厚樸酚延緩幼年自發性高血壓大鼠的高血壓進程及其機制*

梁向艷， 邢文娟， 何金孝， 季樂樂， 李 榕， 張海鋒△

(第四軍醫大學 1基礎醫學院教學實驗中心， 2基礎醫學院生理學教研室，3西京醫院兒科， 4西京醫院老年病科，陜西 西安 710032)

高血壓前期是指收縮壓處于120～139 mmHg或舒張壓處于80～89 mmHg的血壓階段，我國高血壓防治指南稱之為“正常高值”血壓。美國和我國的流行病學調查均顯示，高血壓前期人群較血壓正常人群更易發展為高血壓[1-2]，即使沒有發展為高血壓，高血壓前期人群也增加了其它心血管疾病尤其是中風的危險[3]。已報道在高血壓前期應用坎地沙坦可減少高血壓的發病率[2]，我們最近證實在高血壓前期長期運動鍛煉可以延緩高血壓進程[4]。因此在高血壓前期進行干預處理來延緩血壓升高是確實可行的。然而高血壓前期發展為高血壓的潛在機制仍不清楚，在高血壓前期抗高血壓治療的藥物仍然缺乏。

厚樸酚(magnolol, MAG)是中藥厚樸的活性成分，具有活血化瘀的功效，在心血管系統的作用主要包括減輕缺血/再灌注損傷和抗動脈粥樣硬化作用等[5-8]，但其對血壓的影響仍不清楚。我們前期研究證實，幼年血壓正常的自發性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats, SHR)對胰島素誘導的血管舒張效應降低[9-10]，而運動鍛煉可通過改善血管胰島素抵抗來降低血壓[4]。有研究證實Tribbles 同源蛋白3 (Tribbles homologue 3, TRB3)可通過抑制Akt磷酸化來減弱胰島素信號通路[11]。此外，過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)激活可增強胰島素信號通路[12]，且自發性高血壓大鼠血管組織表達降低，收縮壓升高[13]。厚樸酚在體外能激活PPARγ[14]，然而其在體內能否影響PPARγ和TRB3的表達仍不清楚。因此，本實驗擬研究厚樸酚對高血壓前期大鼠血壓和胰島素誘導的血管舒張效應的影響，并進一步探討其可能的機制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

厚樸酚(陜西旭煌植物科技發展有限公司)；wortmannin(Santa Cruz)；PPARγ、TRB3、Akt、p-Akt、內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)和p-eNOS抗體(Cell Signaling)；其它試劑均購自Sigma；羅氏活力型血糖儀及血糖試紙(Roche)；大鼠胰島素ELISA試劑盒(R&D)；一氧化氮(nitric oxide， NO)檢測試劑盒(南京建成)；生物信號采集與處理系統、無創血壓分析儀(成都泰盟公司)；電泳儀(Bio -Rad)。

2 動物實驗

采用4周齡的雄性SHR及年齡、性別匹配的正常血壓Wistar-Kyoto(WKY)大鼠。共分為4組：① WKY對照組：每日灌胃蒸餾水;② WKY+MAG處理組：每日灌胃MAG(100 mg/kg);③ SHR對照組：每日灌胃蒸餾水;④ SHR+ MAG處理組：每日灌胃MAG(100 mg/kg)。3周后，大鼠禁食12 h，測量尾動脈收縮壓(systolic blood pressure,SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure ,DBP)，檢測胰島素水平和血糖水平。

3 主要實驗方法

3.1血壓、血液指標的測定 大鼠血壓檢測采用無創尾套法測量尾動脈收縮壓和舒張壓。3周后取腔靜脈血離心，測量血漿胰島素水平和空腹血糖水平。血糖濃度使用血糖分析儀檢測，血漿胰島素濃度采用放射免疫法檢測。

3.2血管環實驗 大鼠麻醉后取降主動脈于冰冷的Kreb’s液中。剔除結締組織將其剪成約3 mm的血管環并垂直懸掛于含37 ℃的Kreb’s液的浴槽中，通含95% O2和5% CO2的混合氣。基礎張力為1×g，平衡90 min,每15 min換液。血管穩定后以10-6mol/L的苯腎上腺素(phenylephrine，PE)收縮血管，收縮達峰值后加入10-5mol/L 乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)。若加入ACh后使血管舒張70%～90%可認為內皮完整，否則棄用。沖洗穩定30 min后重復給予PE，待血管收縮達到穩定值后逐步加入胰島素(10-10～10-6mol/L)。以PE誘發的收縮幅度為100%，舒張率(%)=藥物引起舒張的張力/PE引起的收縮張力×100%。

