p110δ突變失活上調(diào)血管MMPs表達(dá)并引發(fā)血管壁結(jié)構(gòu)損傷*

邢麗英， 鄭凌云， 吳玉娥， 曾翠玲， 桂亞麗， 方海燕， 吳 騰， 王麗京， 李衛(wèi)東

(廣東藥學(xué)院 1血管生物學(xué)研究所，2基礎(chǔ)學(xué)院，4健康學(xué)院， 3廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東 廣州 510006)

磷酯酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)家族，參與如細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞存活和胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)纫幌盗屑?xì)胞功能活動(dòng)，發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。PI3Ks能特異性地催化磷酯酰肌醇3位羥基磷酸化, 產(chǎn)生具有第二信使作用的肌醇脂物質(zhì)的激酶，也被稱為磷脂酰肌醇3-激酶或磷酸肌醇3-激酶[1]。p110δ屬于該家族成員中的一個(gè)催化亞基，是一種調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的催化酶, 在T細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用，近年來p110δ作為預(yù)防或治療炎癥和自身免疫及移植排斥反應(yīng)的研究靶點(diǎn)被廣泛地進(jìn)行研究[2]。

近年來的研究顯示，PI3K家族中p110γ的缺失會(huì)影響PI3K激酶的信號(hào)通路和Akt的活化，從而進(jìn)一步抑制氧化型低密度脂蛋白和炎癥趨化因子的形成，從而減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[3]。這說明，PI3K信號(hào)通路在血管炎癥中起到一個(gè)很重要的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，p110δ在血管組織中也有一定的表達(dá)，并且參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的L-Ca2+電流、內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的黏附以及高血壓進(jìn)程中血管的收縮反應(yīng)[4]。

動(dòng)脈管壁較厚，通過彈性板分為3層同心膜。最里層的內(nèi)膜由內(nèi)皮細(xì)胞組成，起到減少血流阻力的作用；中膜較厚，主要由一層環(huán)狀的平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells, SMCs)構(gòu)成，可維持血管系統(tǒng)張力，且含彈性纖維和膠原纖維，大動(dòng)脈以彈力纖維為主，中、小動(dòng)脈以平滑肌為主；外膜由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，含膠原纖維和彈性纖維，可起到防止血管過度擴(kuò)張的作用[5]。動(dòng)脈壁的結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)。血管的結(jié)構(gòu)改變可能會(huì)阻礙動(dòng)脈的緩沖作用，從而引發(fā)一系列的心血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等，同時(shí)吸煙、動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓等因素引起的血管損傷又是誘發(fā)動(dòng)脈瘤的關(guān)鍵[6]。

這些結(jié)果提示p110δ在血管重構(gòu)過程中可能也有重要意義。有鑒于此，本研究采用p110δ基因突變失活(p110δ-mutant)小鼠，試圖觀察p110δ突變后對(duì)主動(dòng)脈血管的作用，進(jìn)一步探索如何通過PI3K信號(hào)通路影響血管損傷以及作用機(jī)制的研究。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6 (C57) 小鼠20只，雄性，8周齡，購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SYXK(粵)2013-0002。p110δ-mutant小鼠20只，雄性，8周齡，購(gòu)自Jackson實(shí)驗(yàn)室。

2 試劑和儀器

乙醇、甲醇、異丙醇和蘇木素-伊紅染色套裝(康龍生物)；瓊脂糖(Biowest)；PCR引物(Invitrogen)；DAB顯色試劑盒(Thermo)；PCR Mix(Roche)；RNA提取試劑盒(TaKaRa)；彈性纖維染色相關(guān)試劑和膠原纖維染色相關(guān)試劑(本實(shí)驗(yàn)室制備)；膠原蛋白(collagen)Ⅰ、collagen IV、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin， α-SMA)、CD31(Abcam)；內(nèi)參照IgG2b由中科院上海細(xì)胞生物研究所提供；HRP標(biāo)記Ⅱ抗購(gòu)自EMD Calbiochem。

