測(cè)方法比較[J]. 中華內(nèi)科雜志, 2011, 50(10):848-850.

[13]Kang ES, Min JH, Lee KH, et al. Clinical usefulness of cell-based indirect immunofluorescence assay for the detection of aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica spectrum disorder[J].Ann Lab Med，2012, 32(5):331-338.

[14]楊 揚(yáng), 黃德輝, 武 雷，等. 視神經(jīng)脊髓炎特異性IgG抗體對(duì)視神經(jīng)脊髓炎的診斷價(jià)值[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 90(9):606-609.

[15]Yang CS, Zhang DQ, Wang JH, et al. Clinical features and sera anti-aquaporin 4 antibody positivity in patients with demyelinating disorders of the central nervous system from Tianjin, China[J]. CNS Neurosci Ther, 2014, 20(1):32-39.

[16]Jarius S, Frederikson J, Waters P, et al. Frequency and prognostic impact of antibodies to aquaporin-4 in patients with optic neuritis[J]. J Neurol Sci, 2010, 298(1-2):158-162.

[17]Jarius S, Ruprecht K, Wildemann B, et al. Contrasting disease patterns in seropositive and seronegative neuromyelitis optica: A multicentre study of 175 patients[J]. J Neuroinflammation, 2012, 9:14.