3.3Western blotting檢測PPARγ、TRB3、Akt和eNOS的表達水平 常規方法提血管組織或細胞蛋白，BCA法進行蛋白定量。將蛋白樣品行SDS-PAGE后轉移至PVDF膜。加入Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入相應Ⅱ抗，37 ℃孵育1 h，使用ECL-Plus試劑盒進行化學發光檢測，β-actin為各組內參照。用Quantity One 4.0成像軟件系統進行條帶光密度值分析。

3.4細胞培養 培養細胞經Ⅷ因子相關抗原免疫組化鑒定為陽性；實驗要求細胞純度在90%以上。傳代培養至2～4代后，以1×108/L的密度接種于24孔培養板中培養。隨機分為正常對照組：直接給予低糖DMEM培養液(5.6 mmol/L)；高糖高脂組：DMEM培養液中高糖濃度為25 mmol/L，棕櫚酸鈉濃度為500 μmol/L。每組8孔，培養48 h，光學顯微鏡下觀察細胞形態學變化，MTT法測定細胞活性。

3.5NO含量檢測 培養基上清取100 μL，嚴格按南京建成NO檢測試劑盒操作，每組重復測量3次。

4 統計學處理

數據采用均數±標準誤(mean±SEM)表示，運用Prism 5.0統計軟件分析,組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)或組間t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 厚樸酚對SHR/WKY大鼠血壓及其它生理參數的影響

大鼠飼養3周后，SHR的體重、血糖、血漿胰島素、舒張壓和收縮壓開始升高，且顯著高于WKY組。SHR組給予厚樸酚干預后，其血糖、血漿胰島素、舒張壓和收縮壓與對照組SHR相比顯著降低，見表1，圖1。

表1 WKY大鼠和SHR的生理參數

Figure 1. The effect of magnolol (MAG) on systolic blood pressure (A) and diastolic blood pressure (B) in the rats. Mean±SEM. n=8. **P<0.01 vs WKY; ##P<0.01 vs SHR.

2 厚樸酚對胰島素誘導的血管舒張效應的影響

如圖2A所示,SHR組大鼠的主動脈血管對胰島素誘導的舒張效應明顯低于WKY組，說明SHR大鼠血管胰島素敏感性顯著降低可能發生了血管胰島素抵抗。厚樸酚灌胃3周后SHR主動脈血管對胰島素誘導的舒張效應明顯高于未用藥的SHR組，說明厚樸酚具有增強SHR血管胰島素敏感性的作用，但用左旋硝基精氨酸甲酯(Nω-niotro-L-arginine methyl ester,L-NAME)或去內皮處理后該作用消失，見圖2D。此外，ACh和S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetyl penicillamine, SNAP)都能引起SHR和WKY大鼠主動脈血管的舒張效應，但它們引起的血管舒張效應并沒有顯著差異，見圖2B～C，提示SHR組大鼠血管胰島素敏感性降低不是內皮釋放NO功能或平滑肌舒張功能受損，而是其血管內皮胰島素信號通路受損所致。

3 厚樸酚對血管PPARγ和TRB3的表達及胰島素Akt/eNOS信號通路的影響

如圖3所示，與WKY組相比，SHR組大鼠血管組織TRB3表達顯著增加，PPARγ表達無顯著變化，Akt和eNOS磷酸化顯著降低，而厚樸酚可顯著上調其血管組織PPARγ的表達水平及Akt、eNOS磷酸化水平，下調TRB3的表達。這些結果提示厚樸酚可能通過增加PPARγ表達及減少TRB3表達來增強胰島素信號轉導，從而增強SHR血管胰島素敏感性。

Figure 2. Impairment of insulin-induced vasodilatation and the effect of magnolo(MAG)l on insulin-induced vasodilatation in aortic segments from rats.SNAP: S-nitroso-N-acetyl penicillamine; L-NAME: Nω-nitro-L-arginine methyl ester; E-: endothelium denudation. Mean±SEM. n=6. **P<0.01 vs WKY; #P<0.05, ##P<0.01 vs SHR; ??P<0.01 rs SHR+MAG.

4 厚樸酚對HUVECs 的PPARγ和TRB3表達及胰島素Akt/eNOS信號通路的影響

如圖4所示，HUVECs高糖高脂培養18 h，PPARγ的表達減少，TRB3的表達增加，磷酸化的Akt和eNOS顯著降低且NO釋放減少，但是厚樸酚孵育后改變了這些趨勢，最后增加了NO釋放。

5 PPARγ拮抗劑阻斷厚樸酚增加PPARγ表達及增敏胰島素對Akt/eNOS信號通路的作用

為更深研究，我們在高糖高脂培養的HUVECs中加入PPARγ拮抗劑雙酚丙烷二環氧丙醚(bisphenol adiglycidylether,BADGE)。如圖5所示，厚樸酚增加PPARγ的表達、減少TRB3的表達，增強Akt、eNOS磷酸化的作用被BADGE抑制。說明在HUVECs中厚樸酚減少TRB3表達、增敏胰島素的作用依賴于PPARγ的上調。