PCR儀(ABI)；光學(xué)顯微鏡(Olympus)；低溫離心機(jī) (Thermo)；超速離心機(jī) (Beckman)；制冰機(jī)(北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器有限公司)；凝膠成像儀(GE)； 電泳儀(Bio-Rad)；照相機(jī)(Canon)；旋轉(zhuǎn)混合儀(寧波新芝生物科技有限公司)；微波爐 (Galanz )； 體視顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)；超純水系統(tǒng)(Millipore)。

3 方法

3.1提取血管組織 8周齡的雄性p110δ-mutant(p110δ-/-)純合子小鼠20只為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)取同周齡的野生型(wild type，WT)小鼠20只為對(duì)照組。取出胸主動(dòng)脈血管，體視鏡下分離，固定包埋切片。

3.2免疫組化和免疫熒光檢測(cè) 從-80 ℃ 取出冰凍切片，室溫放置30 min，PBS洗滌。0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)10～15 min。冷卻至室溫，PBS洗滌。10% BSA封閉， 37 ℃ 放置1 h。傾去10% BSA，加Ⅰ抗，4 ℃過夜。PBS洗滌。擦干玻片，在組織上加Ⅱ抗，放置1 h。組織切片晾干，滴加中性樹膠，封片。

3.3免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白水平 將樣品與5×loading buffer混勻后100 ℃ 煮10 min，待用。配置分離膠和濃縮膠，常溫凝膠1 h。SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜250 mA、4 °C 90 min。將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中，室溫封閉1 h。TBST洗3次，每次5 min。加Ⅰ抗： 4 ℃孵育過夜。TBST室溫下脫色，加Ⅱ抗，室溫下孵育1 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min。配置發(fā)光液，等體積均勻混合溶液A和溶液B于洗膜盒，約2～3 mL。將膜倒扣于發(fā)光液上，反應(yīng)5 min后將膜包于保鮮膜中，注意避免產(chǎn)生皺折和氣泡，放入X光片夾中。在暗室中，將X光片放在膜上，壓片時(shí)間一般視不同抗體而定，顯影，定影。 凝膠圖像分析：將膠片進(jìn)行掃描或拍照，Quantity-One凝膠蛋白分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

3.4Real-time PCR檢測(cè)動(dòng)脈血管中MMPs的mRNA表達(dá) 動(dòng)脈血管總RNA提取采用Trizol法，以1 μg總RNA為模版逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以此cDNA為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)在LightCycler PCR 2.0儀器(Roche)中進(jìn)行?；蛳鄬?duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT法分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠基因型鑒定結(jié)果

3號(hào)鼠和6號(hào)鼠的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果可見602 bp和425 bp 條帶，為p110δ雜合子(基因型為p110δ+/-)，5號(hào)鼠和7、8、9號(hào)鼠的PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果僅見602 bp條帶，為p110δ純合子(基因型為p110δ-/-)，1、2號(hào)鼠和4號(hào)鼠的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果可見425 bp條帶，提示其為野生型(基因型為p110δ+/+)，見圖1。

Figure 1. PCR results of p110δ gene for identification of p110δ- mutant mice. Lanes 1, 2, 4 were p110δ+/+; Lanes 3， 6 were p110δ+/-; Lanes 5, 7, 8, 9 were p110δ-/-; M was the marker.

2 p110δ突變失活后血管的形態(tài)學(xué)染色

光鏡下觀察結(jié)合對(duì)各組動(dòng)脈血管直徑測(cè)量統(tǒng)計(jì)圖顯示p110δ突變失活后小鼠的主動(dòng)脈血管壁變薄，管腔變大。從HE染色、EVG染色和Gomori醛品紅染色中看出C57小鼠血管結(jié)構(gòu)較完整，未發(fā)生明顯變化，p110δ突變后，與正常對(duì)照組相比，血管壁的三層結(jié)構(gòu)部分破壞，彈性纖維出現(xiàn)較多的褶皺，見圖2。

3 p110δ突變失活后血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化

如圖3A所示，p110δ突變后，血管的內(nèi)皮細(xì)胞層不完整，這可能是由于內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡引起的；進(jìn)一步做了CD31和TUNEL的免疫熒光共定位，發(fā)現(xiàn)p110δ突變后血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡明顯增多，說明血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生了損傷。如圖3B所示，根據(jù)血管中凋亡細(xì)胞情況所做的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p110δ突變后血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡明顯高于C57組(P﹤0.05)。

Figure 2. The pathological characteristics of the thoracic aorta in p110δ-mutant mice. A, B: vascular wall become thinner and vessel diameter enlarged after inactivating mutation of p110δ; C: smooth muscle cell vacuolar degeneration, morphological disorders, elastic fiber local fracture. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs C57.