討 論

我國的“高血壓前期”發生率為41.3%，其人群10年后發生高血壓的比例高達52.6%，且發生高血壓相關的心血管事件及死于心血管疾病的概率較血壓正常者明顯升高，故在高血壓前期及早通過改善生活方式或預防用藥來防治高血壓是有意義的。厚樸酚是中藥厚樸的活性成分，具有活血化瘀的功效，在心血管系統的作用主要包括改善缺血/再灌注損傷和抗動脈粥樣硬化作用，但是其對血壓的影響仍不清楚。我們實驗證實，在高血壓前期給予厚樸酚干預可顯著降低其SBP和DBP，提示厚樸酚高血壓前期干預可延緩高血壓的進程，這對預防高血壓具有臨床意義，特別是對那些可能發展為高血壓并出現心血管亞臨床病變的高血壓前期人群，就顯得尤其重要。

有一種假設認為胰島素抵抗不僅是高血壓的臨床表現，而且是高血壓發展的一個因素。我們前期發現，在血壓正常的幼年SHR，胰島素誘導的血管舒張效應減弱，血管組織胰島素信號通路受損(PI3K/Akt/eNOS)、NO釋放減少[9-10]。提示，在高血壓前期已經發生了血管胰島素抵抗，這可能是SHR胰島素抵抗促發外周血管功能障礙和高血壓的機制之一。本研究證實，從高血壓前期開始給予SHRs厚樸酚干預3周，可通過增加其血管胰島素敏感性來降低血壓，并且增強其主動脈血管Akt和eNOS磷酸化；在HUVECs中厚樸酚可以減少高糖高脂誘導的胰島素敏感性受損，增強磷酸化Akt和eNOS表達、促進NO釋放。因此，在高血壓前期給予厚樸酚干預來恢復胰島素信號通路可能參與了血管胰島素增敏和隨后的系統血壓降低。

Figure 3. The effects of MAG on PPARγ (A) and TRB3 (B) expression, and insulin-stimulated activation of Akt/eNOS (C and D) signaling pathway. Mean±SEM. n=5.*P<0.05 vs WKY; #P<0.05 vs SHR.

有研究表明，與年齡匹配的WKY大鼠相比，SHR血管組織PPARγ表達水平顯著下降，血壓顯著升高[13]，激活PPARγ可能對胰島素信號通路有關的重要基因產生直接作用[12]，而厚樸酚在體外可激活PPARγ[14]。我們證實用厚樸酚干預SHR3周，可增強PPARγ表達以及胰島素信號，并在高糖高脂培養的HUVECs中也觀察到此作用，而PPARγ阻斷劑抑制了這一作用。提示厚樸酚能夠修復下游受損的胰島素信號通路，即通過活化PPARγ來增加胰島素誘導的Akt和eNOS磷酸化。此外有研究證實TRB3可通過抑制Akt磷酸化對胰島素信號通路進行負性調控[11, 15-16]。我們發現，PPARγ拮抗劑阻斷了厚樸酚降低TRB3表達的作用，提示厚樸酚可以作為一種PPARγ激動劑，通過增強PPARγ表達與活化來抑制下游TRB3的表達并增加Akt和eNOS的活化來改善血管胰島素抵抗，最終降低血壓。

總之，本研究首次證實，在SHR高血壓前期給予厚樸酚干預可改善血管胰島素抵抗并延緩血壓升高，該作用與上調SHRs血管組織PPARγ表達、減少TRB3表達進而增強Akt和eNOS活性有關。這些結果提示厚樸酚有望作為一種早期抗高血壓藥物在高血壓前期使用。

Figure 4. The effects of magnolol on PPARγ expression and insulin-stimulated activation of Akt/ eNOS/NO signaling in the HUVECs. Expression of PPARγ (A), TRB3 (B), p-Akt/Akt (C) and p-eNOS/eNOS (D), and release of NO (E) in the conditioned medium were measured. HG/HF: high glucose/high fat treatment. Mean±SEM. n=5～6. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs HG/HF.

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Figure 5. PPARγ antagonist blocked the effects of MAG on PPARγ expression and insulin-stimulated signaling in the HUVECs. Expression of PPARγ (A), TRB3 (B), p-Akt/Akt (C) and p-eNOS/eNOS (D) in the conditioned medium were measured. BADGE: PPARγ antagonist bisphenol adiglycidylether. Mean±SEM. n=5～6.*P<0.05 vs control; ?#P<0.05 vs HG/HF; △P<0.05 vs HG/HF+MAG.

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