4 p110δ突變失活后血管平滑肌細(xì)胞、膠原的表達(dá)

如圖4所示，與C57小鼠相比，p110δ突變小鼠血管壁的α-SMA表達(dá)降低，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白Ⅰ和Ⅳ減少，說明血管壁結(jié)構(gòu)受到了嚴(yán)重破壞。

5 p110δ突變失活后血管基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的變化

p110δ突變后主要引起了MMP-3和MMP-9的mRNA表達(dá)上調(diào)，其中MMP-3上調(diào)尤為明顯；金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissue inhibitor of metalloprotei-nase 1，TIMP-1)和TIMP-2水平上調(diào)。p110δ突變失活后很可能由于影響了MMPs的水平而造成了血管壁結(jié)構(gòu)損傷，見圖5。

Figure 3. The vascular endothelial cell apoptosis and degeneration in p110δ-mutant.A: vascular endothelial cells (CD31) positioning with TUNEL; B: statistics of apoptotic rate in the blood vessels. Mean±SD.n=6.* P<0.05 vs C57.

Figure 4. The levels of collagen contents in vascular smooth muscle cells were reduced after inactivating mutation of p110δ. A: the IHC images of vascular paraffin section to observe the expression of α-SMA, collagenⅠ and collagen Ⅳ. Scale bar=20 μm. B: the protein levels extracted from fresh aorta determined by Western blotting. Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs C57.

討 論

PI3K是一種具有脂激酶活性的酶類家族，共分為3 大類。其中I 類的PI3K是由催化亞基(p110)和調(diào)節(jié)亞基(p85/p87/p101)構(gòu)成的異源二聚體，催化亞基p110 又有4種亞型p110α、p110β、p110γ和p110δ。p110 亞基的共同特點(diǎn)是磷酸化細(xì)胞膜的磷脂酰肌醇，產(chǎn)生第二信使PtdIns(3,4,5)P3，進(jìn)而募集并激活蛋白激酶B和其它諸如GSK3、Raf 等的信號(hào)分子，從而廣泛參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫調(diào)節(jié)等作用。不同的p110 亞基組織分布差異很大，其中p110δ主要在白細(xì)胞中表達(dá)，參與T、B 淋巴細(xì)胞的分化、成熟以及中性粒細(xì)胞的化學(xué)趨化過程，因此p110δ一直被認(rèn)為是白細(xì)胞中調(diào)控免疫反應(yīng)的重要分子之一[7]。近年來的研究還顯示，p110δ在血管組織中也有一定的表達(dá)，并且參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的L-Ca2+電流、內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的黏附以及高血壓進(jìn)程中血管的收縮反應(yīng)[8]。這些結(jié)果提示可能p110δ在血管損傷過程中也有重要意義，但具體的作用和機(jī)制不明。

血管重構(gòu)的病理機(jī)制與血管壁慢性炎癥、MMPs活化以及氧化應(yīng)激等密切相關(guān)。MMPs是一組能特異降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶家族，主要降解血管壁的彈力纖維和膠原蛋白，破壞血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，在組織重構(gòu)中起重要作用[9]。 MMPs/TIMPs 的動(dòng)態(tài)平衡維持著血管的正常形態(tài)和功能，TIMP 作為MMP 的抑制因子, 其水平隨MMP 的變化而變化[10]。MMPs的表達(dá)調(diào)控主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平[11]，因此我們做了real-time-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMPs和TIMPs的mRNA水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果MMP-3、MMP-9的mRNA表達(dá)上調(diào)，其中MMP-3上調(diào)尤為明顯；TIMP-1、 TIMP-2水平上調(diào)。MMP-3能夠降解膠原Ⅳ和彈力纖維，也可以激活其它蛋白酶如MMP-9，增強(qiáng)MMP-9的降解Ⅳ型膠原的能力，介導(dǎo)平滑肌遷移和血管內(nèi)膜新生[12]，可見MMP-3在血管重構(gòu)中有著關(guān)鍵作用。MMP-3和MMP-9水平升高，很可能是誘發(fā)血管壁彈力纖維降解和膠原蛋白含量降低的重要原因。MMP-2降解基底膜的主要成分膠原Ⅳ，在血管重構(gòu)中起到的作用已得到證實(shí)， MMP-14能活化MMP-2，并與TIMP-2相互作用[13]，3者如何共同作用對(duì)血管結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響還需要進(jìn)一步研究。而TIMP 通過與MMPs 活性形式結(jié)合的方式而抑制其作用, MMPs 和TIMPs 之間的平衡是MMP 活性一個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)[14]。所有的MMPs一旦被活化都將受到TIMP的抑制作用，但是MMP-2和MMP-9前體和TIMPs結(jié)合反而有利于前體的活化[15]，能協(xié)同參與降解血管壁細(xì)胞外基質(zhì)。

Figure 5. The expression of Matrix metalloproteinase (MMPs) was up-regulated after inactivating mutation of p110δ.Mean±SD.n = 6.*P<0.05，**P<0.01 vs C57.

研究表明，血管平滑肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞是血管重構(gòu)中MMPs的主要來源。已有文獻(xiàn)表明MMP-2和MMP-9可通過潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β， TGF-β)復(fù)合物的蛋白水解激活TGF-β[16]，MMPs水平升高可能通過升高TGF-β水平誘發(fā)血管壁炎癥，影響血管重構(gòu)。轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1)參與調(diào)節(jié)炎癥因子在血管重構(gòu)中的作用,在細(xì)胞增殖和炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)AP-1可在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中對(duì)各種促動(dòng)脈粥樣硬化炎癥因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,從而可以對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的形成及進(jìn)展過程進(jìn)行調(diào)控。磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路與其主要的下游效應(yīng)分子蛋白激酶B參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡以及遷徙等，可通過調(diào)節(jié)AP-1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到特定的啟動(dòng)子或促進(jìn)子上進(jìn)而提高炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄活性，最終導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，因而PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在機(jī)體炎癥反應(yīng)調(diào)控過程中起著極其重要作用。然而目前關(guān)于PI3K/Akt/AP-1通路在血管平滑肌細(xì)胞信號(hào)的表達(dá)，以及PI3K/Akt通路對(duì)血管炎癥作用的研究較少。MMP-2、TIMP-1 基因上有AP-1 的結(jié)合位點(diǎn)，TGF-β1、TNF-α基因中也含有AP-1 的結(jié)合位點(diǎn)[17-18], AP-1 失活很可能影響TGF-β1、TNF-α的合成及其功能, 間接調(diào)節(jié)MMP-2 的分泌與活化。在本實(shí)驗(yàn)中，p110δ失活很可能通過調(diào)控PI3K/Akt/AP-1信號(hào)通路影響了MMPs的表達(dá)，進(jìn)一步影響了主動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)和功能，此猜測(cè)還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，p110δ突變失活后小鼠動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)異常，可觀察到血管中的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，細(xì)胞空泡變性，彈力纖維局部斷裂，免疫組化染色發(fā)現(xiàn)α-SMA在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)降低，膠原含量減少，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p110δ突變失活后上調(diào)了MMPs的表達(dá)，我們推斷p110δ突變失活后很可能通過上調(diào)MMPs的蛋白表達(dá)，降解了血管中的細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而損傷血管結(jié)構(gòu)，但是如何上調(diào)的，還在探索當(dāng)中。以上p110δ突變失活通過上調(diào)MMPs引發(fā)血管壁損傷的研究，為我們對(duì)人類心血管疾病的研究提供了一條新線索，通過進(jìn)一步研究p110δ對(duì)人類心血管疾病的影響，可以檢測(cè)其是否能成為診斷人類心血管疾病的指標(biāo)之一。

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